CN114480673B - 一种基于靶向捕获测序的鸡低密度snp液相芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于靶向捕获测序的鸡低密度SNP液相芯片及其应用，本发明的芯片中含有包括5912个SNP位点，其中与屠宰型鸡品种经济性状显著关联的2582个，来源于33个中国代表性地方鸡品种全基因组重测序数据及相关研究，适合于地方鸡品种的资源评价和亲缘鉴定，以及屠宰型肉鸡品种经济性状遗传改良中的应用。同时，本发明的鸡低密度液相芯片可以通过直接增减探针的方式对目标SNP位点进行调整，与固相芯片相比具有更好的灵活性。

Description

一种基于靶向捕获测序的鸡低密度SNP液相芯片及其应用

技术领域

本申请属于基因芯片技术领域，涉及一种基于靶向捕获测序的鸡低密度 SNP液相芯片及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)作为最新一代分子标记，因其数量多、分布广、多态性丰富和易于检测等优势，在医学诊断、农业育种等领域得到广泛的应用。随着分子生物学及相关学科的飞速发展，越来越多的物种基因组测序陆续完成，高通量SNP检测技术应运而生，以满足不断增长的基因组水平SNP检测需求。

目前高通量SNP检测技术主要采用固相芯片和测序两种策略。固相芯片基于探针与DNA序列的互补杂交，通过标记物的荧光信号进行分型，拥有分型准确度高、周期短等优势，但也存在单位点分型成本高、不易于定制等缺点。

现有的商业化鸡SNP芯片主要包括Illumina 60K、Axiom 600K、Pheno ixChip-I(Illumina 50K)和IASCHICK(Illumina 50K)，已经被育种企业和科研单位广泛采用，主要应用于鸡基因组选择、种质资源遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、基因组关联分析等。这些固相芯片SNP密度普遍较高，因而分型成本较高，目前市场上缺少中低密度SNP芯片。同时由于这些芯片主要基于国外高产品种设计，在我国地方家禽品种中应用存在一些限制。

适合屠宰上市的黄羽肉鸡品种一般胸腿肌发育和肉质较好，具有较早的上市日龄，且需拥有明显的屠体外观特色。2021 年，江苏省家禽科学研究所联合江苏立华牧业股份有限公司成功培育了国内首个屠宰加工型黄羽肉鸡——“花山鸡”(http://xh.xhby.net/pc/con/202112/10/c ontent_1006062.html)。目前，鸡屠体外观等屠宰型品种相关的经济性状仍以常规选择为主，相关的分子标记研究和应用有待完善，尚无适合屠宰型品种选育的基因芯片。

发明内容

本发明为了克服上述技术问题，提供了一种基于靶向捕获测序的鸡低密度SNP液相芯片，包括5912个SNP位点。本发明的鸡低密度液相芯片可用于我国地方鸡屠宰性状基因组选择育种、遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系鉴定以及全基因组关联分析。

本发明第一方面，提供了一种鸡全基因组SNP分子标记组合，所述鸡全基因组SNP分子标记组合由5912个SNP分子标记组成，所述SNP分子标记在鸡参考基因组GRCg6a上的位置如表1中NO.001至NO.5912所示。

表1 5912个SNP分子标记位置

所述SNP分子标记与屠宰型鸡品种经济性状相关联，所述经济性状为9 0日龄饲料报酬和体重、屠宰产品得率(胸肌、腿肌、翅膀)、鸡冠发育、皮肤毛孔密度、五趾、皮肤颜色、胫部颜色、鸡距长度、肌纤维面积、肌纤维类型分布。

本发明所述SNP分子标记包含两类：一类是基于全基因组关联分析、比较基因组学研究和文献资料，筛选挖掘与屠宰型鸡品种经济性状显著关联的 2582个SNP位点(以下简称功能位点)；第二类是利用33个中国代表性地方鸡品种的全基因组重测序数据，以多态性高和基因组分布均匀为筛选原则，筛选的3330个SNP位点(以下简称背景位点)。

本发明所述SNP分子标记，其中1254个为新发现的SNP位点，未被E uropeanVariation Archive数据库(https://www.ebi.ac.uk/eva)收录，4121个位点未被其他商业化鸡SNP芯片收录。

