CN116287318B - 一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，包括：S1、对石岐杂个体进行快慢羽鉴定，选留父本并以如皋黄鸡作为母本，杂交得到F1代；S2、在F1代中再次进行快慢羽鉴定，选留公鸡作为父本，选留母鸡作为母本；S3、利用PCR方法鉴定对留做公母鸡亲本F1代的快慢羽基因型进行判定；S4、将F1代中鉴定出的纯合慢羽母鸡和纯合慢羽公鸡进行横交固定，产生F2代；S5、使用活性检测试剂盒对选留的纯合型慢羽F2代进行繁殖性状基因型判定，选留有利基因型个体，快速建立高繁群体。本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可培育出高繁可自别雌雄的优质肉鸡新品系。
Description
技术领域
本发明属于家禽分子育种的技术领域，更具体地涉及一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法。
背景技术
在畜禽生产中，动物的性别与许多生产性能有关。在蛋鸡，母鸡相对于公鸡有更高的应用价值，而对肉仔鸡而言，公鸡的生长速度于体重比母鸡好。且在饲养过程中，公鸡和母鸡的生长速度存在一定的差异，因此在实际生产养殖过程中，为了提高养殖鸡只的均匀度和出栏时间的一致性。通常会将公鸡和母鸡进行分群饲养。雌雄鉴别技术是对家禽初生雏雌雄辨认的一种技术，该技术能够给家禽养殖场提供单性别的种雏鸡，以达到减少养殖空间和饲料成本的目的，进而增加经济效益。目前，采用的还是传统的翻肛鉴别法，翻肛鉴别法费事费力，对工作人员有一定的技术要求，需要进行较长时间的技能培训，同时对初生雏鸡有不可避免的伤害，也容易传播疾病，造成损失。
快慢羽自别雌雄技术则利用位于鸡性染色体上K基因的伴行交叉遗传现象，通过翅尖羽毛表型差异（快慢羽）鉴定雏鸡的性别，是对鸡性别鉴别运用较广泛的分子技术之一。公鸡和母鸡各有一对性染色体，公鸡的性染色体组成为ZZ，母鸡的性染色体组成为ZW，Z、W为同源染色体。雏鸡翅膀上的羽毛有主翼羽和覆主翼羽，根据主翼羽和覆主翼羽的长短分为快羽型和慢羽型。控制快慢羽这一表型的基因位点K性连锁，且位于性染色体Z上，其等位基因K为显性和k为隐性。当公鸡和母鸡的基因型分别为ZkZk和ZkW时，表型为快羽型;当公鸡的基因型为ZKZk或ZKZK，母鸡的基因型为ZKW时，表型为慢羽型，所以快羽为隐性，慢羽为显性。根据孟德尔遗传定律和伴性遗传原理，要使杂交后代中公鸡的表型为慢羽型，母鸡的表型为快羽型，需要其父母代公鸡的基因型为ZkZk，母鸡的基因型为ZKW。根据快慢羽伴性遗传规律，快羽为隐性，其表现型与基因型一致；慢羽母鸡性染色体为异型染色体，在Z染色体上只含有1个K基因，属显性遗传，表现型与基因型也一致；慢羽公鸡的性染色体为异型染色体，在2条Z染色体上各有1个K(或k)基因，对于基因型是ZKZk或ZKZK的公鸡，其表型均属慢羽，因此必须从慢羽公鸡中找出基因型为ZKZK的纯合慢羽公鸡，淘汰基因型为ZKZk的杂合慢羽公鸡，传统的采用的方法是测交，即用快羽母鸡或慢羽母鸡测交慢羽公鸡，淘汰子代中出现非慢羽鸡的杂合慢羽公鸡。其工作量比较大，且费人力物力，因此用分子手段进行选育十分必要。
慢羽基因位点K具有复杂的分子结构，与快慢羽表达关联的DNA区域包括催乳素受体基因(PRLR)和精子鞭毛编码蛋白2(SPEF2)基因。慢羽个体除了正常的PRLR和SPEF2基因外，还有PRLR和SPEF2不完全、不规则的复制片段。在复制区域，PRLR部分片段(dPRLR)和SPEF2部分片段(dSPEF2)连接在一起，连接点叫做断点连接点(JS)。也可能具有内源病毒基因ev21，其所在的区域被成为控制区域(OR)，相应位置没有ev21的区域叫做非控制区域(UR)。快羽型个体K基因位点仅含有PRLR和SPEF2基因或OR，不含JS。
石岐杂鸡由广东惠阳鸡、清远麻鸡和石岐鸡与引进的新汉夏、白洛克、科尼什等外来鸡种杂交改良而成，其肉质与惠阳鸡相仿，生长速度比广东惠阳鸡、清远麻鸡和石岐鸡三个地方鸡快，具有黄毛、黄皮、黄脚，短脚、圆身、薄皮、细骨、肉厚、味浓等特征。但是繁殖性能相对较低。江苏省家禽科学研究所于80年代在广东引入该鸡种，在长期的饲养过程中发现其有慢羽的特点。
如皋黄鸡属肉蛋兼用型地方鸡资源，产蛋量相对其他地方鸡品种较高，产蛋高峰期产蛋率可达85%以上。体型中等偏小，具有“三黄”（喙色、羽色、胫色）特征，公鸡颈、翼、尾羽尖端夹有少量黑羽，母鸡羽毛呈淡黄色，皮薄呈黄色。肌纤维紧密、富有弹性，肌间脂肪分布均匀，肉质嫩滑细腻，肉香汤鲜，清澈味美。
