CN105603123B - 快速检测猪细小病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 - Google Patents

快速检测猪细小病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测猪细小病毒(PPV)的实时荧光RPA(PPV real‑time RPA)试剂盒及其用途，还公开了一种快速检测PPV的试纸条RPA(LFS RPA)试剂盒及其用途。该两种试剂盒分别包括SEQ ID NO.1及2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。实验证明本发明的两个试剂盒的敏感性均为102拷贝/反应，并均只能特异性检测PPV。分别用本发明的两个试剂盒检测PPV疑似样品，结果表明这两个试剂盒的检测结果与qPCR均具有很高的符合度。因此，本发明的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测PPV，为PPV的鉴别诊断提供了有效技术手段。

Description

快速检测猪细小病毒的实时荧光RPA试剂盒、试纸条RPA试剂 盒及其用途
技术领域
本发明涉及一种检测猪细小病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反应的用于快速检测猪细小病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二者在快速检测猪细小病毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。
背景技术
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。
英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的核酸扩增产品能够在15分钟内，37℃-42℃之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟的为进行实时监控的体系(如
Figure BDA0000913951320000012
exo试剂盒，real-time RPA)以及基于试纸条的终点检测(
Figure BDA0000913951320000013
nfo试剂盒，Recombinase Polymerase Amplification Assaycombined with lateral flow test，LFS RPA)。
实时荧光RPA(real-time RPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。
对于试纸条RPA(LFS RPA)试验而言，只要温度能控制在37-42℃之间就行，比如可以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试纸条LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。
与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增(strand displacement amplification,BectonDickson,USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。
猪细小病毒(porcine parvovirus virus，PPV)是细小病毒科，细小病毒亚科，细小病毒属的成员。该病毒是目前动物病毒中最小最简单的一类单链线状DNA病毒。猪细小病毒病是由细小病毒引起的一种以母猪繁殖障碍为主要特征的病毒性传染病。怀孕母猪早期感染猪细小病毒时容易引起流产、胚胎死亡、胎儿木乃伊化等特征。该病毒感染仔猪时会引起仔猪的皮炎和腹泻症状。我国已经在北京、上海、甘肃、河南、黑龙江、四川等多地发生该病的流行。随着大型集约化养猪场的大量出现，该病呈现上升趋势并给养猪业造成巨大的经济损失。因此，建立一种快速、简单、特异、敏感的检测方法来检测PPV对于该病的防控起着关键的作用。
Chienjin Huang等(Multiplex PCR for rapid detection of pseudorabiesvirus,porcine parvovirus and porcine circoviruses,Huang,C.,et al.,VeterinaryMicrobiology 101(2004)209–214)建立了一种能够同时检测猪伪狂犬病病毒，猪细小病毒和猪圆环病毒的多重PCR检测方法。该方法的缺点在于需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，而且需要较长的试验时间(大约2.5h)，此外由于需要跑核酸电泳胶，因此有污染的可能性。
Lan-lan Zheng等(Simultaneous detection of porcine parvovirus andporcine circovirus type 2by duplex real-time PCR and amplicon melting curveanalysis using SYBR Green.Zheng,L.L.,et al.,J Virol Methods,2013.187(1):p.15-9.)公开了一种以基于SYBR Green的检测猪细小病毒和猪圆环病毒2型的双重实时荧光PCR检测方法。该方法的缺点在于需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，而且需要较长的试验时间(大约1.5h)。此外由于SYBR Green I非特异性结合所有的双链DNA，因此，该方法的特异性相对较差。
本发明针对PPV的NS1基因，建立并评估了基于荧光探针的RPA(real-time RPA)检测试剂盒以及基于试纸条的LFS RPA检测试剂盒以实现快速检测PPV的目的，据我们所知，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测PPV。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定猪细小病毒的检测方法及试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人针对PPV的NS1基因设计引物和探针。同时通过对来自于GenBank中的KF429255.1,JX871883.1,JN872448.1,EU790642.1,EU790641.1,L23427.1,M38367.1,M32787.1,D00623.1,KF429254.1,JQ710893.1,KF429252.1,JQ710888.1和AY502114.1的NS1基因同源序列进行比对分析，进一步确定了猪细小病毒NS1基因的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪细小病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终将其中一对能够产生最强的扩增信号的引物对与探针组合应用到本发明中。针对实时荧光RPA(real-time RPA)与试纸条RPA(LFS RPA，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的不同检测特点，本发明分别设计了用于实时荧光RPA以及试纸条RPA检测的引物和探针序列，该两种试剂盒针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。
