CN109321665B - 金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法及其应用，涉及遗传学领域。该金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法，包括通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较金湖乌凤鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出金湖乌凤鸡的分子标记，缓解了目前金湖乌凤鸡保种效果的评价过程中缺少高效的分子生物学方法导致的金湖乌凤鸡遗传分化研究成本高、精确度低的技术问题，达到了高效快速筛选出用于评价金湖乌凤鸡保种效果的分子标记技术效果。本发明还提供了金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记的应用，缓解了金湖乌凤鸡研究中缺少分子生物学标记和筛选方法的技术问题。

Description

金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及遗传学领域，尤其是涉及金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法及其应用。

背景技术

金湖乌凤鸡(Jinhu Wufeng Chicken)原产于福建省泰宁县，属兼用型品种。2009年通过国家畜禽遗传资源委员会鉴定。金湖乌凤鸡饲养历史悠久，在长期的选择和驯化过程中形成了“乌皮、乌骨、乌肉”的特征，是我国家禽库中宝贵的、具有特殊经济价值的遗传资源。近年来，随着引进品种的冲击及品种保护意识的缺乏，品种已濒临灭绝。国家级地方鸡种基因库于2001年引入进行异地保护，为更好的了解和保护这一宝贵的品种资源，有必要利用现代先进的分子生物学方法重新认识这一品种。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指基因组DNA 序列中由单个核苷酸的突变引起的多态性。染色体DNA同一位置的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最常见的多态形式，具有很高的遗传稳定性。

新一代测序(Next-generation sequencing，NGS)技术实现了DNA分子标记高通量检测，为从基因组水平上揭示鸡遗传进化提供了高效准确的方法。其中，全基因组重测序费用较高，600K鸡芯片仍基于商业化蛋鸡和肉鸡及非商业的远交群基因组重测序数据开发，不适于遗传多样性较为丰富的地方鸡品种资源。

全基因组关联分析(genome-wide association analysis，GWAS)是目前最常用的基因分析与挖掘的方法，但是其存在着不适用于品种特性的全面评价，而只针对单个形状，并且需要分离群体的缺点。自然选择和人工选择作用会在动物基因组上留下选择信号(selection signal)，对这些选择信号进行分析是发掘品种特性功能基因的最有效技术手段，通过多种不同类型品种基因组的比较，可在全基因组水平上对单个品种资源的特性有充分、全面的认识。

目前，已经被鉴定的DNA标记在鸡基因组中的覆盖范围极小，已知的家鸡遗传多样性评价微卫星标记仅有约30个，这些位点所代表的基因组遗传变异信息量非常有限，与乌骨鸡和色素沉积相关的功能基因和针对除黑色素沉积之外的金湖乌凤鸡其它种质特性评价及功能基因发掘研究也较少，限制了遗传统计量度量的准确性。因此，快速高效低成本的筛选出能够评价金湖乌凤鸡遗传多样性的分子标记是目前有待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法，缓解了目前对金湖乌凤鸡研究中缺少高效的分子生物学方法导致的成本高、精确度低的技术问题。

本发明的目的还在于提供了一种金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记的应用，缓解了金湖乌凤鸡保种效果评价过程及开发利用中缺少分子生物学标记的技术问题。

为实现上述目的，特采用以下技术方案：

一种金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法，所述方法包括通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较金湖乌凤鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出金湖乌凤鸡的分子标记。

优选地，所述的高通量测序为RAD-seq。

优选地，采用ddRAD建库方式构建pair-end文库；

优选地，所述的文库长度范围在300～500bp。

优选地，SNP质控条件包括Q20>95％、ddRAD depth>60％、所有鸡种群体中的SNPCall rate>70％、单个鸡种中的SNP Call rate>90％和 MAF>0.05。

优选地，所述计算遗传统计量包括计算近交系数Fis、群体分化指数Fst 值、群体θπ值、核苷酸多样度Pi、观察杂合度H_o、平均基因流N_m、连锁不平衡LD和群体遗传聚类分析。

优选地，所述筛选方法包括选择清除分析和基因功能富集分析。

优选地，所述选择清除分析基于群体分化Fst值和群体θπ值计算。

优选地，所述基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法。

优选地，筛选出的所述金湖乌凤鸡分子标记主要富集的功能区域包括：黑色素沉积、脂肪酸代谢、就巢行为、皮肤发育和免疫力。

本发明还提供了上述金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记筛选出的分子标记在如下(a1)-(a5)中的应用：(a1)个体识别；(a2) 家系管理；(a3)种质资源鉴定；(a4)新品系选育；(a5)遗传多态性位点分析。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法采用了高通量测序技术检测金湖乌凤鸡中的SNP位点，包含多重分析，可对金湖乌凤鸡鸡种进行全面有效的种质分析，筛选得到金湖乌凤鸡的受选择基因作为金湖乌凤鸡种质特性的分子标记，用来评价金湖乌凤鸡保种效果，成本低，数据量丰富，检测精度高，为后续的金湖乌凤鸡的种质鉴定和保种效果的监测提供了技术保障。同时，利用品种特异性的分子标记来开展鸡种资源遗传进化研究和评价这一品种的保护状况，而不受常规的形态学标记手段及环境因素的影响，也便于对金湖乌凤鸡这一宝贵的品种资源进行开发利用。