控制繁殖性状的基因有多个，利用本研究室发明的专利“鸡繁殖基因启动区SNP分型及启动子活性检测试剂盒”对繁殖性状基因进行分型（专利号ZL201420683451.5），并保留有利基因个体，淘汰不利基因个体，快速建立高繁群体。
综上所述，本发明利用石岐杂和如皋黄鸡的特点提出一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法以期为快速鉴别公母雏且具有高繁特性黄羽肉鸡的配套生产解决一定的技术问题。
发明内容
本发明的目的是在于克服传统育种方法时间长的缺陷，寻找一种快速、可靠的用于鸡慢羽基因和高繁基因鉴定的分子生物学方法，快速培育出一种高繁可自别雌雄的优质肉鸡新品系，可用于优质自别雌雄黄羽肉鸡配套生产。本发明建立的方法，可以快速鉴定伴性慢羽基因和高繁基因，扩大携带伴性慢羽基因和高繁基因的繁殖群体，缩短育种时间。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案如下，一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，包括以下步骤：
S1：对刚出雏石岐杂个体进行快慢羽鉴定，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的个体即慢羽型公鸡作为父本，如皋黄鸡作为母本，组建60个家系，其中每个家系中公鸡与母鸡的配比为1:10，采用避免近郊的家系间随机交配的方式培育得到F1代；
S2：在F1代中同样进行快慢羽鉴定，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的慢羽型公鸡作为父本，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的慢羽型母鸡作为母本；
S3：利用PCR方法鉴定对留做公母鸡亲本F1代的快慢羽基因型进行判定；
S4：将F1代中鉴定出的纯合慢羽母鸡和纯合慢羽公鸡进行横交固定，产生F2代；
S5：静翅脉采集F2代70日龄公母鸡血液1ml左右，采用蛋白酶K与酚氯仿法提取鸡基因组DNA，并用活性检测试剂盒对繁殖性状基因进行基因型判定，选留有利基因型个体，快速建立高繁群体。
进一步改进在于：所述S1中与快慢羽表达关联的DNA区域包括催乳素受体基因(PRLR)、精子鞭毛编码蛋白2基因(SPEF2)、不完全、不规则的SPEF2基因复制片段（dSPEF2）、不完全、不规则的PRLR基因复制片段（dPRLR）、dSPEF2/dPRLR的连接位点（JS）、内源性病毒（ev21）、ev21所在的区域被称为占据区(OR)，相应位置没有ev21的区域叫做未占据区（UR），UR和OR是对应的区域。k基因在其区域有PRLR、SPEF2基因和UR或者OR，K基因除了PRLR、SPEF2基因和UR外，还有融合的dSPEF2/dPRLR基因或OR。
进一步改进在于：所述S3中以鸡基因组（鸡基因组版本号Gallus_gallus-5.0/galGal5）为参考序列，设计引物P1扩增PRLR的下游区域和ev21的下游区域，扩增片段为1943bp，设计引物P2扩增PRLR的下游和JS区域的下游区域，扩增片段为2128bp；静翅脉采集F1代所有个体的血液，提取基因组DNA，用引物对P1和引物对P2同时进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测后根据根据结果判断个体是否含有慢羽基因K，从而快速判断鸡的快慢羽。
进一步改进在于：所述S3中，当ev21存在或不存在时均为k基因，表现为快羽，P1引物PCR扩增出1943bp条带或空条带；当JS不存在时为k基因，表现为快羽，P2引物PCR扩增空条带；当JS存在时为K基因，表现为慢羽，P2引物PCR扩增出2128bp条带。
进一步改进在于：所述用P1引物PCR扩增的反应体系为25.0 μL，所述反应体系由以下成分组成：10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL（2 mmol/L），Taq DNA聚合酶(5 U/μL ) 1.0 μL，所述P1上游引物为1.0μL、下游引物均为1.0ul， DNA模板1.0 μL，ddH2O 16.5μL。