本发明一种用于快速检测猪细小病毒的实时荧光RPA(real-time RPA)检测试剂盒，包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-AAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAAC
-(FAM-dT)-G-THF-A-(BHQ1-dT)-GGCCACTAATATGTG-P-3’(SEQ ID NO.3所示)。
其中，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止链的延伸。
在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
使用本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒检测猪细小病毒，优选的，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
更优选的，扩增反应在温度设定为38℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
对本发明的实时荧光RPA(real-time RPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验，灵敏度试验结果表明使用该试剂盒检测猪细小病毒的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表明，使用该试剂盒分别检测猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、2型猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒，只有PPV能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，说明该试剂盒具有很好的特异性。随后我们用猪细小病毒混合组织样品(n＝19)进一步验证了该试剂盒的检测准确性，试验数据表明：其与qPCR检测结果具有很高的符合度。
因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测猪细小病毒试剂中的用途。
本发明还提出了一种用于快速检测猪细小病毒的试纸条RPA(LFS RPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)，以及有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-biotin-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-FAM-ACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTG
-THF-ATGGCCACTAATATGTG-P-3’(SEQ ID NO.4所示)。
其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，P表示磷酸，用于阻止链的延伸。
在本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
使用本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒检测猪细小病毒，优选的，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.3μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.6μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的水浴锅中进行，反应时间为10min-30min，结束后使用侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)对结果进行检测。
更优选的，扩增反应在温度设定为38℃的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
对本发明的试纸条RPA(LFS RPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验，灵敏度试验结果表明使用该试剂盒检测猪细小病毒的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表明，使用该试剂盒分别检测猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、2型猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒，只有PPV能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，说明该试剂盒具有很好的特异性。随后我们用猪细小病毒混合组织样品(n＝19)进一步验证了该试剂盒的检测准确性，试验数据表明：其与qPCR检测结果具有很高的符合度，而与本发明的实时荧光RPA检测方法的结果完全一致。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测猪细小病毒试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：
(1)能够节约试验时间：RPA整个试验过程只需要25min，该时间远远低于qPCR的1.5小时以及普通PCR的2.5h。加上样品处理以及准备试验的时间，RPA整个检测过程能够在一个小时之内完成。
(2)能够降低反应温度：RPA只需要恒温38℃即可完成试验，该温度远远低于qPCR以及普通PCR的60℃-95℃。
(3)方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西已经冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，只需要一个水浴锅即可完成试验，不需要熟练的试验人员。
(4)特异性高：因该试验中添加了探针，增加了该方法特异性，基于SYBR Green的qPCR方法因为没有探针，特异性相对较差；
(5)更加不易于污染：该试验中添加了核酸外切酶III，对扩增产物进行切割，因此降低了产物污染的可能性，qPCR没有添加切割产物的酶，普通PCR需要跑核酸电泳胶，因此，均有污染的可能性。
(6)检测结果真实可靠：与现有的qPCR有很高的符合度，如表3所示。
附图说明
图1(A)为将合成的针对PPV引物和探针的标准品质粒进行十倍倍比稀释，稀释范围为106-101拷贝，随后用Real-time RPA试验进行敏感性检测，如图所示为扩增20min后实时荧光定量PCR仪的结果。此图可看出本发明所设计的引物和探针可以在38℃条件下，很好的检测106-102拷贝的模板。其中NC代表阴性对照。
图1(B)为利用PRISM 5.0软件(GraphPad Software,USA)对Real-time RPA试验的可重复性进行验证。阈值为平均值±标准方差(SD)。该试验进行过4次重复性试验。
图1(C)为对Real-time RPA试验的4次重复性结果进行退行性分析。我们用三角符号标出95％可能性的检测限制。
图2为使用Real-time RPA和qPCR检测猪伪狂犬病毒混合组织样品(n＝19)的检测结果比较，用excle软件来进行退行性分析，其中Y轴为RPA的时间阈值，X轴为qPCR循环数阈值。
