CN107937568B

CN107937568B - 一种prlr基因的应用及其方法

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Publication number: CN107937568B
Application number: CN201810034223.8A
Authority: CN
Inventors: 张龚炜; 左福元; 张文秀; 吴雨徽; 刘安芳
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN107937568A

Abstract

本公开了一种PRLR基因的新应用及其方法，本发明利用Z染色体存在的176,324 bp串联重复序列与鸡快慢羽位点的连锁关系，采用荧光定量PCR方法对羽速基因候选基因PRLR和内参基因PCCA之间拷贝数变异的鉴定，反应结束后便可简洁直观的根据两者Ct值的差异判定基因型，实现同时区分鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄，同时本技术实验操作更为简便，可极大的降低选育快慢羽纯系鸡的育种时间与成本。

Description

一种PRLR基因的应用及其方法

技术领域

本发明属于动物育种技术领域，具体涉及一种鸡的快慢羽分子鉴定方法及应用。

背景技术

雌雄鉴别是现代养鸡生产中的重要技术，广泛应用于商品蛋鸡、肉鸡及种鸡生产中，以便淘汰公雏节约饲养成本、分性别饲养管理及提供单性别的种雏鸡保护育种成果。在地方鸡种生产中，公母的生长发育速度存在较大的差异，分群饲养管理更有利于提高经济收益。

翻肛鉴定和自别雌雄是目前常用的两类雌雄鉴别方法。翻肛鉴定是利用公、母雏退化交尾器的差别进行鉴定，即通过目测是否存在生殖突起进行区分公母，需对雌雄鉴别员进行特殊培训。而自别雌雄则利用位于鸡性染色体(Z染色体)上基因的伴性交叉遗传现象，在特定的交配模式下根据雏鸡出壳时的表型差异鉴定出壳雏鸡的性别。慢羽(K)对快羽(k)为显性，利用快羽公鸡(Z^kZ^k)与慢羽母鸡(Z^KW)交配，后代公雏全为慢羽(Z^KZ^k)，母雏全为快羽(Z^kW)，实现了雏鸡自别雌雄。快慢羽表型指在雏鸡出壳24小时以内，主翼羽长于覆主翼羽2mm以上为快羽型，其余为慢羽型。由于位于Z染色体的快慢羽位点不受鸡品种遗传背景限制，适合在不同鸡品种中应用推广。相比翻肛性别鉴定方法，其鉴别速度快，准确率高，不需要对鉴别人员进行技术培训，对雏鸡损伤小，交叉感染疾病的可能性小，因而在鸡雌雄鉴别中被广泛使用。

种鸡场建立快羽公鸡(Z^kZ^k)与慢羽母鸡(Z^KW)纯系是实现快慢羽自别雌雄的核心步骤。快羽公鸡纯系可由快羽公鸡和快羽母鸡交配获得，但慢羽纯系需要准确区分慢羽纯合和慢羽杂合公鸡，利用慢羽纯合公鸡与慢羽母鸡交配获得。由于慢羽为显性，因此，传统育种中需要对慢羽公鸡进行测交鉴定是慢羽纯合型还是慢羽杂合型，育种周期较长，建系投入较大。此外，利用快慢羽自别雌雄一般不能超过出壳后24小时。这使得快慢羽自别雌雄配套系建系时需从雏鸡开始，需要2-3个世代才能形成后代达到一定自别雌雄准确率(一般要求99％以上)的配套系，限制该技术推广应用。

