CN110129453B

CN110129453B - 鉴别鸡快慢羽基因型的方法

Info

Publication number: CN110129453B
Application number: CN201910376463.0A
Authority: CN
Inventors: 李俊英; 刘夏仪; 鲍海港; 吴常信
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110129453A

Abstract

本发明提供一种鉴别鸡快慢羽基因型的方法。该方法包括：提取待测鸡的基因组DNA为模板，利用引物对(SEQ ID NO:1‑2)进行PCR扩增，获得扩增产物，然后用BbvCI内切酶对扩增产物进行酶切，根据酶切产物的片段大小判断快慢羽基因型。本发明提供的检测引物特异性好，内切酶效率高，结果清晰，鉴别准确率高，且能够解决快慢羽鉴别受时间限制的问题。本发明能够准确鉴别鸡的快慢羽以及慢羽的纯合与杂合型，根据获得的基因型可以快速建立雏鸡自别雌雄配套系。

Description

鉴别鸡快慢羽基因型的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种鉴别鸡快慢羽基因型的方法。

背景技术

现代养鸡生产中采用多种方法区分初生雏鸡的性别，主要有翻肛鉴别法、金银羽自别雌雄法、快慢羽自别雌雄法等。快慢羽自别雌雄法与金银羽自别雌雄法相比，有其优点，这种方法不受羽色限制，只要父本和母本组合正确，对任何羽色的初生雏鸡都可以使用，而金银羽自别雌雄法，只能在金色羽父本配银色羽母本时，所产初生雏才可以自别。快慢羽自别雌雄法与翻肛鉴别法相比也有很多优点，首先更直观快捷，只需在雏鸡出壳后，用肉眼观察翅膀上的羽毛生长速度即可，其次雏鸡的应激反应小，不易对其造成伤害，而且简便易学，是目前广泛使用的自别雌雄的方法。

但快慢羽自别雌雄法也有其适用条件，只有在分别选育出快羽纯系和慢羽纯系，并进行合理的杂交配套，其后代初生雏鸡才能进行快慢羽自别雌雄。在培育快羽纯系和慢羽纯系的过程中，最初的方法是根据表型鉴别，最适宜的鉴别时间是出雏后24h内，将主翼羽长于覆主翼羽2mm以上的表型划分为快羽型，其余的全归为慢羽型。根据表型鉴别存在一定的局限性，首先是有最佳鉴别时间限制；第二是公鸡的慢羽表型有纯合和杂合两种基因型，所以仅凭表型鉴别需要至少两个世代才能培育出慢羽纯系，这样培育快慢羽自别雌雄配套系所需的时间就长，迫切需要用分子生物学方法鉴别鸡快慢羽基因型，缩短慢羽纯系培育时间、降低养殖成本。

快慢羽的分子鉴定最早是利用与内源性病毒ev21(Endogenous Virus21)之间的相关性，设计了特异性引物，利用PCR技术检测是否有ev21插入来确定快慢羽表型，但ev21在不同品种中与羽速基因的连锁程度存在差异，并未达到理想的遗传标记效果。荷兰学者Elferink 2008年提出PRLR(prolactin receptor，促乳素受体)和SPEF2(Sperm FlagellarProtein2，编码精子鞭毛蛋白2)基因串联的重复片段导致慢羽的形成，然而，黄卓林(鸡慢羽基因的精细定位与候选基因研究，2014年，中国农业大学硕士学位论文)发现国内一些地方鸡种虽然也含有重复片段，但是其表型却是快羽，因此利用重复片段来鉴别鸡快慢羽的方法有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别鸡快慢羽基因型的新方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于鉴别鸡快慢羽基因型的引物对，包括正向引物F和反向引物R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

第二方面，本发明提供含有所述引物对的检测试剂或试剂盒。

第三方面，本发明提供所述引物对或含有所述引物对的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

i)用于鉴别鸡快慢羽基因型；

ii)用于雏鸡雌雄鉴别。

第四方面，本发明提供用于鉴别鸡快慢羽基因型的方法，提取待测鸡的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后用BbvCI内切酶对扩增产物进行酶切，根据酶切产物的片段大小判断快慢羽基因型。