图3(A)为检测试纸条RPA试验的敏感性结果，我们将合成的标准品质粒进行定量，并以十倍倍比稀释的方式稀释出浓度为106-101的质粒DNA作为模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件(38℃,20min)，试验结果如图所示，NC代表阴性对照；(B)为检测试纸条RPA试验的特异性，我们分别用猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫病毒提取的DNA/RNA作为模板进行试验，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。
图4为用试纸条RPA试验检测qPCR确认的(A)PPV阳性样品(n＝8)以及(B)阴性样品(n＝6)的检测结果，其中PC代表阳性对照，NC代表阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1快速检测猪细小病毒的实时荧光RPA(Real-time RPA)检测试剂盒及检测方法的建立
1、引物及探针序列的设计及制备
本发明发明人通过对来自于GenBank中的KF429255.1,JX871883.1,JN872448.1,EU790642.1,EU790641.1,L23427.1,M38367.1,M32787.1,D00623.1,KF429254.1,JQ710893.1,KF429252.1,JQ710888.1和AY502114.1的NS1基因同源序列进行比对分析，确定了猪细小病毒NS1基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪细小病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，如下表1所示。
表1、本发明设计的PPV Real-time RPA引物和探针
Figure BDA0000913951320000071
Figure BDA0000913951320000081
2、毒株、细胞以及临床样品
本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PPV(AV30)毒株，PPV(AV31)毒株，PRV(Fa)毒株，PCV2NX毒株，PRRSV(SD0907)毒株，CSF(C-strain)毒株，(FMDV)/O/CHA毒株，FMDV/Asia 1/CHA。猪细小病毒混合组织样品(n＝19)是由猪的组织混合均浆液混合得到的PPV阳性样品，我们分别收集来自甘肃省的33份临床样品、以及12份健康猪的血清。PK-15细胞由本实验室保存，用含有10％血清的MEM在37℃，5％CO2的条件下培养。
3、病毒基因组提取
使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA或RNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA或RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。
4、产生质粒DNA标准品
金维智合成PPV的NS1基因片段(347bp)，并克隆到pUC57载体，命名为pPPV/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPPV/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定量纯化的DNA，并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80℃备用。
5、real-time RPA试验扩增条件优化
以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如下：14.75μL水解缓冲液(rehydration buffer，TwistDx exo Kit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.075μL的RPA exo探针(10μM)，2μL的DNA/RNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesium acetate，280mM)。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-AAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAAC
-(FAM-dT)-G-THF-A-(BHQ1-dT)-GGCCACTAATATGTG-P-3’(SEQ ID NO.3所示)。
反应条件为38℃，反应可在20min之内完成。同时本发明分别用该体系对合成的三对上游引物和三对下游引物与探针的组合进行评价，评价结果表明其中一对引物(Fe2/Re2)与探针的组合能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。
在进行real-time RPA引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。我们分别试验了37℃、38℃、39℃不同的反应温度，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。通过对结果分析表明，38℃扩增结果最佳。所以本发明所设计的PPVreal-time RPA扩增温度设定为38℃。在进行real-time RPA引物的反应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。并将温度设定为38℃时，试验反应不同时间扩增的差异。我们将时间分别设定为20min、30min和1h，结果表明，扩增20min之后的阴性在一个小时之后仍然为阴性，20min之后的阳性在一个小时之后仍然为阳性，因此，选择20min为本发明的扩增设定时间。
real-time RPA试验检测结果判定：一个样品所有的重复试验，在特定的时间内(20min)扩增结果均大于背景值3.5个标准方差(3.5SD)的为阳性，反之，该样品为阴性。
6、real-time RPA试验灵敏度以及特异性检测
在进行real-time RPA试验反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为106-101个拷贝共计6个梯度作为模板。反应温度设为38℃的qPCR仪中进行，时间设定为20min，通过实时荧光实时监控扩增结果。如图1A所示，从图1A结果可以看出该试验的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102范围内的样品均能被检测出来。
在real-time RPA敏感性试验中，我们对于同一个试验进行了四次重复，结果表明四次试验的检测结果一致，均能够很好的检测100个拷贝的标准DNA，本发明利用PRISM 5.0软件(GraphPad Software,USA)对试验的可重复性进行统计分析，结果如图1B所示，表明该发明具有很好的可重复性。阈值为平均值±标准方差(SD)。同时，本发明利用Excel软件对RPA试验的四次重复性结果进行退行性分析，结果如图1C所示，说明该方法能够很好的检测PPV。
随后我们用猪细小病毒混合组织样品(n＝19)进一步验证该实验的准确性，试验数据表明：qPCR检测结果与RPA检测结果完全一致，所有样品均为阳性，并且我们用excel统计了qPCR检测结果(CT值)与real-time RPA检测结果(min)之间的相关性(见图2)。