本发明第二方面，提供了一种鸡全基因组低密度SNP芯片，所述鸡全基因组低密度SNP液相芯片由表1中NO.001至NO.5912所示的鸡全基因组S NP分子标记组合制得。

在某些实施例中，所述芯片为液相芯片。

本发明第三方面，提供了本发明第二方面所述的鸡全基因组低密度SNP 芯片在鸡遗传多样性评价、地方鸡保种效果评价、鸡亲缘关系鉴定、鸡品种鉴定及鸡全基因组关联分析中的应用。

本发明第四方面，提供了本发明第二方面所述的鸡全基因组低密度SNP 芯片在屠宰型肉鸡品种经济性状遗传改良中的应用。

在某些实施例中，所述经济性状包括但不限于，90日龄饲料报酬和体重、屠宰产品得率、鸡冠发育、皮肤毛孔密度、五趾、皮肤颜色、胫部颜色、鸡距长度、肌纤维面积、肌纤维类型分布。

在某些实施例中，所述屠宰产品得率包括胸肌、腿肌、翅膀屠宰得率。

本发明相对于现有技术而言，一是液相芯片包含的SNP位点来源于33 个中国代表性地方鸡品种全基因组重测序数据，因此在地方鸡群体中具有较丰富的多态性，因此更适合于地方鸡品种的遗传改良和资源评价。二是本芯片包含的SNP位点是针对屠体外观等屠宰品种关键性状进行挖掘的，因此十分适合对屠宰型品种的选育提高和地方鸡品种的屠宰化选育。三是液相芯片基于靶向捕获测序技术，不仅能够对目标位点进行分型，同时还可以对目标位点临近一定范围的SNP进行分型，因此可以获得更多的分型信息。四是液相芯片可以通过直接增减探针的方式对目标SNP位点进行调整，与固相芯片相比具有更好的灵活性。五是液相芯片依托于二代测序平台，分型成本更低，具有较高的性价比。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中5912个SNP在各染色体分布情况。

图2为本发明实施例3中利用液相芯片对8个地方鸡种PCA聚类结果图。

图3为本发明实施例4中利用液相芯片对同群体648只鸡亲缘关系聚类图。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1鸡低密度SNP液相芯片的设计和制备

1、地方鸡SNP背景数据库的建立

本发明利用33个中国地方鸡品种共475个体的全基因组重测序数据，通过数据分析获得高度可信的SNP位点用于后续筛选。

地方鸡品种血液样品来自于江苏省家禽研究所家禽遗传材料库。首先利用HiseqX-ten测序仪(Illumina)对475只地方鸡(表2)进行全基因组重测序，每个样品的平均基因组覆盖度均在10×以上。对下机数据进行初步质控后，将测序数据通过BWA软件(Li andDurbin,2010)比对到鸡参考基因组(GRCg6a)上，利用GATK4软件的Haplotype caller模块进行SNP突变鉴定。共获得高质量的突变位点17,464,141个。

表2用于全基因组重测序的鸡品种及数量

2、功能位点的筛选

步骤一，采用全基因组关联分析策略筛选获得与屠宰型品种经济性状相关的SNP位点。

试验鸡群来源于江西省崇仁县崇仁麻鸡原种场的崇仁麻鸡资源群体，共 718个体。表型测定均采用熟知的方法，指标包括90日龄体重、90日龄饲料转化率、胸肌率、腿肌率、翅膀率、鸡冠高度、背部皮肤毛孔密度、鸡距长度、腿肌肌纤维面积、氧化型和酵解型肌纤维在腿肌中类型分布比例。

翅静脉采血用于基因组DNA提取。使用IASCHICK 50K芯片进行基因组SNP检测(Liuet al.,2019)，经过质量控制后，剩余31,628个SNP位点用于后续分析。利用Plink V1.9b软件的GLM模型进行全基因组关联分析 (Purcell et al.,2007)，经Bonferroni方法矫正p-value后，得到与12个表型指标关联显著性Top％的位点1,893个作为候选SNP位点。

步骤二，采用比较基因组学方法筛选获得与屠宰型品种经济性状相关的 SNP位点。

利用33个地方鸡品种全基因组重测序数据，根据各品种的性能特色(表 2)，通过比较基因组学方法开展功能位点的挖掘。应用VCFtools软件(Da necek et al.,2011)，在基因组范围内以40K的窗口、10K的步长分别统计大体型和小体型鸡之间、乌皮和非乌皮鸡之间、五趾与非五趾鸡之间、青胫与非青胫鸡之间的群体固定指数(FST)和核酸多样性指数(θπ)比值，将基因组范围内FST和θπ比值最高的前1％的窗口取交集，分别作为鸡体重、肤色、五趾和胫色性状的受选择区域。