所述基因型的判断标准如下：酶切产物出现452bp和499bp两条特征条带，为快羽纯合基因型；酶切产物仅出现951bp一条特征条带，为慢羽纯合基因型；酶切产物出现452bp、499bp和951bp三条特征条带，为慢羽杂合基因型。

进一步地，采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测酶切后产物片段的大小。

优选地，电泳检测中琼脂糖凝胶浓度为1.5～2％(优选2％)。

优选地，电泳条件为：120～150V，20～25min(优选120V，30min)。

优选地，PCR扩增的反应体系为：

其中，2×Taq PCR Mix是2倍浓缩的PCR扩增预混合溶液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。DNA浓度为20ng/μL以上。

优选地，PCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min；4℃保存。

优选地，酶切反应体系为：2U/μL酶BbvCI1～2μL(优选2μL)，10×Buffer3μL，PCR扩增产物5μL，ddH₂O10μL；酶切反应条件为：37℃，2～3h(优选37℃，2h)。

优选地，基因组DNA的提取方法包括：

1)取5～10μL(优选10μL)鸡血于1.5mL离心管中，加入600μL血液裂解液，加入20μL蛋白酶K，混匀；56℃消化过夜；其中，蛋白酶K的用量为0.4～0.5mg；血液裂解液的组成如下：100mM Tris HCI(pH8.0)，100mM EDTA(pH8.0)，1％SDS，以水配制，定容至1L，室温保存；

2)加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；

3)吸取上清至新离心管中，再加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；

4)吸取上清至新离心管中，加入等体积的苯酚-氯仿混合液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；其中，苯酚-氯仿混合液中苯酚、氯仿体积比为1：1；

5)吸取上清至新离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀10min，12000rpm离心10～15min；

6)吸取上清至新离心管中，加入2倍体积冰乙醇，颠倒混匀，出现白色絮状沉淀；4℃，12000rpm离心20min；

7)收沉淀，加入1200μL75％乙醇，4℃，12000rpm离心1h；

8)收沉淀，挥发乙醇；加入50～100μL(优选50μL)水，溶解DNA。

在本发明的一个具体实施方式中，提供一种鉴别快慢羽基因型的酶切法，其采用酶切的方法，根据酶切产物的片段大小判断快慢羽及慢羽纯合与杂合型，该方法包括以下步骤：

(1)获得鸡血液或组织样本，提取DNA；

(2)进行PCR扩增，获得951bp的目的条带；

(3)用BbvCI内切酶对扩增产物进行酶切反应，根据酶切产物片段长度鉴别快慢羽，以及慢羽纯合子与杂合子。

快慢羽基因型判断标准为：酶切产物只有长度为452bp、499bp片段的为快羽纯合个体，酶切产物只有长度为951bp片段的为慢羽纯合个体，酶切产物有长度为452bp、499bp、951bp片段的为慢羽杂合个体。

前述的方法，在步骤(1)中，依据其他可能的技术从鸡血液或组织中提取DNA，也可用于本发明。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增片段时，目的片段为951bp，采用1.5％的琼脂糖凝胶，电泳电压为120V，电泳时间为30min。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物时，采用2％的琼脂糖凝胶，电泳电压为120V，电泳时间为30min。

第五方面，本发明提供一种雏鸡雌雄鉴别方法，根据上述方法获得的快慢羽基因型，用于构建雏鸡自别雌雄配套系，在用纯合快羽公鸡和慢羽母鸡配种生产的子代中，慢羽雏鸡为公鸡，快羽雏鸡为母鸡。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的检测引物特异性好，内切酶效率高，结果清晰，鉴别准确率高，且能够解决羽速鉴别受时间限制的问题。本发明能够准确鉴别鸡快慢羽以及慢羽纯合与杂合型，根据获得的基因型可以快速建立雏鸡自别雌雄配套系。本发明提供的鉴别鸡快慢羽基因型的分子方法，适用于国内多种地方鸡种以及国外引进的白来航鸡种，该方法在寿光鸡、白来航鸡、农大矮小鸡、北京油鸡、茶花鸡等品种中鉴别准确率达100％(依据下文实施例1及实验例1-5的结果)。

