CN108103059B - 一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物及其应用 - Google Patents

一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物，所述的引物主要由如SEQ ID NO.1所示的碱基序列、在所述碱基序列AG之间插入的五个脱氧次黄嘌呤、以及在所述碱基序列末端的C3 spacer组成。该引物能够有效抑制宿主基因的扩增，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA的扩增效果。本发明还公开了上述引物在制备具有抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增功效的试剂中的应用。

Description

一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物及其 应用
技术领域
本发明属于PCR引物技术领域，具体涉及一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA 序列特异性扩增的引物及其应用。
背景技术
真核动物宿主(如牡蛎、虾)的基因组中含有18S rDNA基因序列。同时，其体内(如肠道)也携带有多种真核微生物(如尚未消化的藻类食物、内共生真菌、寄生虫)，它们基因组中也都含有18S基因序列，不同物种间的18S序列有一定相似性。
为了对宿主体内存在的真核微生物进行研究，人们通常采用PCR的方法通过 18S基因的通用引物进行特异性扩增。但是，由于不可避免的大量宿主自身18S 基因序列的干扰，使得这样扩增后产物中宿主18S序列占据了绝大部分的比例，影响了研究结果。
抑制引物是根据真核宿主及真核微生物的18S rDNA的基因序列特征设计的一种特异性抑制宿主基因扩增的引物。通过添加抑制引物，能够有效降低宿主基因序列的扩增效率，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA的扩增效果。
但是现有技术中还没有用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物，该引物能够有效抑制宿主基因的扩增，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA的扩增效果。
本发明的目的还在于提供上述用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物在制备具有抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增功效的试剂中的应用。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物，所述的引物主要由如SEQ ID NO.1所示的碱基序列、在所述碱基序列AG之间插入的五个脱氧次黄嘌呤、以及在所述碱基序列末端的C3spacer组成。
该引物(简称：nmb-BP2-DPO)具体为：
GTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTCTA44444(4代表 dlnosine)GTGAGGGCAC(C3spacer)。
本发明的关键是设计一种对宿主18S基因扩增具有很好抑制效果的，同时又对其它微生物的18S基因扩增抑制很小的引物序列。
本发明的研究过程中设计了多条不同的抑制引物，并确定了两种最有希望的设计方案，一种称为C3间隔子，抑制引物的5’端与通用引物的正向或反向3’端有重叠(部分或全部)，然后以宿主序列延伸且3’端以化学修饰(C3spacer) 结束；另一种称为双引发寡核苷酸，同C3间隔子设计相似，主要是中间含有五个脱氧次黄嘌呤(dlnosine)连接5’端和3’端。为了验证这些候选抑制引物的抑制效果，以不添加抑制引物的做为对照组，以添加抑制引物的作为检验组，通过琼脂糖凝胶电泳，验证了各种抑制引物的抑制效果。最后通过筛选确定了双引发寡核苷酸引物。
进一步的，PCR反应前，加入适量的抑制引物，使其刚好能够有效抑制宿主基因的扩增，而又对其它微生物基因的扩增影响很少。这可以根据琼脂糖凝胶电泳结果做出判断，以ddH2O作为阴性，以不加抑制引物的做阳性对照，通过条带的亮暗程度，来评估抑制引物的效果，与阳性对照做对比，如果存在条带，但亮度没有阳性的明显，则证明抑制引物有一定的效果，且条带越暗，抑制效果越好，其中暗的条带部分，代表其它真核生物，通过进一步测序，可以获知真核生物的种类。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物在制备具有抑制虾、牡蛎18S rDNA 序列特异性扩增功效的试剂中的应用。
目前，鉴定DNA序列多样性是评估环境及生物样品中所含微生物物种多样性的有力手段。本发明通过将所述引物制成试剂，其中引物能够有效抑制宿主基因的扩增，提高宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌)18S rDNA 的扩增效果，并通过进一步测序，可以获知真核生物的种类。因此，本发明对阐释真核宿主体内的真核微生物的组成与分类具有重要意义，有利于人们更好的研究宿主体内的微生物群落结构。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明使用上述抑制引物序列特异性地抑制宿主18S rDNA基因的扩增，提高对宿主体内其它真核生物(如原生动物、藻类、真菌等)18S rDNA的扩增效果，进而方便对宿主体内的其它真核生物分类及组成进行更好地研究。
附图说明
