CN111979332B

CN111979332B - 用于选择母鸡储精能力期间受精率的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111979332B
Application number: CN201910433599.0A
Authority: CN
Inventors: 李世军; 南九红; 赛义德.阿里.阿自木; 彭秀丽; 龚炎长; 俸艳萍; 盛哲雅; 朱桂玉; 莫长欢; 周鑫; 周慧敏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN111979332A

Abstract

本发明提供了一种用于选择母鸡储精能力期间受精率的SNP分子标记及其应用，通过全基因组关联分析（GWAS）和限制性内切酶长度多态性（PCR‑RFLP）技术方法，首次在母鸡基因组3号染色体上筛选到6个与母鸡储精能力期间受精率相关联的SNP分子标记，这些SNP位点的多态性与母鸡的储精能力期间的受精率（授精一次至母鸡产出最后一枚受精蛋之间受精蛋个数所占产蛋个数的百分率）显著关联，所述的SNP分子标记可以分别单独用于选择和改良母鸡的受精率。

Description

用于选择母鸡储精能力期间受精率的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于家畜繁殖性状的分子标记选择技术领域，具体涉及鸡3号染色体上6个与母鸡储精能力期间的受精率相关的SNPs分子标记及其应用。

背景技术

母鸡储精能力期间受精率是指母鸡在储精能力期间所产受精蛋与这个期间总产蛋数的百分比；母鸡的储精能力是指母鸡在自然交配或者人工授精(Artificialinsemination，AI)之后能够储存精子并持续产受精蛋的能力(Duration of fertility)。在许多品种或品系的群体中，研究者发现母鸡的储精能力均会存在明显的个体差异，反映为一次自然交配或者人工授精后母鸡产受精蛋个数(FN，The number of fertile eggsafter AI)或持续天数(DN，The days post-insemination until the last fertile egg)的差异。在目前大规模集约生产中人工授精技术被普遍采用的情况下，选择储精能力长的母鸡，对母鸡储精性状进行改良，能够有效地降低种蛋生产过程中人工授精的频率，进而减少种公鸡的饲养量，从而减少饲养成本，同时减少母鸡对人工授精产生的应激反应，增加生产效益。然而，在母鸡储精能力期间受精率不同个体是有很大差异的，只有选择在母鸡储精能力期间高受精率的个体，才能真正使母鸡储精能力得到有效利用。利用全基因组关联分析(GWAS)检测与性状相关联的SNPs及基因组区域，可大大提高工作效率和统计效力，而利用限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP，restricted fragment length polymorphism)分析方法在大群体里对GWAS筛选的SNPs进行验证，可进一步确定SNPs的功能，降低GWAS结果的假阳性。本研究是利用鸡全基因组SNP芯片(600K，Affymetrix)对母鸡储精能力期间受精率的表型变异进行全基因组关联分析，在全基因组范围内检测与母鸡储精能力期间受精率性状相关联SNPs及基因组区域，并利用PCR-RFLP方法在大群体对显著SNPs功能进行验证。该项研究工作在国家基金(项目编号：31772585)，湖北省畜禽优质增效与绿色养殖科技创新行动(项目编号：2018skjcx05)，华中农业大学自主创新基金(2662018PY088)及西藏自治区重点研发及转化计划(CGZH2017000237)资助下完成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于选择母鸡储精能力期间受精率的SNP分子标记及其应用，通过全基因组关联分析首次在母鸡3号染色体上筛选到6个与储精能力期间受精率相关联的SNP分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

用于选择母鸡储精能力期间受精率的SNP分子标记，位于3号染色体，包括6个SNP分子标记，可以单独用于母鸡储精能力期间受精率选择和改良，所述分子标记的核苷酸序列及多态性位点具体如下：

分子标记1(SNP编号是AX-76582632)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第51位碱基R是C或T，导致多态性，CT是有利于母鸡储精期间受精率的基因型。

分子标记2(SNP编号是AX-76530282)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第51位碱基R是A或G，导致多态性，AG是有利于母鸡储精期间受精率的基因型。

分子标记3(SNP编号是AX-76530329)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第51位碱基R是C或A，导致多态性，AC是有利于母鸡储精期间受精率的基因型。

分子标记4(SNP编号是AX-76529310)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，第51位碱基R是C或T，导致多态性，CT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

分子标记5(SNP编号是AX-80813697)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，第51位碱基R是A或T，导致多态性，AT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

分子标记6(SNP编号是AX-76582809)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，第51位碱基R是A或G，导致多态性，AG是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

上述SNP分子标记通过下述方法筛选获得：

1)实验样品采集：采集试验鸡血样用于DNA提取；人工授精后收集试验鸡产蛋用于测定母鸡储精能力性状；

2)母鸡储精能力期间受精率的测定：测量试验鸡一次人工授精后母鸡产受精蛋个数和总产蛋个数的百分比，重复测量三次，每次20天，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的储精能力期间受精率的表型值；