附图说明

图1为本发明为实施例1中涉及部分样本PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2-图3为本发明为实施例1中涉及部分样本酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图4为本发明为实施例2中涉及部分样本PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图5-图6为本发明为实施例2中涉及部分样本酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于鉴别鸡快慢羽基因型的方法

1、引物设计和制备

根据已有研究结果，将快慢羽基因定位在Z染色体上10-11.2Mb区间(鸡参考基因组5.0版本)，利用不用品种筛选区间内的SNP位点，在10.7Mb附近获得与表型一致的SNP位点。设计引物扩增SNP上、下游片段。

由生工生物工程股份有限公司进行引物合成(SEQ ID NO:1-2)，正向引物F：5′-GACAGGCAGGCATTTTTGAGTA-3′，反向引物R：5′-GTCTGCTGCTACAGTTGCCA-3′。

2、提取鸡血液DNA

(1)取10μL血液于1.5ml离心管中，加入600μL血液裂解液，加入20μL蛋白酶K，混匀。56℃消化过夜。其中，蛋白酶K的用量为0.4～0.5mg；血液裂解液的组成如下：100mMTris HCI(pH8.0)，100mM EDTA(pH8.0)，1％SDS，以水配制，定容至1L，室温保存。

(2)加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心15min。

(3)吸取上清至新离心管中，再加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心15min。

(4)吸取上清至新离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿(体积比1:1)混合液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。

(5)吸取上清至新离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。

(6)吸取上清至新离心管中，加入2倍体积冰乙醇，颠倒混匀，可见白色絮状沉淀。4℃，12000rpm离心20min。

(7)收沉淀，加入1200μL75％乙醇，4℃，12000rpm离心1h。

(8)收沉淀，挥发乙醇。加入50μL水，溶解DNA。

3、PCR扩增

反应体系：

其中，2×Taq PCR Mix的生产厂家为北京汇天东方科技有限公司，商品编号为HT201，规格为1×1ml/支。DNA浓度为20ng/μL以上。

反应程序：95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min；4℃保存。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

采用1.5％的琼脂糖凝胶，电泳电压为120V，电泳时间为30min。对于扩增出951bp目的片段的个体进行下一步实验。

5、BbvCI酶切

酶切体系：(20μL)

混匀后，37℃消化2h。

BbvCI内切酶的识别序列和酶切位点：GC↓TGAGG。经过酶切后，快羽个体的目的片段能够被切分为452bp、499bp两条带，慢羽纯合个体的目的片段不能切开，为单一条带，慢羽杂合个体的目的片段的一条核酸链也能被切开，形成452bp、499bp、951bp三条带。

6、琼脂糖凝胶电泳检测

采用2％的琼脂糖凝胶，电泳电压为120V，电泳时间为30min。判断标准为酶切产物只有长度为452、499bp的片段为快羽个体，酶切产物只有长度为951bp的片段为慢羽纯合个体，酶切产物有长度为452、499、951bp的片段为慢羽杂合个体。

7、本发明方法的准确性及适用范围

本发明在已知羽型的5个鸡品种中，利用血样或组织DNA，使用该方法进行鉴别，准确率达100％。根据本发明的鉴别结果，可选择相应的基因型个体培育纯系，建立雏鸡自别雌雄的配套系。

实验例1寿光鸡羽速类型鉴别

在中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地随机采集100份寿光鸡血液样品，其中母鸡20个，公鸡80个，所有样本均有快慢羽表型记录，并做过测交验证，也有基因型记录。按照上述方法提取DNA，进行PCR扩增，最后进行BbvCI酶切反应，鉴别结果与已知基因型及羽型一致。在山东省寿光市慈伦种鸡场的寿光鸡群体中，随机采集54个公鸡鸡冠组织，利用该方法鉴别其基因型，鉴别结果与已知快慢羽表型一致。由此可见，此方法对从具有代表性的两种不同养殖方式下饲养的寿光鸡中随机采集的样品的快慢羽鉴别准确率为100％。

实验例2白来航鸡羽速类型鉴别

在中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地随机采集30份白来航慢羽纯系公鸡血液样品，使用本发明的方法鉴别其基因型，鉴别结果与已知羽型一致，对所测样品的鉴别准确率为100％。

