CN112458208A

CN112458208A - 检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112458208A
Application number: CN202011388922.6A
Authority: CN
Inventors: 崔贝贝; 杨思佳; 李霆; 张现东; 应天翼; 余涛; 李岩松
Original assignee: Beijing San'an Xinte Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing San'an Xinte Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112458208B

Abstract

本发明涉及针对牛结节性皮肤病病毒的特异性引物组合物，还涉及检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒以及方法。本发明针对牛结节性皮肤病病毒的保守序列，设计了至少两组特异性引物对，进一步建立了检测试剂盒和方法。本发明提供的试剂盒和方法灵敏度高，扩增时间更短，效率更高，还能够鉴定样品中含有牛结节性皮肤病病毒是来自于疫苗免疫还是自然感染，是对现有牛结节性皮肤病病毒检测方法的有力补充。

Description

检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及动物病毒分子生物学检测方法领域，具体涉及牛结节性皮肤病的核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，是由牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskin disease virus，LSDV)引起的一种牛的痘病，属于痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科山羊痘病毒属，与牛痘病毒并不同属。该病的临床特征包括发热，皮肤、粘膜和内脏器官出现结节，机体消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿，部分病例会死亡。该病还能够引起产奶量暂时性下降，引起公牛暂时或永久性不育，损坏皮张，甚至因为继发细菌感染而导致动物死亡，从而对经济造成严重的影响。该病的发病率在5％～45％之间，病死率达10％，不感染人。该病是世界动物卫生组织(OIE)的通报性疾病(OIE 2014年版名录)，是我国《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病，澳大利亚(澳大利亚2013年版名录)、加拿大(加拿大2014年版名录)、美国(美国国家动物卫生通报系统疾病名录)、欧盟(欧盟动物疫情通报系统疾病名录)的通报性疾病。2010年以来，确认在此期间曾发生或正在发生该病的国家多达43个，分布于非亚欧三大洲，其中非洲疫情尤为严重。2019年8月12日，经中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心确诊新疆维吾尔自治区伊犁州发生LSD疫情，这是我国首次确诊发生该病。截止2020年7月，全国已有福建长汀、江西赣州、广东潮州、安徽黄山、浙江金华等地确诊发生LSD疫情，给当地造成巨大的经济损失。

LSDV常用的检测方法为病毒分离鉴定、血清学检测方法以及分子生物学检测方法。病毒分离鉴定周期长且需要在一定级别生物安全实验室进行，病毒中和试验是特异性最高的血清学检测方法，但由于动物机体对LSD病毒感染主要表现为细胞免疫应答，仅产生低水平的中和抗体，因此该方法敏感性欠佳。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过比对分析GenBank上公布的LSDV全基因组序列，找到LSDV的保守基因，然后针对该保守基因设计了特异性引物和探针，进一步建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒和方法。本发明提供的试剂盒和方法灵敏度高，扩增时间更短，效率更高，是对现有LSDV检测方法的有力补充。

第一方面，本发明提供针对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的特异性引物组合物。

本发明所述特异性引物组合物包含至少两对特异性引物对；其中一对特异性引物对的扩增目的基因具有如SEQ ID NO:1的序列，另一对特异性引物对的扩增目的基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。

如SEQ ID NO:1所示的序列在本发明中又称为LSDV-LD126基因。

如SEQ ID NO:2所示的序列在本发明中又称为LSDV001基因。

在一些实施方案中，针对具有如SEQ ID NO:1所示序列的目的基因的引物对包括：具有如SEQ ID NO:3所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:4所示序列的反向引物。

在一些实施方案中，针对具有如SEQ ID NO:2所示序列的目的基因的引物对包括：具有如SEQ ID NO:6所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:7所示序列的反向引物。

第二方面，本发明提供与上文所述特异性引物组合物配合使用的探针。

在一些实施方案中，与以具有如SEQ ID NO:1所示序列为扩增目的基因的特异性引物对配合使用的探针具有如SEQ ID NO:5所示的序列。

在一些实施方案中，与以具有如SEQ ID NO:2所示序列为扩增目的基因的特异性引物对配合使用的探针具有如SEQ ID NO:8所示的序列。

第三方面，本发明提供检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，所述试剂盒中包含上文所述特异性引物组合物，优选还包含所述探针。

在一些实施方案中，在针对任意一个目的基因的扩增反应体系中，所述正向引物和所述反向引物各自占反应体系的总浓度分别为0.2μM～0.4μM，具体为0.2μM，0.3μM或0.4μM。

