CN107012258B

CN107012258B - 用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列

Info

Publication number: CN107012258B
Application number: CN201710173960.1A
Authority: CN
Inventors: 姜敬哲; 高芳; 王江勇
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2037-03-22
Also published as: CN107012258A

Abstract

本发明公开了用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列，所述的引物组为：FP:CATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTC，RP:AACATCTCCAGTTCCAAGGCTGTAGTCAAT；所述探针序列为：CAAGGCTGTAGTCAATGGACAGCGGACGG（dT‑FAM）CCA（THF）GC（dT‑BHQ1）GGAAGACTGCTCC（C3spacer）。本发明还公开了所述引物组和探针序列在制备用于RPA检测鱼类病毒性神经坏死病毒的试剂的应用。以上述引物组和探针序列为基础开发的荧光定量RPA检测方法具有灵敏度高、特异性强、反应迅速、仪器设备要求低等优点，非常适用于水产动物病原检测。

Description

用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列

技术领域

本发明涉及引物及探针，具体涉及用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组及探针序列。

背景技术

鱼类病毒性神经坏死病（Viral nervous necrosis，VNN）又称脑病和视网膜病（Viral encephalopathy and retinopathy，VER)，是由鱼类病毒性神经坏死病毒（Viralnervous necrosis virus，VNNV）引起的鱼类传染病。该病对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达 100%，对成鱼也有很高的致死率。由于其极高的传染性和危害性，被国际兽医组织（OIE）列为重要的鱼类病害。目前，针对该病毒病尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。目前，常用的是以聚合酶链式反应（PCR）为代表的病原检测技术。但是此过程需要精密的仪器和专业的试验场地，耗时长，时效性低，不能满足水产养殖现场诊断的需求。重组酶聚合酶扩增（RPA）是近几年出现的一种可在室温下进行的核酸快速检测技术，无需温控设备，反应可在 15分钟内迅速完成，具有和 PCR一样的灵敏度和特异性，非常适宜水产病原的现场快速检测。RPA检测所用的引物组和探针是其核心组分，它们决定着RPA的检测效果。但RPA引物和探针的设计难度较大，没有类似PCR引物的专业设计软件，检测的灵敏度和特异性完全依赖于引物设计者的经验和大量的试验验证。有时从数十套候选引物探针组合中都难以筛选到1套可用的检测序列，因此引物设计是RPA检测方法成败的关键。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列。

本发明的引物组和探针序列是根据病毒RNA2（GenBank accession no.AY744705.01）核酸序列设计而得。

本发明提供的用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列，其中，所述的引物组为：

FP:CATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTC

RP: AACATCTCCAGTTCCAAGGCTGTAGTCAAT

探针序列为：

CAAGGCTGTAGTCAATGGACAGCGGACGG（dT-FAM）CCA（THF）GC（dT-BHQ1）GGAAGACTGCTCC（C3spacer）。

本发明的目的之二是提供使用上述引物组和探针序列在制备用于RPA检测鱼类病毒性神经坏死病毒的试剂的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的1套用于鱼类病毒性神经坏死病毒的荧光定量RPA（qRPA）检测引物组和探针序列，以它们为基础开发的荧光定量RPA检测方法具有灵敏度高、特异性强、反应迅速、仪器设备要求低等优点，非常适用于水产动物病原检测。NNV-qRPA检测体系的检测灵敏度与qPCR相似，但检测时间仅为20±0.50分钟，时间相比qPCR大大缩短；反应温度为恒温37℃，无需升降温系统，适于野外实地操作。

附图说明

图1是实施例一中的扩增产物的电泳图。

图2是NNV-qRPA检测体系扩增曲线图；

不同的曲线代表10⁷〜10的不同浓度质粒拷贝数，每条扩增曲线是三次重复测量的平均值。

图3是NNV-qRPA检测体系的标准曲线；

体现了NNV-qRPA检测体系中不同浓度标准品达到荧光阈值对应的循环数。

图4是NNV-qRPA与NNV-qPCR检测结果的散点图；

体现了NNV-qRPA与NNV-qPCR检测结果之间的相关性。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明的技术方案为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1 引物组和探针的设计和特异性检测

根据病毒RNA2（GenBank accession no. AY744705.01）核酸序列设计引物组和探针，其中目标基因序列为：

AACATCTCCAGTTCCAAGGCTGTAGTCAATGGACAGCGGACGGTCCAGCTGGAAGACTGCTCCATCAGGGGCAATATCCAGTGGTGTGGATCCTAGGAGGATGGACTTGAAGTCATTTGTGGAAAGGGAATCGTTGTACAGGGGACCTTGTGTCATGA。

引物组为：

FP：CATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTC

RP：AACATCTCCAGTTCCAAGGCTGTAGTCAAT

探针序列为：

特异性检测：建立含有NNV的阳性对照、ddH₂O的阴性对照、虾病毒（WSSV）基因组DNA对照、卵形鲳鲹基因组DNA对照、东风螺基因组DNA对照、牡蛎基因组DNA对照、水体DNA对照、泥DNA对照和嗜水气单胞菌基因组DNA对照，以这些基因组DNA作为模板，进行检测。