qPCR检测方法参照文献(Simultaneous detection of porcine parvovirus andporcine circovirus type 2by duplex real-time PCR and amplicon melting curveanalysis using SYBR Green.Zheng,L.L.,et al.,J Virol Methods,2013.187(1):p.15-9.)中的方法进行。
在进行real-time RPA试验的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSF)、2型猪圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)以及口蹄疫病毒(FMDV)。反应温度设为38℃的qPCR仪中进行，反应时间设定为20min。结果表明，只有PPV能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，结果如下表2所示，因此说明，该方法具有很好的特异性。
表2评估PPV real-time PRA试验的特异性
Figure BDA0000913951320000101
neg:代表阴性对照；pos:代表阳性对照
7、real-time RPA试验检测临床样品
我们用建立的real-time RPA方法来检测采集自甘肃省的临床样品(n＝33)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。
qPCR检测方法参照文献(Simultaneous detection of porcine parvovirus andporcine circovirus type 2by duplex real-time PCR and amplicon melting curveanalysis using SYBR Green.Zheng,L.L.,et al.,J Virol Methods,2013.187(1):p.15-9.)中的方法进行。
结果表明12份健康猪的血清样品real-time RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在33份临床样品中，real-time RPA检测结果为5份阳性样品(时间为：6.6min-8.0min)，而qPCR检测结果为6份阳性样品(其中5份阳性样品为real-time RPA检测阳性样品，另外一份为real-time RPA检测阴性样品)。基于检测的45份样品，与qPCR检测结果相比较，real-time RPA的敏感性和特异性分别为98％和100％，结果如下表3所示。
表3.分别比较real-time PRA试验和qPCR试验临床样品检测结果
Figure BDA0000913951320000111
综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的实时荧光PRA(real-time RPA)方法可以快速诊断PPV，而且该检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。
实施例2快速检测猪细小病毒的试纸条RPA(LFS RPA)检测试剂盒及检测方法的建立
1、引物及探针序列的设计及制备
本发明发明人通过对来自于GenBank中的KF429255.1,JX871883.1,JN872448.1,EU790642.1,EU790641.1,L23427.1,M38367.1,M32787.1,D00623.1,KF429254.1,JQ710893.1,KF429252.1,JQ710888.1和AY502114.1的NS1基因同源序列进行比对分析，确定了猪细小病毒NS1基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪细小病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和三对下游引物，如下表4所示。
表4、本发明设计的PPV RPA引物和探针
Figure BDA0000913951320000121
2、毒株、细胞以及临床样品
本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PPV(AV30)毒株，PPV(AV31)毒株，PRV(Fa)毒株，PCV2NX毒株，PRRSV(SD0907)毒株，CSF(C-strain)毒株，(FMDV)/O/CHA毒株，FMDV/Asia 1/CHA。猪细小病毒混合组织样品(n＝19)是由猪的组织混合均浆液混合得到的PPV阳性样品，我们分别收集来自甘肃省的33份临床样品、以及12份健康猪的血清。PK-15细胞由本实验室保存，用含有10％血清的MEM在37℃，5％CO2的条件下培养。
3、病毒基因组提取
使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA或RNA，并最终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA或RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。
4、产生质粒DNA标准品
金维智合成PPV的NS1基因片段(347bp)，并克隆到pUC57载体，命名为pPPV/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPPV/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定量纯化的DNA，并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80℃备用。
5、LFS RPA试验扩增条件优化
我们以提取纯化的病毒DNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如下：14.75μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistDx nfo Kit,Cambridge,UnitedKingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.3μL的RPA nfo探针(10μM)，2μL的DNA模板，4.6μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesium acetate，280mM)。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3’(SEQ ID NO.1所示)
下游引物：5’-biotin-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3’(SEQ ID NO.2所示)
探针：5’-FAM-ACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTG
-THF-ATGGCCACTAATATGTG-P-3’(SEQ ID NO.4所示)。
反应条件为38℃，反应可在20min之内完成。结束后使用侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)对结果进行检测。本发明分别用该体系对合成的三对上游引物和三对下游引物与探针的组合进行评价，评价结果表明其中一对引物(Fn2/Rn2)与探针的组合能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。