利用在鸡Z染色体上找到的K基因位点相关序列变异进行快慢羽基因型鉴别已有报道，国内北京市华都峪口禽业有限责任公司的《鸡快慢羽基因型的鉴别方法及雏鸡雄雌鉴别方法技术》专利中，对鸡血样中的DNA进行PCR扩增，扩增引物为：正向引物F:5’-GCACATTCAAGTAAGCAGTAGTTT-3’，反向引物R:5’-AAAAAAAAAAAAAATTGCACTTTAATAGTACCATCTATTC-3’，获得长度为171bp的扩增产物，以Taq I内切酶对扩增产物进行酶切，存在长度分别为132bp和39bp的两种片段的，为慢羽纯合；存在长度分别为171bp、132bp和39bp的三种片段的，为慢羽杂合；扩增产物经酶切后只存在长度为171bp的片段的，为快羽纯合。而《鸡快慢羽分子鉴定方法》专利中，根据快慢羽等位基因的结构设计两对引物；提取已知快慢羽的鸡血样DNA，进行引物特异性实验，根据扩增DNA片段大小和有无来鉴定鸡是快羽还是慢羽。当只扩增出一条350bp带，判定该鸡为快羽型；当扩增出两条带350bp和909bp，确定为慢羽型。这两种方法虽然可以区分快羽、慢羽基因型，但对出壳雏鸡仍无法直接实现公母的区分；这两种方法在PCR扩增后需要酶切电泳或电泳进行基因型确定，试验操作相对比较繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PRLR基因的应用及其方法，本发明方法可以同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄，育种过程不需进行测交，加快地方鸡种快慢羽纯系培育速度，提高育种效率。相比已有的快慢羽基因型分子标记技术，实现纯系建系过程中减少公鸡饲养量的目的。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种PRLR基因的应用，其特征在于：通过荧光定量的方法扩增鸡源DNA的PRLR基因实现同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄。

一种同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄的方法，该方法包含下列步骤：

1.获取鸡血液或组织样本，进行DNA提取；

取鸡血(5μL)或组织(30mg)，基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取；

2.根据鸡PRLR基因和PCCA基因设计引物进行荧光定量PCR扩增

选择羽速基因的候选基因PRLR基因，设计引物PCR扩增正向引物如序列表SEQ IDNO:1所示，反向引物为如序列表SEQ ID NO:2所示；设计内参基因PCCA基因PCR扩增正向引物如序列表SEQ ID NO:3所示，反向引物如序列表SEQ ID NO:4所示，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度，同一个DNA样本同时进行PRLR和PCCA基因的荧光定量PCR扩增，每个样本进行2个平行重复；

3.计算PRLR基因和PCCA基因间Ct值差异判定基因型

PRLR基因和PCCA基因间Ct值差异即为ΔCt，ΔCt＝PRLR基因Ct-PCCA基因Ct，当ΔCt≤-1.80时为慢羽纯合公鸡(Z^KZ^K，4copy)，-1.65≤ΔCt≤-1.45为慢羽杂合公鸡(Z^KZ^k，3copy)，-1.10≤ΔCt≤-0.80为快羽公鸡(Z^kZ^k，2copy)或慢羽母鸡(Z^KW，2copy)，-0.2≤ΔCt≤0.1为快羽母鸡(Z^kW，1copy)。

一种同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄的试剂盒，其特征在于：包含上述的引物对或含有PRLR基因的标准品。

一种同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄的基因芯片，其特征在于：它包含上述的PRLR基因。

本发明获得的有益效果：

本发明利用Z染色体存在的176,324bp串联重复序列与鸡快慢羽位点的连锁关系，在Z染色体上，快羽位点k的176.3kb片段中包含PRLR和SPEF2两个基因，即1个拷贝(copy)；而慢羽位点K中PRLR和SPEF2基因存在部分重复，形成PRLR和SPEF2基因串联重复序列，即PRLR和SPEF2基因的大部分序列有2个拷贝。PCCA基因位于1号染色体，在基因组中只存在1个拷贝，作为内参基因。采用荧光定量PCR方法对PRLR基因和PCCA基因之间拷贝数变异(copy number variation，CNV)的鉴定，同时区分快慢羽基因型和公母，即慢羽纯合公鸡(Z^KZ^K)为4copy，慢羽杂合公鸡(Z^KZ^k)3copy，快羽公鸡(Z^kZ^k)和慢羽母鸡(Z^KW)都为2copy，快羽母鸡(Z^kW)为1copy)。