3)鸡基因组DNA的提取与检测：从试验鸡血样中提取鸡基因组DNA，制备母鸡全基因组DNA样品；

4)基因型判定及基因型与鸡储精能力的关联分析：将试验鸡血样中提取的基因组DNA在与鸡600K高密度SNP芯片(Affymetrix Axiom)杂交，然后采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，利用MVP统计分析软件将试验储精能力与基因型进行关联分析，从中选取p值排名前35的SNPs，并利用限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP，restricted fragment length polymorphism)技术在大群中对这些SNPs的显著性进行验证。

所述的6个SNP分子标记的多态性与母鸡储精能力期间受精率显著关联(P<0.05)，可以单独用于母鸡储精期间受精率性状的选择及改良。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明首次运用全基因组关联分析(GWAS,Genome wide association study)技术方法在母鸡全基因组范围内筛选得到与鸡储精能力期间受精率相关的SNPs分子标记，进一步采用限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP，restricted fragment lengthpolymorphism)分析方法在扩大的群体里对这6个SNP与鸡储精能力期间受精率的相关性进行了验证。利用分子标记辅助育种，为母鸡储精能力期间受精率的选择和改良提供了3号染色体上6个新的SNP分子标记。

具体实施方式

实施例1与母鸡储精能力期间受精率相关的SNP分子标记的筛选

1)实验样品采集：

试验群体为701只健康母鸡，来源于“京红1号”蛋鸡核心育种鸡场父母代群体(400日龄)，所有母鸡同批次孵化而来。饲养于荆州峪口禽业有限公司，执行单笼饲养，14小时光照制度，自由采食及饮水。在饲养期间，温度、湿度、通风、光照等条件均相同，为常规方法。

2)鸡储精能力期间受精率的测定：

以20天为一个周期，对公鸡一次采精，精液中要求无粪便、羽屑、血液污染，否则一律废弃。利用混合精液对母鸡进行输精(25微升/只)，输精时避免输精器械的刺激，同时为避免发生输精感染，做到每输精一次后，更换一次输精器头。具体操作按照《鸡人工授精技术规程》(DB12/T290—2006)执行。收集种蛋并标记笼号。同批次种蛋恒温孵化(37.8℃，相对湿度50％)7天后照蛋，记录受精与未受精的种蛋。

测量试验鸡一次人工授精后记录鸡储精能力期间受精蛋个数与此期间母鸡产蛋的百分比作为母鸡储精能力期间受精率表型，重复测量三次，每次20天，取三次所测结果的平均值，作为该试验鸡的母鸡储精能力期间受精率表型值。

母鸡储精能力期间受精率性状测定实验结束后，对试验鸡群翅下静脉采血0.5mL，置于1.5mL事先加入0.3mL抗凝剂的EP管中，混匀后-20℃保存以备DNA提取。

3)鸡基因组DNA的提取与检测：

采用苯酚-氯仿法从试验鸡血样中提取鸡基因组DNA，再用凝胶电泳判断DNA的完整性；对提取后的DNA进行质量检测；调整浓度至50ng/μL，制备母鸡全基因组DNA样品。

4)基因型判定及基因型数据与母鸡储精能力期间受精率的关联分析：

根据前一部分中701只母鸡群体的储精能力，筛选母鸡储精能力期间受精率差异个体190只，将受精率超过99％的个体19只作为case组，其余171只低于99％的作为control组，将他们提取的基因组DNA在与鸡600K高密度SNP芯片(Affymetrix Axiom)杂交。在全基因组范围内成功检测到552395个SNPs位点的基因型信息，通过质量控制(剔除检出率(Callrate)小于90％的SNPs；剔除最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)小于5％的SNPs)，最后剩下的SNPs数目为293076个。申请人利用MVP软件将试验鸡群的储精能力期间受精率与基因型数据进行全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)，关联分析模型为一般线性模型，在进行关联分析前，对影响母鸡储精期间的受精率的因素进行了主成分分析，并将前3个主成分作为固定效应加入至模型中，GWAS模型如下所示：

Y＝u+Xb+Za+e

其中Y表示表型值；u表示表型值均值；b表示固定效应(影响表型的前3个主成分)，a表示加性效应，X和Z分别表示b和a的关联矩阵，e表示残差。

根据GWAS分析结果，对所有SNP的p值从低到高排序，选取前35以作为下游大群验证的对象。

5)分析结果

GWAS结果中发现6个位于3号染色体上与母鸡储精能力期间受精率显著关联的SNP，见表1。

表1与母鸡储精能力期间受精率显著关联的SNP位点

实施例2验证SNP分子标记的有效性

为了验证全基因组关联分析结果的可靠性，我们利用已测定母鸡储精能力期间受精率的2个群体(群体1:858只，下文记为P1，群体2:1042只有效个体，下文记为P2)共1900只母鸡，对SNP进行限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，其中每个SNP所使用的引物及限制性内切酶如表2所示。并比较不同基因型个体的母鸡储精能力期间受精率，结果见表3。结果显示这6个SNP位点的多态性与母鸡储精能力期间受精率的关联性均达到了极显著水平(P<0.0001)。