实验例3农大矮小鸡羽速类型鉴别

在中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地随机采集30份农大矮小鸡快羽纯系公鸡血液样品，使用本发明的方法鉴别其基因型，鉴别结果与已知羽型一致，对所测样品的鉴别准确率为100％。

实验例4北京油鸡羽速类型鉴别

在中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地随机采集20份已知羽型的北京油鸡鸡冠组织样品，其中母鸡12个，公鸡8个，使用本发明的方法鉴别其基因型，鉴别结果与已知羽型一致，对所测样品的鉴别准确率为100％。

实验例5茶花鸡羽速类型鉴别

在中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地随机采集20份已知羽型的茶花鸡公鸡血液样品，均为快羽个体。使用本发明的方法鉴别其基因型，鉴别结果与已知羽型一致，对所测样品的鉴别准确率为100％。

上述涉及的部分样本PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2-图3。

本发明提供了一种鸡快慢羽基因型鉴别的方法，且该方法在寿光鸡、白来航鸡、农大矮小鸡、北京油鸡、茶花鸡共计254个样品中鉴别准确率达100％。本方法还解决了快慢羽鉴别准确性不高、配套系培育时间长，鉴别时间受限制等问题。

对比例

将本发明与CN201310502809.X公开的鸡快慢羽基因型的鉴别方法及雏鸡雌雄鉴别方法进行比较。具体如下：

选取本发明鉴别过的16个已知表型的寿光鸡样品(其中10个来源于中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地，6个来源于山东省寿光市慈伦种鸡场)，6个白来航慢羽纯系公鸡样品，5个已知羽型的北京油鸡样品，4个农大矮小鸡快羽纯系公鸡样品，4个已知羽型的茶花鸡公鸡样品，采用CN201310502809.X方法鉴别快慢羽基因型，结果表明无论快羽还是慢羽均能被Taq I酶切，因此该方法无法鉴别寿光鸡、白来航鸡、农大矮小鸡、北京油鸡、茶花鸡的快慢羽基因型。上述涉及样本PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图4。酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图5-图6。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 鉴别鸡快慢羽基因型的方法

<130> KHP191111245.5

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacaggcagg catttttgag ta 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctgctgct acagttgcca 20

Claims

1.用于鉴别鸡快慢羽基因型的引物对，其特征在于，包括正向引物F和反向引物R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

2.含有权利要求1所述引物对的检测试剂或试剂盒。

3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

i)用于鉴别鸡快慢羽基因型；

ii)用于雏鸡雌雄鉴别。

4.用于鉴别鸡快慢羽基因型的方法，其特征在于，提取待测鸡的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，获得扩增产物，然后用BbvCI内切酶对扩增产物进行酶切，根据酶切产物的片段大小判断快慢羽基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因型的判断标准如下：酶切产物出现452bp和499bp两条特征条带，为快羽纯合基因型；酶切产物仅出现951bp一条特征条带，为慢羽纯合基因型；酶切产物出现452bp、499bp和951bp三条特征条带，为慢羽杂合基因型。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测酶切后产物片段的大小。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，电泳检测中琼脂糖凝胶浓度为1.5～2％；电泳条件为：120～150V，20～25min。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Mix10μL，ddH₂O 8μL，10μM正向引物F 0.5μL，10μM反向引物R 0.5μL，DNA 1μL；

其中，2×Taq PCR Mix是2倍浓缩的PCR扩增预混合溶液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液；

PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min，30～35个循环；72℃ 7min；4℃保存。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，酶切反应体系为：2U/μL酶BbvCI 1～2μL，10×Buffer 3μL，PCR扩增产物5μL，ddH₂O 10μL；酶切反应条件为：37℃，2～3h。

10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，基因组DNA的提取方法包括：

1)取5～10μL鸡血于1.5mL离心管中，加入600μL血液裂解液，加入20μL蛋白酶K，混匀；56℃消化过夜；

2)加入等体积饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，12000rpm离心15min；

7)收沉淀，加入1200μL 75％乙醇，4℃，12000rpm离心1h；

8)收沉淀，挥发乙醇；加入50～100μL水，溶解DNA。