本发明一方面可应用于快慢羽纯系建立过程中，从雏鸡中直接筛选快羽公鸡(Z^kZ^k，2copy)与快羽母鸡(Z^kW，1copy)建立快羽纯系，慢羽纯合公鸡(Z^KZ^K，4copy)与慢羽母鸡(Z^KW，2copy)建立慢羽纯系，淘汰慢羽杂合公鸡(Z^KZ^k，3copy)，实现纯系建系过程中减少公鸡饲养量，缩短快慢羽自别雌雄配套系培育时间，节省培育成本。另一方面，可直接在地方鸡种的成年鸡繁殖群体中，直接筛选快羽公鸡(Z^kZ^k，2copy)和慢羽母鸡(Z^KW，2copy)交配，快速实现后代快慢羽速自别雌雄的目的，这种策略在地方鸡种中快速建立自别雌雄生产群有很好的应用前景。

1、本发明根据PRLR和PCCA基因Ct值的范围，不仅可以区分快慢羽基因型还可以在出壳时区分公母，实现在快慢羽纯系建系过程中减少公鸡饲养量的目的。本发明之前已有的两种快慢羽基因型分子标记技术，对初生雏鸡虽能区分三种类型，但无法同时区分出壳雏鸡的公母性别。2、本发明可在雏鸡出壳时区分慢羽纯合基因型和慢羽杂合基因型，在出壳时就可选择慢羽纯合基因型个体，淘汰慢羽杂合个体；而传统测交试验区分慢羽纯合基因型和杂合基因型，至少需要将育种个体饲喂至性成熟(约180日龄左右)才能开展测交试验，且测交试验繁琐。3、本发明可在雏鸡未区分快慢羽的成年种鸡中直接筛选出快羽公鸡和慢羽母鸡，实现快速建立后代雏鸡快慢羽自别雌雄的种鸡交配群，适用于地方鸡种的快慢羽自别雌雄体系的推广。4、本发明利用荧光定量PCR方法，在PCR结束后便可简洁直观的根据Ct值的差异判定基因型，相对于普通PCR扩增后酶切电泳确定基因型，实验操作更为简便。因此，本发明可极大的降低选育快慢羽纯系鸡的育种时间与成本。

附图说明

图1：ΔCt值判定慢羽纯合公鸡(Z^KZ^K，4copy)图。

图2：ΔCt值判定慢羽杂合公鸡(Z^KZ^k，3copy)图。

图3：ΔCt值判定快羽公鸡(Z^kZ^k，2copy)或慢羽母鸡(Z^KW，2copy)图。

图4：ΔCt值判定快羽母鸡(Z^kW，1copy)图。

图5：Bio-rad CFX96 PCR仪自带软件所计算的样本拷贝数值。

具体实施方式

1.获取鸡血液进行DNA提取

取鸡血(5μL)或组织(30mg)，基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取。

2.根据鸡PRLR和PCCA基因设计引物进行荧光定量PCR扩增

选择羽速基因的候选基因PRLR基因，设计引物PCR扩增正物:5’-CCGTGGACAACATTCAATATCACT-3’，反向引物为5’-GGATCCGAGCTGTTACTTCCAA-3’；内参基因PCCA基因PCR扩增正向引物:5’-CAGACACACAGAGCCCATCTCT-3’，反向引物:5’-TGGAGCAG TGGTGGCTGTT-3’，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度。

PCR反应体系为10μL：5μL 2x SuperReal PreMix(SYBR Green，TAKARA)，3.2μLddH₂O，上下游引物各0.4μL，DNA模板1μL。

反应程序：95℃变性3min；95℃变性10s，60℃退火30s，循环40次；95℃10s；熔解曲线温度范围为65℃到95℃，增量温度区间为0.5℃，每个增量温度保持5s。