将各个受选择区域进行合并后，保留最小等位基因型频率(MAF)>0.1 和缺失率<0.1的位点。随后利用Haploview软件(Barrett et al.,2005)进行连锁分析，每个区域选择一个位于最长的连锁块中、位于基因区域的SNP作为该区域的候选位点。共获得候选位点1,253个。

步骤三，基于申请人前期研究和animalQTL数据库(www.animalgenome. org)，共获得与屠宰型肉鸡经济性状相关SNP位点2,218个(表3)。与步骤1和2获得的位点整合后，将候选位点与33个地方鸡种全基因组测序数据进行比对，以MAF>0.2、缺失率<0.1和杂合率<0.5为筛选标准，剔除不符合要求的位点；随后对间距在500bp以内的位点进行挑选，保留多态性好、位于基因上的位点；最终保留2,582个SNP位点作为最终的功能SNP位点。

表2基于前期研究和数据库的SNP位点来源

3、背景位点的筛选

按照挑选的SNP位点在基因组均匀分布的原则，基于33个地方鸡品种的重测序数据，在芯片上补充背景SNP位点。将基因组以200kb为标准划分为若干区间，如果区间存在功能位点则不补充位点，如果区间缺少功能位点则补充1个背景位点。背景位点的筛选原则为MAF>0.35、缺失率<0.1和杂合率<0.5。

通过以上步骤共挑选功能位点和背景位点共5,981个，提交给石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行评估，去除在基因组上无法唯一比对的位点、侧翼序列中包含重复序列的位点和相邻间距小于500bp的位点。最终共获得在鸡基因组均匀分布的SNP位点5,912个，具体基因组坐标如表1所示。所有位点在鸡基因组各染色体的分布见图1所示。

根据5,912个SNP位点的位置及两侧序列信息，通过石家庄博瑞迪生物技术有限公司采用靶向捕获测序技术设计引物并进行探针合成，从而获得鸡低密度SNP液相芯片。

实施例2鸡低密度SNP液相芯片在鸡DNA样品检测中的应用方法

1、鸡基因组DNA样品的提取：从鸡翅静脉采血，使用酚氯仿法进行D NA的提取。

2、DNA样品质量检测：用Agilent 2100生物分析仪(Agilent)对DNA 浓度进行测定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。检测合格的样品放入4℃冰箱保存备用。

3、液相芯片检测：按照液相芯片检测标准流程操作(http://www.molbreeding.com/index.php/Technology/GenoBaits.html)。

4、数据分析：获得的原始数据采用fastp软件(Chen et al.,2018)进行质控，之后用BWA软件(Li and Durbin,2010)将测序数据比对至鸡参考基因组GRCg6a上，采用GATK4软件(Auwera et al.,2013)的标准流程检测 SNP，进行基因分型。

实施例3鸡低密度SNP液相芯片在地方鸡种遗传多样性检测的应用

本发明利用实施例1制得的鸡液相芯片对8个地方鸡品种进行基因分型 (具体的操作方法见实施例二)。具体的地方鸡品种包括金湖乌凤鸡(JH)、狼山鸡(LS)、琅琊鸡(LY)、汶上芦花鸡(WS)、丝羽乌骨鸡(SK)、矮脚鸡(AJ)、东乡绿壳蛋鸡(DX)、固始鸡(GS)。样品均来源江苏省家禽科学研究所国家地方鸡种基因库，每个品种各10只。在检测的品种中，目标SNP位点的检出率均达98％以上，MAF>0.05的位点超过全部目标位点的91％，品种内平均MAF在0.34～0.41之间。除了目标SNP以外，还检测到目标SNP周围的位点14,895个，经过质量控制，去除MAF<0.05，缺失率>0. 1的位点，剩余有效位点12,918个。