图1是实施例1中图1是MEGA比对的南美白对虾、香港牡蛎、藻、原生动物的18S序列，其中a图代表南美白对虾与藻、原生动物序列5’端比对结果， FR865635.1：多管藻，DQ629010.1：石枝藻，KX109776.1：小球藻，FM876988.1：紫球藻，AF124597.1：南美白对虾，EU920969.1：南美白对虾，AJ238069.1：丰年虫，AB374225.1：绦虫，AJ250699.1：马尔太虫，b图代表原生动物与南美白对虾5’端比对结果，其中AJ238069.1：丰年虫，AB374225.1：绦虫，AJ250699.1：马尔太虫，AF124597.1：南美白对虾，EU920969.1：南美白对虾， c图代表原生生物与南美白对虾3’端比对结果，AF463509.1：南美白对虾， EU373483.1：南美白对虾，AJ238069.1：丰年虫，AB374225.1：绦虫， AJ250699.1：马尔太虫，d图代表牡蛎与各种藻比对3’端比对结果，AB064942.1：太平洋牡蛎，U88709.1：牡蛎，L49052.1：牡蛎，AY144598.1：近江牡蛎， FR865635.1：多管藻，KX109776.1：小球藻，FM876988.1：紫球藻，e图代表牡蛎与原生生物比对3’端比对结果，AB064942.1：太平洋牡蛎，U88709.1：牡蛎，L49052.1：牡蛎，AY144598.1：近江牡蛎，AJ238069.1：丰年虫，AJ250699.1：马尔太虫，KT767113.1：裂头绦虫，f图代表各种牡蛎、藻、原生生物比对3’端比对结果，AB064942.1：太平洋牡蛎，U88709.1：牡蛎，L49052.1：牡蛎， AY144598.1：近江牡蛎，FR865635.1：多管藻，KX109776.1：小球藻，FM876988.1：紫球藻，AJ238069.1：丰年虫，AJ250699.1：马尔太虫，KT767113.1：裂头绦虫；
图2是实施例2中抑制引物对南美白对虾18S基因扩增抑制效果的电泳图，其中M：marker，-:阴性，+:阳性(不加引物)，1-3代表引物体积从左往右依次为1μL、2μL、4μL；
图3是实施例2中抑制引物对香港牡蛎18S基因扩增抑制效的电泳图，其中 M：marker，-:阴性，+:阳性(不加引物)，1-3代表引物体积从左往右依次为1μL、 2μL、4μL；
图4是实施例2中抑制引物对滤膜上的水体真核生物18S基因扩增抑制效果电泳图，其中M：marker，-:阴性，+:阳性(不加引物)，1-3代表引物体积从左往右依次为1μL、2μL、4μL；
图5是实施例2中抑制引物对水体浮游动物18S基因扩增抑制效果电泳图，其中M：marker，-:阴性，+:阳性(不加引物)，1-3代表引物体积从左往右依次为1μL、2μL、4μL。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明的技术方案为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
实施例1抑制引物的设计
抑制引物的设计方案：
1.C3间隔子的设计
5’端(18-25nt)与通用引物的F(R)3’末端有一定重叠，之后的序列要尽量与要抑制的18S基因序列一致，与不希望被抑制的基因序列不同，最后在末端加上C3spacer。
2.双引发寡核苷酸的设计
5’端同C3的5’端设计相似，不同之处是在3’末端(6-12nt)之前加 44444(4＝dlnosine)，最后在末端加上C3spacer。
抑制引物的设计过程：
如图1所示，根据南美白对虾(GenBank accession no.EU920969.1)、南美白对虾(GenBank accession no.EU118282.1)、南美白对虾(GenBank accessionno.AF186250.1)、南美白对虾(GenBank accession no.AF124597.1)、南美白对虾(GenBankaccession no.AF463509.1)、南美白对虾(GenBank accession no.EU373483.1)、南美白对虾(GenBank accession no.GQ392035.1)、中国对虾(GenBank accessionno.AY074919.1)、钩虾(GenBank accession no.AY926841.1)、钩虾(GenBank accessionno.AF202982.1)、日本囊对虾(GenBank accession no. AF463512.1)和牡蛎(GenBankaccession no.U88709.1)、牡蛎(GenBank accession no.L49052.1)、近江牡蛎(GenBankaccession no.JF919378.1)、近江牡蛎(GenBank accession no.AY144598.1)、牡蛎(GenBank accession no.L49052.1)、多管藻 (GenBank accession no.FR865635.1)、石枝藻(GenBank accession no.DQ629010.1)、小球藻(GenBank accession no.KX109776.1)、紫球藻(GenBank accession no.FM876988.1)、多甲藻(GenBank accessionno.KU561157.1)、前沟藻(GenBank accession no.LC054922.1)、红藻(GenBank accessionno.Z14140)、裸甲藻(GenBank accession no.JX470953.1)、马尾藻(GenBank accessionno.KF692548.1)、丰年虫(GenBank accession no.AJ238069.1)、裂头绦虫(GenBankaccession no.AT767113.1)、绦虫(GenBank accession no.AB374225.1)、马儿太虫(GenBank