在一些实施方案中，在针对任意一个目的基因的扩增反应体系中，所述探针占反应体系的总浓度为0.2μM～0.4μM，具体为0.2μM，0.3μM或0.4μM。

在一些实施方案中，所述试剂盒为实时定量PCR试剂盒，优选为实时定量荧光PCR试剂盒。

在一些实施方案中，所述试剂盒中包含DNA聚合酶、染料、特异性引物对、探针、模板DNA和水。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有的针对任意一个目的基因的每20μL反应体系中，包含：DNA聚合酶(2×)10μL，荧光染料0.1μL，浓度为10μM的正向引物0.8μL，浓度为10μM的反向引物0.8μL，浓度为10μM的探针0.4μL，模板DNA 1μL，余量为水。

第四方面，本发明提供上文所述特异性引物组合物、探针和/或试剂盒在检测牛结节性皮肤病病毒中的应用。

在一些实施方案中，上文所述特异性引物组合物、探针和/或试剂盒应用于检测样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒。

在一些实施方案中，上文所述特异性引物组合物、探针和/或试剂盒应用于鉴定样品中的牛结节性皮肤病病毒是来自于疫苗免疫还是自然感染。

第五方面，本发明提供利用上文所述特异性引物组合物、探针和/或试剂盒检测样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒的方法。

采用本发明提供的方法进行检测，当SEQ ID NO:1所示序列和/或SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线被检测到，则判断样品中含有牛结节性皮肤病病毒；当SEQ ID NO:1所示序列、SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线均未被检测到，则判断样品中不含有牛结节性皮肤病病毒。

在一些实施方案中，在所述方法采用的针对任意一个目的基因的扩增反应体系中，所述正向引物和所述反向引物的浓度分别为0.2μM～0.4μM，具体为0.2μM，0.3μM或0.4μM。

在一些实施方案中，所述方法采用的针对任意一个目的基因的扩增反应体系中，所述探针的浓度为0.2μM～0.4μM，具体为0.2μM，0.3μM或0.4μM。

在一些实施方案中，所述方法为实时定量PCR方法，优选为实时定量荧光PCR方法。

在一些实施方案中，所述方法采用的反应体系包含：DNA聚合酶、染料、特异性引物对、探针、模板DNA和水。

在一些实施方案中，所述方法采用的针对任意一个目的基因的每20μL反应体系中，包含：DNA聚合酶(2×)10μL，荧光染料0.1μL，浓度为10μM的正向引物0.8μL，浓度为10μM的反向引物0.8μL，浓度为10μM的探针0.4μL，模板DNA 1μL，余量为水。

在一些实施方案中，所述方法采用的退火温度为60℃～61℃，具体可以为60℃、60.5℃或61℃。

在一些实施方案中，所述方法包括：以95℃、1s，60℃～61℃、30s为一个循环，扩增35～45个循环，优选扩增40个循环。

在一些实施方案中，所述方法在进行所述扩增前，先在95℃下预变性1～3min，优选为2min。

本发明提供的方法灵敏度高，扩增时间更短，效率更高，是对现有牛结节性皮肤病病毒检测方法的有力补充。

第六方面，本发明提供利用上文所述特异性引物组合物、探针和/或试剂盒鉴定样品中的牛结节性皮肤病病毒是来自于疫苗免疫还是自然感染的方法。

采用本发明提供的方法进行鉴定，当SEQ ID NO:1所示序列和SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线均被检测到，则判断样品中含有牛结节性皮肤病病毒且该病毒来自于自然感染而非疫苗免疫；当SEQ ID NO:1所示序列的典型扩增曲线被检测到且SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线未被检测到，则判断样品中含有牛结节性皮肤病病毒且该病毒来自于疫苗免疫而非自然感染。

由于LSD的毒株和疫苗株基因组的同源性高，对鉴别检测带来很大困难，解决动物因接种疫苗而出现的误诊、快速对LSDV进行检测成为目前研究工作中需要重点攻克的难题。本发明通过比对和分析LSD毒株和疫苗株的核酸序列，找到毒株和疫苗株的差异基因，即LSDV-LD126基因，基于该差异的核酸序列设计的特异性引物和探针以及TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，能够在LSD疫病确诊的同时，进一步明确该病牛是由LSDV毒株感染引起还是疫苗株免疫所致，对于LSD疫病的防控提供更多的数据支撑，且丰富了现有的LSDV检测方法。