进一步改进在于：所述用P2引物PCR扩增的反应体系为25.0 μL，所述反应体系由以下成分组成：10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL（2 mmol/L），Taq DNA聚合酶(5 U/μL ) 1.0 μL，所述引物P2的上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 16.5.0 μL。
进一步改进在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。P1和P2的退火温度分别为63℃和67℃。
进一步改进在于：所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤为：取7.0ul PCR扩增产物与1.0ul 6×Loading Buffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V电压下45 min，凝胶成像系统拍照。
一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法在高繁慢羽优质肉鸡新品系分子鉴定标记中的应用。
本发明有益效果为：
本发明方法可以快速判断出控制有快慢羽基因的不完全、不规则的PRLR基因和SPEF基因的复制片段（dPRLR），找出K基因的慢羽型个体；另用活性检测试剂盒对繁殖性状基因进行分型，找出高繁殖性状个体；本发明直接用受测鸡种的基因组DNA为模板，采用分子辅助选择技术检测快慢羽基因和繁殖基因片段大小，操作简单、检测快速、结果准确、通用性强、成本低廉，能有效避免测交选育的繁琐，缩短选育的世代间隔，加快育种进程，降低育种成本；用本方法选育的一种高繁慢羽优质肉鸡新品系具有产蛋率高、肉味鲜美、饲养密度大、饲料报酬高、慢羽纯基因的特点，可作为商品鸡直接进行生产，也可以配套应用；用快羽公鸡（ZkZk）配慢羽母鸡（ZKW），后代公雏表现为慢羽（ZKZk），母雏表现快羽（ZkW），从而能实现雏鸡的自别雌雄，因此，可以根据生产目的的不同，选择不同性别个体进行培育，以达到提高经济效益及育种效率的目的；
本发明公开了一种高繁慢羽优质肉鸡新品系选育方法的分子鉴别标记的应用。通过快慢羽基因k和K的PCR扩增引物P1和P2和PCR反应试剂检测快慢羽基因，通过P1和P2基因的扩增片段大小即可判断出纯合快慢羽基因，方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。
同时本发明应用于一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的选育方法的鉴定，设计合理，使用方便、结果可靠且成本低廉。
附图说明
图1为本发明快慢羽基因位点结构图。
图2为本发明引物P1扩增区域示意图。
图3为本发明引物P2扩增区域示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。
根据图1、图2、和图3所示，本实施例提供一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，包括以下步骤：
（1）对具有慢羽基因的石岐杂雏鸡进行快慢羽鉴定，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的个体即慢羽型公鸡作为父本，如皋黄鸡作为母本，生产出F1代；
（2）对F1代刚出雏的个体进行快慢羽鉴定，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的慢羽型公鸡作为父本，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的慢羽型母鸡作为母本。
（3）利用PCR方法鉴定对留做公母鸡亲本F1代的快慢羽基因型进行判定，具体包括以下步骤：
①样品的采集
对F1代选留慢羽型公母鸡静翅脉采血1.5ml，加入含有0.5ml抗凝剂的离心管中，用蛋白酶K法提取血液DNA，于4℃冰箱保存备用。
②引物设计
以鸡基因组（鸡基因组版本号Gallus_gallus-5.0/galGal5）为参考序列，跨PRLR基因和ev21基因设计快羽基因鉴别引物对P1，跨PRLR基因和JS区设计慢羽基因鉴别引物P2。说明书附图1为快慢羽基因位点结构图，说明书附图2为引物P1扩增区域（箭头表示引物设置位置，数字表示PCR产物大小），说明书附图3为引物P2扩增区域（箭头表示引物设置位置，数字表示PCR产物大小）。