随后，我们测试了38℃条件下，不同孵育时间对于扩增结果的影响，我们试验了0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的试验结果，如图1B所示，在扩增10min的时候，试验条带上出现微弱的条带，当反应时间在15min-30min之间时试验条带没有出现可观测的差异，因此，我们选择20min作为该试验的孵育时间，如没有特殊提示，本发明中使用的孵育时间均为20min。
LFS RPA试验检测结果判定：一个样品在特定的条件下(38℃，20min)试纸条上控制线为阳性，并且试验线为阳性的样品为阳性样品；试纸条上控制线为阳性，而试验线为阴性的样品为阴性样品。
6、LFS RPA试验灵敏度以及特异性检测
在进行LFS RPA试验的灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为106-101拷贝共计6个梯度作为模板。反应温度设为38℃的水浴锅中进行，时间设定为20min，通过试纸条终点检测扩增结果。如图3A所示，从该结果可以看出该试验的敏感性为102拷贝/反应，并且该实验具有较广的检测范围，至少在106-102范围内的样品均能被检测出来。在进行LFSRPA试验的特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板分别为猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、2型猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒以及口蹄疫病毒。反应温度设为38℃的水浴锅中进行，反应时间设定为20min。结果表明，只有PPV能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有很好的特异性，结果如图3B以及表5所示。
表5评估LFS RPA试验的特异性
Figure BDA0000913951320000131
Figure BDA0000913951320000141
neg:代表阴性对照；pos:代表阳性对照
7、LFS RPA试验检测临床样品
首先，我们用LFS RPA试验测试qPCR确认的8份阳性样品和6份阴性样品，LFS RPA试验结果表明：qPCR确认的10份阳性样品均为阳性，qPCR确认的6份阴性样品均为阴性，结果如图4所示。
qPCR检测方法参照文献(Simultaneous detection of porcine parvovirus andporcine circovirus type 2by duplex real-time PCR and amplicon melting curveanalysis using SYBR Green.Zheng,L.L.,et al.,J Virol Methods,2013.187(1):p.15-9.)中的方法进行。
我们用建立的LFS RPA方法来检测采集自甘肃省的临床样品(n＝33)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。结果表明12份健康猪的血清样品LFS RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在33份临床样品中，real-timeRPA检测结果为5份阳性样品，而qPCR检测结果为6份阳性样品(其中5份阳性样品为LFS RPA检测阳性样品，另外一份为LFS RPA检测阴性样品)。基于检测的45份样品，与qPCR检测结果相比较，LFS RPA的敏感性和特异性分别为98％和100％。
表6分别比较real-time PRA试验和qPCR试验临床样品检测结果
综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的试纸条RPA(LFS RPA)方法可以快速诊断PPV，而且该检测方法简单、快速、检测结果真实可靠。
Figure IDA0000913951400000011
Figure IDA0000913951400000021

Claims (10)

1.一种用于快速检测猪细小病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3’
下游引物：5’-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3’
探针：5’-AAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAAC
-FAM-dT-G-THF-A-BHQ1-dT-GGCCACTAATATGTG-P-3’。
2.如权利要求1所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
3.如权利要求1或2所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测猪细小病毒时，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
4.如权利要求3所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为38℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
5.权利要求1-4任一项所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测猪细小病毒试剂中的用途。
6.一种用于快速检测猪细小病毒的试纸条RPA检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，其特征在于还包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-TTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACA-3’
下游引物：5’-biotin-TGATGCATATAGCTAGCCATTGTTGCTTGGTAACC-3’
探针：5’-FAM-ACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGAAACTG
-THF-ATGGCCACTAATATGTG-P-3’。
7.如权利要求6所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
8.如权利要求6或7所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测猪细小病毒时，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.3μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.6μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的水浴锅中进行，反应时间为10min-30min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
9.如权利要求8所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为38℃的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
10.权利要求6-9任一项所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测猪细小病毒试剂中的用途。
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