附图说明

图1为LSDV-LD126熔解曲线；

图2为LSDV001熔解曲线；

图3为LSDV-LD126基因退火温度优化结果；

图4为LSDV001基因退火温度优化结果；

图5为LSDV-LD126基因引物浓度优化结果；

图6为LSDV001基因引物浓度优化结果；

图7为LSDV-LD126基因探针浓度优化结果；

图8为LSDV001基因探针浓度优化结果；

图9为LSDV-LD126基因扩增曲线；

图10为LSDV-LD126基因扩增的标准曲线；

图11为LSDV001基因扩增曲线；

图12为LSDV001基因扩增的标准曲线；

图13为LSDV-LD126基因不同基因组扩增曲线；其中，1、LSDV-LD126重组质粒，2、OBP-LD126重组质粒，3、GPV-LD126重组质粒，4、山羊痘病毒基因组；5、伪狂犬病毒基因组，6、羊败血性链球菌基因组，7、牛羊口蹄疫病毒基因组，8、阴性对照；

图14为LSDV001基因不同基因组扩增曲线；其中，1、LSDV001重组质粒，2、伪狂犬病毒基因组，3、羊败血性链球菌基因组，4、牛羊口蹄疫病毒基因组，5、阴性对照；

图15为LSDV-LD126基因模拟临床样本扩增曲线；其中，1、LSDV-LD126阳性重组质粒，2～5、模拟临床样品，6、阴性对照；

图16为LSDV001基因模拟临床样本扩增曲线；其中，1、LSDV001阳性重组质粒，2～5、模拟临床样品，6、阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：阳性模板的制备

阳性克隆质粒由北京六合华大基因有限公司合成并测序，测序结果分别与GenBank上公布的LSDV-LD126、LSDV001基因序列比对无误后，采用全自动酶标仪测定质粒的浓度和纯度，分别命名为LSDV-LD126、LSDV001。

LSDV-LD126基因序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：

ATGGGAATAGTATCTGTTGTATACGTCGTAGTACCATTTTCATTTATTGTTTTACTTTCATATATATTTTTTGAATACAAAAATGTTATTAAAAAAATGTTATTTAAAAAAAAAGGGAAAAATCAAAAAAGAACATGTGTTAGACTTAATTCAATCACTTATTCAACAAATAGTATAAAATCCACTATATCAGAAAGTACTTGGTCAAATTGTAGTAATGATACATTTGTAAAAAATGAAAAAGAAAATGTAGAGATTGTTGAAATTAAACGTTGTGATAATGAATTAATTGAAGAAAGTAATAATAACGTTTTAGAAAATGGATGTACCACAAATACAGGTGAAGAAAATTTAATTTGGGACGATAACAACGTTTATGATTTACCACCTAATGATAGTGTTTATGATTTACCACCTAACGATTTGAGTTGTAACAACGATTGTGTTTATACATTACCGGATGACAATGTTTCAAACATAGAGGAAAAAATAACTAAGTTAATACACAAAAATAATTCCGAGTCAAACTATTATAATTGTTGTTAA

LSDV001基因序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：

TTAAACCTGTAAATGGATACTTTTTTCATTCAATCTTTTAAGTCTAATTATTAGTGCTGATTTCACTAGCGAAATATCGTTGTCAGAAACGAGGTCTCGAAGCAATACCAACACTTTCACAGAAGAACAAGTTGGAGATGATTCACCACCCCAATATTCTGCTGCTCTTGCTAAAATGCCAATCACTGCACATGATTCCCTAATGTAATTTTCTTTTTTTAACATGGAATTAATCATAATTTTTGATTGTTCAAATCCAATTTTAGAATCCAAAAACATGTTTTTGACAAAAGCTGTTAGATCATTTCCAAATACAAGTGAGGCATCCTTTTTGAAAGATTCAAAAACTAAGAACACCTTTCCAGCAACCTCCCTGGAGGAAAATGCCAGTGATGACCAAAACAAATAATCAGAGATGGCGGTTGTGATATCATCATCATCTGAAAAGTTGTTTCGGTAGACATAGTTGCCGGAAGACAT

将合成的LSDV-LD126标准阳性质粒，通过紫外分光光度计检测质量浓度为43.65ng/μL，纯度为1.89，根据公式“质粒拷贝数(copies/μL)＝(质粒浓度×10^-9×稀释倍数×6.02×10²³)/(660道尔顿/碱基×碱基数)”，将标准质粒浓度换算成拷贝数为1.95×10¹⁰拷贝/μL。将合成的LSDV001标准阳性质粒，通过紫外分光光度计检测质量浓度为97.38ng/μL，纯度为1.98，采用相同方法换算成拷贝数为1.94×10¹⁰拷贝/μL。