如下所示：
所述的引物对P1为：
上游引物，P1-F：5' AGGACTAGCTCTTTTCTTCACTTCT 3'；
下游引物，P1-R：5' TTACACTTTATTTGAGGAGTTGGAT 3'。
所述引物对P2为：
上游引物，P2-F：5' ATCATACAAACCCAGTGAGAGCAGT 3'
下游引物，P2-R：5' CAACATTCGTATTTGTGGTATTCAG 3'
③PCR扩增
以引物对P1为引物建立25.0μL扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL（2 mmol/L），Taq DNA聚合酶(5 U/μL ) 1.0 μL（购自北京天根生物有限公司），P1上游引物为1.0μL、P1下游引物均为1.0ul， DNA模板1.0 μL，ddH2O 16.5 μL。
反应程序为：
95℃预变性5min，95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。
以引物对P2为引物建立25.0μL扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL（2 mmol/L），Taq DNA聚合酶(5 U/μL ) 1.0 μL（购自北京天根生物有限公司），P1上游引物为1.0μL、P1下游引物均为1.0ul， DNA模板1.0 μL，ddH2O 16.5 μL。
反应程序为：
95℃预变性5min，95℃变性30s，67℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。
④PCR扩增产物的检测与结果判定
各取7.0μLP1和P2引物对PCR扩增后产物，3.0μL 6×Loading Buffer, 1.5%的琼脂糖凝胶电泳（电泳电压：120V；电泳时间：30min）点样，电泳结束后，用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶照相检测，根据电泳图谱中出现的条带大小进行快慢羽判定：引物P1扩增出1943bp条带或空条带，及引物P2扩增为空条带，即为快羽基因k；引物P2扩增出2128bp条带，即为慢羽基因K。
（4）根据基因型判定结果，选留基因型为公鸡（ZKZK）个体，母鸡（ZKW）个体，淘汰快羽公鸡（ZkZk），快羽母鸡（ZkW）及杂合型慢羽公鸡（ZKZk），得到纯合慢羽公鸡和慢羽母鸡。
（5）将F1代中鉴定出的纯合慢羽母鸡和纯合慢羽公鸡进行横交固定，产生F2代。
（6）利用“鸡繁殖基因启动区SNP分型及启动子活性检测试剂盒”测定F2代中高繁基因型个体。具体包括以下步骤：
①样品的采集
对F2代选留的纯合慢羽公、母鸡静翅脉采血1.5ml，加入含有0.5ml抗凝剂的离心管中，用蛋白酶K法提取血液DNA，于4℃冰箱保存备用。
②PCR扩增
用“鸡繁殖基因启动区SNP分型及启动子活性检测试剂盒”进行繁殖性状基因PCR扩增，建立25.0μL扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL（2 mmol/L），Taq DNA聚合酶(5 U/μL ) 0.5 μL（购自北京天根生物有限公司），P3上、下游引物均为1.0 μl，DNA模板1.0 μL，ddH2O 17.0 μL。
反应程序为：
95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。
④PCR扩增产物的检测与结果判定
取7.0μLPCR扩增后产物，3.0μL 6×Loading Buffer，1.5%的琼脂糖凝胶电泳（电泳电压：120V；电泳时间：30min）点样，电泳结束后，用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶照相检测，进行繁殖性状基因判刑。
（7）根据基因型判定结果，选留高繁殖性状有利基因型纯合个体，生产出一种高繁慢羽优质肉鸡新品系。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (6)