石斑鱼病毒性神经坏死病毒RNA提取使用通用型RNA小量提取试剂盒（Magen，苏州，中国），cDNA合成使用TaKaRa（大连，中国）反转录试剂盒。虾病毒（WSSV）基因组DNA、卵形鲳鲹基因组DNA、东风螺基因组DNA和牡蛎基因组DNA提取使用海洋动物组织提取试剂盒（东盛，广东，中国），具体操作按照说明书上指示进行。

水体DNA、泥DNA和嗜水气单胞菌基因组DNA提取使用细菌DNA提取试剂盒（Magen，苏州，中国），具体操作按照说明书上指示进行。

反应体系：

Rehydration buffer（Twistdx试剂盒（TABAS03KIT））: 14.8 μL

RPA FP（10 μM）: 1.2 μL

RPA RP（10 μM）:1.2 μL

dd H₂O :4.6 μL

DNA（50~500 ng）:2 μL

MgAC（280 nM）:1.2 μL

RPA扩增反应条件：37℃孵育30分钟。

反应结束后，反应物通过琼脂糖凝胶电泳（1.5%的琼脂糖）的结果进行判断，结果显示，这些基因组DNA和阴性对照均没有扩增信号，而阳性对照有明显的扩增信号（图1）。可见，本发明建立的引物组和探针特异性强。

实施例2 灵敏度验证

标准曲线模板由上海英潍捷基公司合成。该模板是由目标基因片段和PMD18-Tvector载体连接而成。载体序列已公开：http://wenku.baidu.com/view/385564bdf121dd36a32d8271.html。

采用绝对定量法进行检测：将构建的质粒标准品用TE Buffer作10倍梯度稀释，构建不同浓度梯度10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10制作标准曲线，用ddH₂O作为阴性对照，每个浓度重复三次。运用实时荧光定量 PCR仪（Eppendorf）进行RPA扩增反应。

反应体系：

Rehydration buffer（Twistdx试剂盒，TAEXO02KIT）: 14.7 μL

RPA FP（10 μM）: 1.1μL

RPA RP（10 μM）:1.1μL

Probe（10 μM）:0.3 μL

dd H₂O :4.6 μL

DNA（50~500 ng）:2 μL

MgAC（280 nM）:1.2 μL

RPA扩增反应条件：37℃孵育30分钟。

根据各个浓度扩增结果建立各个浓度的扩增曲线以及扩增效率，统计结果，建立标准曲线，结果参见图2和图3。从图2可见，该检测方法对NNV的检测限为100拷贝。

实施例3 可行性验证

为了进一步确定本发明qRPA检测体系的可靠性，随机抽出40只石斑鱼同时对其体内的NNV含量分别进行qRPA与qPCR检测。结果显示(参见图4)，两个诊断方法的检测结果呈现出较好的相关性（R²>0.8）。

石斑鱼组织RNA提取使用通用型RNA小量提取试剂盒，具体操作按照说明书指示进行。

qRPA检测方法、引物组和探针同实施例2。

qPCR检测方法采用的是已经报道的SYBR Green检测方法（kuo,Wang et al,.Real-Time Quantitative PCR Assay for Monitoring of Nervous Necrosis VirusInfection in Grouper Aquaculture.Journal of Clinical Microbiology.2011.）。所用引物序列为:

F ： GACGCGCTTCAAGCAACTC

R ： CGAACACTCCAGCGACACAGCA。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列

<160> 6

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物FP

<400> 1

catgacacaa ggtcccctgt acaacgattc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物RP

<400> 2

aacatctcca gttccaaggc tgtagtcaat 30

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 探针序列

<400> 3

caaggctgtagtcaatggacagcggacgg（dT-FAM）cca（THF）gc（dT-BHQ1）ggaagactgctcc（C3spacer） 47

<210> 4

<211> 158

<212> DNA

<213> RNA2

<400> 4

aacatctcca gttccaaggc tgtagtcaat ggacagcgga cggtccagct ggaagactgc 60

tccatcaggg gcaatatcca gtggtgtgga tcctaggagg atggacttga agtcatttgt 120

ggaaagggaa tcgttgtaca ggggaccttg tgtcatga 158

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物F

<400> 5

gacgcgcttc aagcaactc 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物R

<400> 6

cgaacactcc agcgacacag ca 22

Claims

1.用于检测鱼类病毒性神经坏死病毒的引物组以及探针序列，其特征是，所述的引物组为：

FP:CATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTC

RP: AACATCTCCAGTTCCAAGGCTGTAGTCAAT；

所述探针序列为：

2.权利要求1所述引物组和探针序列在制备用于RPA检测鱼类病毒性神经坏死病毒的试剂的应用。