同时，通过Blast比对分析，分别合成LSDV疫苗株OBP对应的LD126基因，以及山羊痘病毒(GPV)株对应的LD126基因，分别标记为OBP-LD126和GPV-LD126，-20℃保存备用。

实施例2：引物与探针的设计与合成

根据GenBank上发表的LSDV全基因组序列(AF325528.1)，利用DNAMan软件对基因组序列进行分析比对，针对基因组序列保守区域，设计引物和探针，序列详见表1。引物和探针均由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。

表1：引物和探针

实施例3：引物特异性鉴定

LSDV-LD126和LSDV001阳性重组质粒按照QuantiNova SYBR Green PCR Kit(CatNo.208052)说明书提供的反应体系，即Premix Taq(2×)混合物10μL，QN ROX ReferenceDye 0.1μL，上游引物和下游引物各1.4μL(0.7μM)，模板DNA 1μL，用ddH₂O补充至20μL，进行扩增。扩增条件为预变性95℃、2min；以95℃、5s，60℃、10s，扩增40个循环。扩增结束后继续做熔解曲线，95℃、15s，60℃、1min；95℃、30s，60℃、15s。验证引物的特异性。

扩增结果显示，LD126基因的熔解曲线(图1)在Tm值为73.79℃处有单一峰，且LSDV001基因的熔解曲线(图2)在Tm为75.79℃处均只有单一峰。由以上结果可知，LSDV-LD126和LSDV001基因的引物均无非特异性扩增。

实施例4：反应条件的优化

采用表2所示反应体系，分别对退火温度、引物及探针浓度进行优化。退火温度设置为56℃、58℃、59℃、60℃、61℃、63℃，6个温度梯度进行优化；引物浓度分别按照0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μM，探针浓度依次从0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μM，选取优化好的退火温度分别对探针和引物浓度进行优化。选取最低的Ct值和最高的ΔR(荧光强度增加值)，如果Ct值和ΔR不一致时，则先考虑Ct值。

循环条件为：预变性95℃、2min；以95℃、1s，60℃、30s，扩增40个循环。

表2 Real-time PCR反应体系

关于退火温度

通过Tm值的分析，分别选取56、58、59、60、61、63℃，6个不同的退火温度进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，通过对不同退火温度扩增曲线的Ct值进行比较，结果显示60℃时的Ct值为22.23，是9个退火温度中的最小值(图3)，因此退火温度为60℃时LSDV-LD126阳性标准质粒的扩增效率最高。而LSDV001是在退火温度为61℃时20.89的Ct值为最低值如图4所示。

关于引物浓度

通过对0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μM等5个不同浓度的上下游引物按照QuantiNovaProbe PCR试剂盒说明书提供的反应体系进行定量PCR扩增。对得到的扩增曲线，分别统计Ct值和ΔR值，在上下游引物浓度为0.3μM时LSDV-LD126阳性重组质粒的扩增效率最高(图5)。同理，LSDV001上下游引物的最佳浓度为0.3μM(图6)。

关于探针浓度

探针浓度按照0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μM，稀释5个浓度梯度。根据QuantiNovaProbe PCR试剂盒说明书提供的反应体系，在ABI StepOne Plus仪器上扩增，得到如图7所示的扩增曲线。依据最低的CT值和最高的ΔR值，LSDV LD126基因探针的最佳浓度为0.3μM。同理，LSDV001基因探针的最佳浓度为0.3μM，如图8所示。

实施例5：标准曲线的建立

对构建的标准阳性质粒LSDV-LD126、LSDV001分别进行10倍倍比稀释，LSDV-LD126选取1.95×10⁰～1.95×10⁷拷贝/μL 8个浓度梯度作为模板，LSDV001选取1.94×10⁰～1.94×10⁷拷贝/μL 8个浓度梯度作为模板，每个稀释度分别做3个重复，ddH₂O为阴性对照，反应体系为20μL，按照表3优化后的方法，进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。

表3 Real-time PCR优化后的反应体系

实施例6：重复性试验

将不同浓度的重组质粒标准品作为模板，每个样品进行3个孔的重复，按照建立的检测方法进行组内试验，对结果进行统计学分析；对不同时间稀释的样品进行3次检测，按照建立的检测方法进行组间试验，对结果进行统计学分析。根据变异系数判断检测方法的可重复性，结果如表4、表5所示。