同一个DNA样本，同时进行PRLR和PCCA基因的荧光定量PCR扩增，每个样本进行2个平行重复。本技术体系中荧光定量为Bio-rad CFX96 PCR仪。

3.计算PRLR基因和PCCA基因间Ct值差异判定基因型

达到仪器检测最低阈值线的最小PCR循环数称为Ct值。因此，根据荧光定量PCR的原理，如果个体拷贝数越大则Ct值越小，拷贝数少的个体其Ct值变大。本技术中，PRLR是需要检测拷贝数变异的靶基因，位于常染色体只存在1个拷贝的PCCA作为内参基因。如果通过同一个体同时检测PRLR和PCCA基因的Ct值，根据公式copy number＝2^-ΔCt可以计算出样本中PRLR基因的拷贝数，其中ΔCt＝PRLR基因Ct值-PCCA基因Ct值。理论上，当ΔCt＝-2时PRLR为4拷贝，ΔCt＝-1.585时PRLR为3个拷贝，ΔCt＝-1时PRLR为2个拷贝，ΔCt＝0时PRLR为1个拷贝。由于PRLR和PCCA基因的扩增效率差异及试验操作存在一定的系统性误差。因此，本技术体系中，当ΔCt≤-1.80时为慢羽纯合公鸡(Z^KZ^K，4copy)，-1.65≤ΔCt≤-1.45为慢羽杂合公鸡(Z^KZ^k，3copy)，-1.10≤ΔCt≤-0.80为快羽公鸡(Z^kZ^k，2copy)或慢羽母鸡(Z^KW，2copy)，-0.2≤ΔCt≤0.1为快羽母鸡(Z^kW，1copy)，详情见图1-4。(注：由于使用的荧光定量PCR仪及SYBR Green试剂等不同可能会造成不同基因型的ΔCt值范围不同于本技术体系中的数值。在实践应用中，可以通过利用已知基因型的DNA样本来判定特定PCR体系中基因型所对应ΔCt值范围。因此，即使在不同实验室或PCR体系条件下，仍可以完成基因型判定的定性要求。)同时，以快羽母鸡(Z^kW，1copy)作为对照样本，利用Bio-rad CFX96 PCR仪自带计算软件，可直接计算出各样本的拷贝数，详图见1-5。

为了检验上述方法的可靠性，选择10只公鸡与20只母鸡进行基因型分析，随后根据测定的基因型进行交配，收集种蛋孵化后对64只雏鸡进行快慢羽鉴定并剖检确定性别。交配组合分别为：慢羽纯合公鸡(Z^KZ^K)与慢羽母鸡(Z^KW)，后代4拷贝雏鸡为慢羽公鸡，2拷贝雏鸡为慢羽母鸡；快羽公鸡(Z^kZ^k)与快羽母鸡(Z^kW)交配，后代2拷贝为快羽公鸡，1拷贝为快羽母鸡；慢羽杂合公鸡(Z^KZ^k)与快羽母鸡(Z^kW)交配，后代3拷贝雏鸡为慢羽公鸡，2拷贝雏鸡为快羽公鸡或慢羽母鸡，1拷贝为快羽母鸡。总共94个样本的验证结果显示，本技术鉴定基因型的准确性达96％，鉴定公母性别的准确率达98％。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种PRLR基因的新应用及其方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ccgtggacaa cattcaatat cact 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ggatccgagc tgttacttcc aa 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cagacacaca gagcccatct ct 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tggagcagtg gtggctgtt 19

Claims

1.一种同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄的方法，其特征在于：该方法包含下列步骤：

（1）提取鸡基因组DNA；

（2）根据所述鸡源DNA的PRLR基因和PCCA基因设计引物进行荧光定量PCR扩增；

（3）计算PRLR基因和PCCA基因间Ct值差异判定基因型；

其中鸡源DNA的PRLR基因的正向引物：如序列表SEQ ID NO:1和反向引物如序列表SEQID NO:2所示，PCCA基因的正向引物：如序列表SEQ ID NO:3和反向引物如序列表SEQ IDNO:4所示。

2.一种PRLR基因的应用，其特征在于：所述应用具体是通过如权利要求1所述荧光定量的方法PCR扩增鸡源DNA的PRLR基因实现同步鉴定鸡快慢羽基因型、慢羽纯/杂合性及雏鸡雌雄。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增鸡源DNA的PRLR基因是通过正向引物：如序列表SEQ ID NO:1和反向引物如序列表SEQ ID NO:2扩增得到，其扩增循环数40次。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述鸡基因组DNA来自鸡血液或组织。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述选择的PRLR基因为羽速候选基因，PCCA基因为内参基因。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应程序：

95℃变性3min；95℃变性10s，60℃ 退火30s，循环40次；95℃ 10s；熔解曲线温度范围为65℃到95℃，增量温度区间为0.5℃，每个增量温度保持5s。