accession no.AJ250699.1)、太平洋裂头绦虫(GenBank accessionno.KF218254.1)、太平洋裂头绦虫(GenBank accession no.AB302387.1)、太平洋裂头绦虫(GenBank accession no.AF21825.1)微孢子虫(GenBank accession no.KR816825.1)、线虫(GenBank accession no.AB097864.1)、帕金虫(GenBank accession no.KC812381.1)、帕金虫(GenBank accession no.KC812378.1)、帕金虫(GenBank accessionno.AF472523.1)、帕金虫(GenBank accession no.AF522321.2)、蛲虫(GenBank accessionno.HQ646164.1)、瑞立绦虫(GenBank accession no.KP893422.1)的18S核酸序列设计而得。抑制引物主要是根据宿主 (虾、牡蛎)18S rDNA的基因序列设计的，截取相同片段后，通过MEGA将多种虾、牡蛎分别与多种真核微生物的18S基因序列比对，分析这些序列间的异同，尽可能在抑制引物中保留宿主与真核微生物不同的序列，提高宿主基因的抑制效果，同时尽可能避免引入宿主中没有而真核微生物中有的序列，降低对微生物基因的抑制作用。在引物的末端加C3spacer，它主要是终止Taq DNA聚合酶对基因序列的延伸。
抑制引物的设计结果：
抑制引物序列：
GTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTCTA44444(4＝dlnosi ne)GTGAGGGCAC(C3spacer)。
C3间隔子和双引发寡核苷酸的设计区别在于3’末端前是否插入44444 (4＝dlnosine)，针对相同的抑制引物序列，分别用这两种方案做对照，根据琼脂糖凝胶电泳图结果显示，两种方案都有一定的抑制作用，但双引发寡核苷酸的抑制效果更显著一些。
实施例2抑制引物的验证
南美白对虾DNA、香港牡蛎DNA提取使用软体动物DNA提取试剂盒 (Magen，苏州，中国)，过滤到膜上的水体浮游微生物DNA、浮游动物DNA 提取使用水体DNA提取试剂盒(Magen，苏州，中国)具体操作按照说明书上指示进行。
针对抑制引物nmb-BP2-DPO配置不同浓度0.01μM、0.02μM、0.04μM的抑制反应体系，用ddH2O作为阴性对照，用不加抑制引物的反应作为阳性对照，模板分别使用南美白对虾消化道组织DNA，香港牡蛎消化道组织DNA、过滤到膜上的水体浮游微生物DNA，浮游动物DNA，每个不同模板DNA设置3个试验重复，通过PCR仪进行扩增。
其中，所用的18S通用引物序列为：
1391F：GTACACACCGCCCGTC
EukBr：TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC
反应体系：
Figure BDA0001503393720000061
表1加抑制引物体积
抑制引物 0μL 1μL 2μL 4μL
PCR-grade Water 13μL 12μL 11μL 9μL
PCR扩增反应条件：
Figure BDA0001503393720000071
反应循环数为35，反应结束后，反应物并进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％的琼脂糖)。
根据琼脂糖凝胶电泳图的结果进行判断，如图2-5显示。
图2中的结果表明，本发明抑制引物对南美白对虾18S基因扩增有较强的抑制效果。
图3中的结果表明，抑制引物对牡蛎18S基因扩增有较强的抑制效果。
图4中的结果表明，抑制引物对水体中真核微生物18S基因扩增有一定的抑制，但是抑制效果并不明显，说明本发明能够更高效地抑制宿主基因扩增，但对真核微生物基因扩增的抑制作用很小，只要将抑制引物的量控制到一个合理的浓度就可以达到特异抑制宿主基因的效果。
图5中的结果表明，抑制引物对浮游动物几乎没有抑制作用，与不加抑制引物的对照没有明显变化。
所以，本发明抑制引物对南美白对虾和香港牡蛎的抑制作用比较明显，且 0.02μM的抑制引物抑制效果更佳，抑制引物对过滤到膜上的水体浮游微生物的抑制作用较小；对浮游动物几乎没有抑制作用，与无抑制引物没有显著差异。
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是上下具体实施例只用于对本发明作进一步的说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州易米生物科技有限公司
<120> 一种用于抑制虾、牡蛎18S rDNA序列特异性扩增的引物及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial)
<400> 1
gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg aatggtctag tgagggcac 49

Claims (2)

1.一种用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物，其特征是：所述的引物由如SEQ ID NO.1所示的碱基序列、在所述碱基序列的第一处AG之间插入的五个脱氧次黄嘌呤、以及在所述碱基序列末端增加的C3spacer组成。
2.权利要求1所述的用于抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增的引物在制备具有抑制虾、牡蛎18SrDNA序列特异性扩增功效的试剂中的应用。
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