表4 LSDV-LD126荧光定量PCR重复性试验

表5 LSDV001荧光定量PCR重复性试验

实施例7：灵敏性试验

对构建的LSDV-LD126和LSDV001阳性重组质粒分别进行10倍倍比稀释，LSDV-LD126选取1.95×10⁰～1.95×10⁷拷贝/μL 8个稀释度，LSDV001选取1.94×10⁰～1.94×10⁷拷贝/μL 8个稀释度，根据已经建立的TaqMan实时荧光定量PCR的反应体系和反应参数进行相应的PCR扩增，通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数，并最终以Ct值为纵坐标，两种基因拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线，对整个PCR体系的灵敏性进行评价。

从以不同拷贝数的重组质粒为模板的检测结果可看出，该基因的扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀。

基于LSDV-LD126基因qPCR方法最低检测量是1.95个拷贝(图9)，扩增效率是99.26％，回归方程为Y＝-3.34X+12.797，r²＝0.999(图10)。基于LSDV001基因qPCR方法最低检测量是1.94个拷贝(图11)，扩增效率是102.397％，回归方程为Y＝-3.266X+14.096，r²＝0.999(图12)。

实施例8：实时荧光定量PCR方法的特异性检测

采用优化的TaqMan实时荧光定量PCR反应体系，分别以LSDV-LD126、LSDV001的重组质粒DNA作为标准的阳性对照。

OBP-LD126，GPV-LD126合成的质粒DNA，山羊痘疫苗株、牛羊口蹄疫伪狂犬病毒、羊败血性链球菌基因组模板DNA作为其他毒株模板，无菌水作为阴性对照；使用StepOne Plus实时荧光定量PCR仪进行扩增，以验证所建立诊断方法的特异性。

对山羊痘病毒、伪狂犬病毒、羊败血性链球菌以及牛羊口蹄疫病毒等基因组和OBP-LD126，GPV-LD126，LSDV-LD126，LSDV001重组质粒同时进行检测，结果表明，只有LSDV-LD126阳性重组质粒可产生特异性荧光曲线，其余皆为阴性，证明基于LSDV-LD126基因设计的引物和探针均有较强的特异性(图13)。

对伪狂犬病毒、羊败血性链球菌以及牛羊口蹄疫病毒等基因组和LSDV001阳性重组质粒同时进行检测，结果表明，只有LSDV001阳性重组质粒可产生特异性荧光曲线，其余皆为阴性，证明基于LSDV001基因设计的引物和探针均有较强的特异性(图14)。

实施例9：模拟临床样本的检测

称取牛肉0.1g加入提前制备好的LSDV-LD126阳性重组质粒，混匀后提取核酸。LSDV-LD126阳性重组质粒作为阳性对照，采用建立的LSDV-LD126荧光定量方法对模拟临床样品进行检测。

结果如图15所示扩增曲线，可检测到较强的信号，说明该方法可应用于临床样品的检测。

称取牛肉0.1g加入与LSDV-LD126相同浓度相同体积的LSDV001阳性重组质粒，重复以上操作。以LSDV001阳性重组质粒作为阳性对照，采用建立的LSDV001荧光定量方法对模拟临床样品进行检测。

结果如图16所示扩增曲线，可检测到较强的信号，说明该方法可应用于临床样品的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京三安新特生物科技有限公司