表2 6个SNP位点所用引物及限制内切酶信息

表3 6个SNP位点与母鸡储精能力关联分析结果

注：当P值小于0.05时，表示SNP基因型之间存在显著差异，用*表示。当P值小于0.01时，表示SNP基因型之间存在极显著差异，用**表示，表中性状值为平均数±标准差。

通过PCR-RFLP分析，在两个群体中共得到1900只母鸡SNP位点AX-76582632的基因型信息，在所述群体中共发现了CC、CT和TT三种基因型，对3种基因型个体的受精率均值及标准差均进行了统计，结果不管是在P1、P2或P1和P2群体中均发现CC、CT和TT个体受精率存在极显著差异，且CT个体的受精率均值要高于CC个体和TT个体，因此，CT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

同上，在两个群体中共得到1900只母鸡SNP位点AX-76530282的基因型信息，在所述群体中共发现了AA、AG和GG三种基因型，对3种基因型个体的受精率均值及标准差均进行了统计，结果不管是在P1、P2或P1和P2群体中均发现AG、AA和GG个体的受精率存在极显著差异，且AG个体的受精率均值要高于AA和GG个体。因此，AG是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

同上，在两个群体中共得到1900只母鸡SNP位点AX-76530329的基因型信息，在所述群体中共发现了AC和CC两种基因型，对两种基因型个体的受精率均值及标准差均进行了统计，结果不管是在P1、P2或P1和P2群体中均发现CC个体的受精率要极显著低于AC个体的受精率。因此，AC是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

同上，在两个群体中共得到1900只母鸡SNP位点AX-76529310的基因型信息，在所述群体中共发现了CC、CT和TT三种基因型，对3种基因型个体的受精率均值及标准差均进行了统计，结果不管是在P1、P2或P1和P2群体中均发现TT、CT和CC个体的受精率存在极显著差异，且CT个体的受精率均值要高于CC和TT个体。因此，CT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

同上，在两个群体中共得到1900只母鸡SNP位点AX-80813697的基因型信息，在所述群体中共发现了AA、AT和TT三种基因型，对3种基因型个体的受精率均值及标准差均进行了统计，结果不管是在P1、P2或P1和P2群体中均发现AA、AT和TT三种基因型个体的受精率之间存在极显著差异，且AT个体的受精率均值要高于AA和TT个体。因此，AT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

同上，在两个群体中共得到1900只母鸡SNP位点AX-76582809的基因型信息，在所述群体中共发现了GG、AG和AA三种基因型，对3种基因型个体的受精率均值及标准差均进行了统计，结果不管是在P1、P2或P1和P2群体中均发现AA、AG和GG三种基因型个体的受精率之间存在极显著差异，且AG个体的受精率均值要高于AA个体和AG个体，因此，AG是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 用于选择母鸡储精能力期间受精率的SNP分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaagcttt caagggagag ccaccttaca ttttataaag aacttgaaga rgcttgtctg 60

ttggaaaaac ccaatcaatt ctgcagtgtt tgactatgag 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatcttaaa agccctccta aacaggaaag cttctagaaa tagaagatag rttatctagt 60

tgccatttat tacaattttg agatctaaaa gccttttttt 100

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatggtatt tatcgaacca aagcacacat tcaaaaggtc agtctcagca rgtaccataa 60

atataagtgt taatggaaaa caaagaattt tgctcattgt 100

<210> 4

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagctcatc tctttgtctt aattccatca aagtcatatc aaggtgaatt rgatgcttgg 60

cttttttacc cctcattttt aacgtgttct gggagggcta 100

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taggaaaggg atgacttaca gatactccct gtggagcagt actaatagct rtcaggactt 60

ctttaggcat tccaagcatc caaatacaga acgtgtttag 100

<210> 6

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagattggt gatatccaaa gctatgccta tagtttctta atggaccatc rattagtgac 60

tggggagctt tagtccttgc tgtaatctct gttatgcttg 100

Claims

1.SNP分子标记在京红1号母鸡储精能力期间受精率选择或改良中的应用，其特征在于，包括6个位于3号染色体的SNP分子标记，核苷酸序列及多态性位点如下：

分子标记1的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，第51位碱基R是C或T，导致多态性，CT是有利于母鸡储精期间受精率的基因型；

分子标记2的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，第51位碱基R是A或G，导致多态性，AG是有利于母鸡储精期间受精率的基因型；

分子标记3的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示，第51位碱基R是C或A，导致多态性，AC是有利于母鸡储精期间受精率的基因型；

分子标记4的核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示，第51位碱基R是C或T，导致多态性，CT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型；

分子标记5的核苷酸序列如SEQ ID NO .5所示，第51位碱基R是A或T，导致多态性，AT是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型；

分子标记6的核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示，第51位碱基R是A或G，导致多态性，AG是有利于母鸡储精期间的受精率的基因型。