参考实施例2的方法对数据进行分析，地方鸡品种PCA结果见图2所示。结果显示，利用本芯片可以很好的将各个品种区分开。各品种之间的遗传距离与各品种主产地区的地理距离相接近，例如琅琊鸡和汶上芦花鸡均分布于华北地区，因此拥有较近的遗传距离。此外，一些具有明显特色的地方鸡与其他品种存在着较远的遗传距离，如丝羽乌骨鸡拥有“凤头、丝羽、五趾、桑葚冠、乌骨”等特征，符合以往的研究结果(Liu et al.,2021)。

以上结果证实鸡低密度SNP液相芯片在地方鸡种中具有较高多态性，十分适合地方鸡种质资源评价、遗传改良以及相关研究。即使不进行基因型填充，使用该液相芯片可以获得比目标SNP更多的分型结果。相比于已有的鸡固相芯片，可以以更低的成本开展鸡育种和研究工作。

实施例4鸡低密度SNP液相芯片在鸡亲缘关系鉴定中的应用

畜禽系谱信息的准确性对于育种进展或保种效果有着十分重要的意义。但由于未知血缘个体的引入、人为的记录错误等原因，系谱记录错误在生产、育种和保种过程中普遍存在。因此需要对鸡群进行亲缘关系鉴定工作。

本实施例针对广西富凤农牧有限公司的某群体的648只鸡，包括98只公鸡和550只母鸡，应用实施例一制得的鸡液相芯片进行亲缘关系分析并构建分子系谱。通过基于G矩阵的基因组亲缘关系分析和聚类分析发现，现有公鸡样本可以划分为37个家系(图3)，并根据母鸡和公鸡间的亲缘关系，将母鸡划分入不同家系。与原系谱相比，准确率达到94％。还对群体中所有个体进行基于ROH的近交系数统计，该群体平均近交系数为0.1754，在后续留种中应避免使用近交程度较高的个体。

以上结果提示，应用该液相芯片可以以较低的成本获得群体更为精细的亲缘关系，同时能够纠正系谱错误，剔除近交个体，为提高育种进展或保种效果提供支持。

实施例5鸡低密度SNP液相芯片在屠宰型鸡品种鸡遗传改良中的应用

全基因组选择技术是近年来在畜牧领域刚刚兴起的一种育种手段。相较于常规方法，基因组选择在利用系谱和表型数据的基础上增加了基因组数据，大大增加了选种的准确性。皮肤毛孔密度影响肉鸡屠体的美观程度，该性状是屠宰型肉鸡品种的重要选育性状之一。

本实施例以某肉鸡育种企业的屠宰型品种父系为对象，应用鸡低密度S NP液相芯片对毛孔密度进行基因组选择。同时对该品系进行基于系谱的常规选育，并设置未经选择的对照组。在第一世代选择种鸡824只作为参考群，全部通过液相芯片进行基因分型，并在90日龄进行屠宰，测定个体背部的毛孔密度(2cm×2cm)。在第二世代，选择500个体通过液相芯片进行基因分型，对获得的基因分型结果利用SS-GBLUP方法估计候选群体的基因组育种值(GEBV)，以此进行毛孔密度性状的优良个体选留。第三世代对各组个体进行表型测定，统计遗传进展。结果发现，应用基因组选择的群体毛孔密度的遗传进展比常规选择组高出6.31％，比对照组高出8.28％。以上结果提示本液相芯片十分适合毛孔密度性状的基因组选择，应用液相芯片可以明显加快屠宰型鸡品种的选育进展。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (4)

1.检测鸡全基因组5912个SNP分子标记组合的探针在制备鸡全基因组低密度SNP芯片中的应用，其特征在于，所述芯片为液相芯片，该芯片由检测鸡全基因组5912个SNP分子标记组合的探针制得，所述SNP分子标记在鸡参考基因组GRCg6a上的染色位置和编号如说明书表1所示。

2.权利要求1中所述的鸡全基因组低密度SNP芯片在屠宰型肉鸡品种经济性状遗传改良中的应用，所述经济性状包括，90日龄饲料报酬和体重、屠宰产品得率、鸡冠发育、皮肤毛孔密度、五趾、皮肤颜色、胫部颜色、鸡距长度、肌纤维面积、肌纤维类型分布。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述屠宰产品得率包括胸肌、腿肌、翅膀屠宰得率。

4.权利要求1中所述的鸡全基因组低密度SNP芯片在鸡遗传多样性评价、地方鸡保种效果评价、鸡亲缘关系鉴定、鸡品种鉴定及鸡全基因组关联分析中的应用。

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