1.一种高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对刚出雏石岐杂个体进行快慢羽鉴定，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的个体即慢羽型公鸡作为父本，如皋黄鸡作为母本，组建60个家系，其中每个家系中公鸡与母鸡的配比为1:10，采用家系间随机交配的方式培育得到F1代；
S2：在F1代中同样进行快慢羽鉴定，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的慢羽型公鸡作为父本，选留主翼羽小于或等于覆翼羽的慢羽型母鸡作为母本；
S3：利用PCR方法鉴定对留做公母鸡亲本F1代的快慢羽基因型进行判定；
所述PCR以鸡基因组版本号Gallus_gallus-5.0/galGal5为参考序列，设计引物对P1扩增PRLR的下游区域和ev21的下游区域，扩增片段为1943bp，设计引物对P2扩增PRLR的下游区域和JS的下游区域，扩增片段为2128bp；
所述引物对P1为：上游引物，P1-F：5' AGGACTAGCTCTTTTCTTCACTTCT 3'；
下游引物，P1-R：5' TTACACTTTATTTGAGGAGTTGGAT 3'；
所述引物对P2为：上游引物，P2-F：5' ATCATACAAACCCAGTGAGAGCAGT 3'；
下游引物，P2-R：5' CAACATTCGTATTTGTGGTATTCAG 3'；
静翅脉采集F1代所有个体的血液，提取基因组DNA，用引物对P1和引物对P2同时进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测后根据结果判断个体是否含有慢羽基因K进行鸡的快慢羽判断；
所述快慢羽判断的方法为：当为k基因时，表现为快羽，P1引物PCR扩增出1943bp条带或空条带；当JS不存在时为k基因，表现为快羽，P2引物PCR扩增空条带；当JS存在时为K基因，表现为慢羽，P2引物PCR扩增出2128bp条带；
S4：将F1代中鉴定出的纯合慢羽母鸡和纯合慢羽公鸡进行横交固定，产生F2代；
S5：静翅脉采集F2代70日龄公母鸡血液1mL，采用蛋白酶K与酚氯仿法提取鸡基因组DNA，并使用检测试剂盒进行基因型判定，选留繁殖性状有利基因型个体。
2.根据权利要求1所述的高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，其特征在于，所述S3用P1引物PCR扩增的反应体系为25.0μL，所述反应体系由10×PCR Buffer 2.5μL、2mmol/L的dNTP 2.0μL和5U/μL的Taq DNA聚合酶1.0μL组成，所述引物P1上、下游引物均为1.0μL，DNA模板1.0μL、ddH2O 16.5μL。
3.根据权利要求1所述的高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，其特征在于，所述S3用P2引物PCR扩增的反应体系为25.0μL，所述反应体系由10×PCR Buffer 2.5μL、2mmol/L的dNTP 2.0μL和5U/μL的Taq DNA聚合酶1.0μL，所述引物P2的上、下游引物均为1.0μL，DNA模板1.0μL、ddH2O 16.5μL。
4.根据权利要求1所述的高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，其特征在于，所述S3中，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存；引物P1和引物P2的退火温度分别为63℃和67℃。
5.根据权利要求1所述的高繁慢羽优质肉鸡新品系的制种方法，其特征在于，所述S3中，所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤具体为取7.0μL PCR扩增产物与1.0μL 6×LoadingBuffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳120V电压下处理45min，随后使用凝胶成像系统拍照。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法在高繁慢羽优质肉鸡新品系建立中的应用。
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