<120> 检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及方法

<130> RYP2010934.8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 546

<212> DNA

<213> lumpy skin disease virus

<400> 1

atgggaatag tatctgttgt atacgtcgta gtaccatttt catttattgt tttactttca 60

tatatatttt ttgaatacaa aaatgttatt aaaaaaatgt tatttaaaaa aaaagggaaa 120

aatcaaaaaa gaacatgtgt tagacttaat tcaatcactt attcaacaaa tagtataaaa 180

tccactatat cagaaagtac ttggtcaaat tgtagtaatg atacatttgt aaaaaatgaa 240

aaagaaaatg tagagattgt tgaaattaaa cgttgtgata atgaattaat tgaagaaagt 300

aataataacg ttttagaaaa tggatgtacc acaaatacag gtgaagaaaa tttaatttgg 360

gacgataaca acgtttatga tttaccacct aatgatagtg tttatgattt accacctaac 420

gatttgagtt gtaacaacga ttgtgtttat acattaccgg atgacaatgt ttcaaacata 480

gaggaaaaaa taactaagtt aatacacaaa aataattccg agtcaaacta ttataattgt 540

tgttaa 546

<210> 2

<211> 480

<212> DNA

<213> lumpy skin disease virus

<400> 2

ttaaacctgt aaatggatac ttttttcatt caatctttta agtctaatta ttagtgctga 60

tttcactagc gaaatatcgt tgtcagaaac gaggtctcga agcaatacca acactttcac 120

agaagaacaa gttggagatg attcaccacc ccaatattct gctgctcttg ctaaaatgcc 180

aatcactgca catgattccc taatgtaatt ttcttttttt aacatggaat taatcataat 240

ttttgattgt tcaaatccaa ttttagaatc caaaaacatg tttttgacaa aagctgttag 300

atcatttcca aatacaagtg aggcatcctt tttgaaagat tcaaaaacta agaacacctt 360

tccagcaacc tccctggagg aaaatgccag tgatgaccaa aacaaataat cagagatggc 420

ggttgtgata tcatcatcat ctgaaaagtt gtttcggtag acatagttgc cggaagacat 480

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LSDV-LD126-F

<400> 3

agaaaattta atttgggacg ataac 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LSDV-LD126-R

<400> 4

caatcgttgt tacaactcaa atcg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LSDV-LD126-P

<400> 5

ttatgattta ccacctaatg atag 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LSDV001-F

<400> 6

gaagcaatac caacactttc acaga 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LSDV001-R

<400> 7

gcattttagc aagagcagca ga 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LSDV001-P

<400> 8

aacaagttgg agatgattca c 21

Claims

1.针对牛结节性皮肤病病毒的特异性引物组合物，其特征在于，包含至少两对特异性引物对；其中一对特异性引物对的扩增目的基因具有如SEQ ID NO:1的序列，另一对特异性引物对的扩增目的基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。

2.根据权利要求1所述的特异性引物组合物，其特征在于，以SEQ ID NO:1所示序列为扩增目的基因的引物对包括：具有如SEQ ID NO:3所示序列的正向引物和具有如SEQ IDNO:4所示序列的反向引物；

和/或，以SEQ ID NO:2所示序列为扩增目的基因的引物对包括：具有如SEQ ID NO:6所示序列的正向引物和具有如SEQ ID NO:7所示序列的反向引物。

3.与权利要求1或2所述特异性引物组合物配合使用的探针；

优选地，与以SEQ ID NO:1所示序列为扩增目的基因的引物对配合使用的探针具有如SEQ ID NO:5所示的序列，和/或，与以SEQ ID NO:2所示序列为扩增目的基因的引物对配合使用的探针具有如SEQ ID NO:8所示的序列。

4.检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述特异性引物组合物，优选还包含权利要求3所述探针；

优选地，所述试剂盒为实时定量PCR试剂盒，更优选为实时定量荧光PCR试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，引物或探针在反应体系中的浓度为0.2μM～0.4μM。

6.权利要求所述1或2所述特异性引物组合物、权利要求3所述探针和/或权利要求4或5所述试剂盒在检测牛结节性皮肤病病毒中的应用；

优选在检测样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒或者鉴定样品中的牛结节性皮肤病病毒是来自于疫苗免疫还是自然感染中的应用。

7.利用权利要求所述1或2所述特异性引物组合物、权利要求3所述探针和/或权利要求4或5所述试剂盒检测样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒的方法；

优选地，所述方法为实时定量PCR方法，更优选为实时定量荧光PCR方法；

更优选地，所述方法采用的反应体系中，引物或探针的浓度为0.2μM～0.4μM；和/或，所述实时定量PCR方法采用的退火温度为60℃～61℃；和/或，所述方法包括：以95℃、1s，60℃～61℃、30s为一个循环，扩增35～45个循环。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当SEQ ID NO:1所示序列和/或SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线被检测到，则判断样品中含有牛结节性皮肤病病毒；

当SEQ ID NO:1所示序列、SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线均未被检测到，则判断样品中不含有牛结节性皮肤病病毒。

9.利用权利要求所述1或2所述特异性引物组合物、权利要求3所述探针和/或权利要求4或5所述试剂盒鉴定样品中的牛结节性皮肤病病毒是来自于疫苗免疫还是自然感染的方法；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当SEQ ID NO:1所示序列和SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线均被检测到，则判断样品中含有牛结节性皮肤病病毒且该病毒来自于自然感染而非疫苗免疫；

当SEQ ID NO:1所示序列的典型扩增曲线被检测到且SEQ ID NO:2所示序列的典型扩增曲线未被检测到，则判断样品中含有牛结节性皮肤病病毒且该病毒来自于疫苗免疫而非自然感染。