本发明提供的金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记的应用，可应用于评价金湖乌凤鸡的保种效果、品种特性评价、金湖乌凤鸡新品系的选育、遗传分化分析等领域，应用广泛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的金湖乌凤鸡SNP在染色体上的分布图；

图2为本发明实施例1提供的金湖乌凤鸡和其它品种LD随距离增长的衰减图；

图3为本发明实施例1提供的金湖乌凤鸡及其他鸡种聚类图；

图4为本发明实施例1提供的金湖乌凤鸡受选择的基因GO注释分类统计图；

图5为本发明实施例1提供的金湖乌凤鸡受选择基因的KEGG通路注释统计图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所

本发明提供了一种金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法，上述方法包括通过高通量测序检测SNP标记，计算遗传统计量分析比较金湖乌凤鸡群体与其他鸡种群体的遗传差异，筛选出金湖乌凤鸡的分子标记。

传统的SNP检测方法采用PCR-单链构象多态性、毛细管电泳及变性高效液相色谱等，由于传统方法均通过凝胶电泳进行分析因此通过量受到限制，因此，本实施方式中选用高通量测序技术(High-throughput sequencing) 又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，全面的分析了金湖乌凤鸡与其他鸡种的SNP，通过生物信息学方法对大数据量的 SNP位点进行统计分析，从而分析金湖乌凤鸡进化的方式。

本发明提供的金湖乌凤鸡分子标记的筛选方法采用了高通量测序技术检测金湖乌凤鸡中的SNP位点，包含多重分析，可对金湖乌凤鸡鸡种进行全面有效的种质分析，筛选得到金湖乌凤鸡的受选择基因作为金湖乌凤鸡种质特性的分子标记，用来评价金湖乌凤鸡保种效果，成本低，数据量丰富，检测精度高，为后续的金湖乌凤鸡的种质鉴定和保种效果的监测提供了技术保障。同时，利用品种特异性的分子标记来开展鸡种资源遗传进化研究和评价这一品种的保护状况，而不受常规的形态学标记手段及环境因素的影响，也便于对金湖乌凤鸡这一宝贵的品种资源进行开发利用。

在一个优选的实施方式中，上述高通量测序为RAD-seq。

限制性酶切位点关联DNA测序技术(restriction-site-associated DNAsequencing，RAD-seq)是在二代测序技术基础上发展起来的一种简化基因组技术。简化基因组测序(reduced-representation sequencing)是在新一代测序基础上发展起来的一种新型测序方法，该方法利用限制性内切酶对基因组进行酶切，只选取基因组特定区域进行测序，从而降低了基因组的复杂程度。RAD测序文库构建是对基因组DNA片段进行酶切和随机打断，选取一端带有酶切位点，另一端为随机打断点的片段进行建库测序。 RAD-seq能够降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP。

在一些可选的实施方式中，采用ddRAD建库方式构建pair-end文库。

在一个优选的实施方式中，文库长度范围在300～500bp。

采用ddRAD双酶切建库方式能够在改善测序效率的同时减少试验成本，单酶切RAD建库，利用单一的限制性内切酶和随机打断对基因组进行切割，由于缺少方向性，酶切位点两边相邻的100bp序列都可能被测出，序列分散度高，准确性低，而采用双酶切系统对基因组进行切割并且辅以对酶切后产物大小的选择，这样可以把序列固定在两端为不同酶切位点并且长度为500bp左右。采用ddRAD双酶切建库的方式，得到的文库长度大小适中，测序效率高，既不容易测出过多的接头序列导致数据质量低，也不容易由于文库片段过长导致文库中间部分测序不充分，数据流失。

在一个优选的实施方式中，上述的其他鸡种群体包括18个地方鸡品种：狼山鸡、安义瓦灰鸡、固始鸡、仙居鸡、白耳黄鸡、东乡绿壳蛋鸡、河南斗鸡、文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、茶花鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、大骨鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、金湖乌凤鸡、北京油鸡和2个引入鸡品种：隐性白羽肉鸡和安卡红鸡。这些鸡种囊括肉用型、蛋用型、观赏型、兼用型以及药用型地方品种和国外标准鸡种，广泛分布于我国黄土高原区、青藏高原区、蒙新高原区、西南山地区、东北区、东南区以及黄淮海区等地理生态区域，上述的18个地方鸡品种能够充分代表鸡的差异化品种类型，可以保证鉴定出金湖乌凤鸡品种的分子标记的准确性。

在一些可选的实施方式中，SNP质控包括如下筛选条件：Q20>95％、 ddRAD depth>60％、在所有鸡种群体中的SNP Call rate>70％、在单个鸡种中的SNP Call rate>90％和MAF>0.05。

其中：Q20：正确率99％的碱基数目比例；ddRAD depth：双酶切基因组测序的覆盖深度；SNP call rate：核酸多态性检出率；MAF：最小等位基因频率。

在一些可选的实施方式中，上述计算遗传统计量包括计算近交系数 Fis、群体分化指数Fst值、群体θπ值、核苷酸多样度Pi、观察杂合度H_o、平均基因流N_m、连锁不平衡LD和群体遗传聚类分析。在一些可选的实施方式中，上述筛选方法包括选择清除分析和基因功能富集分析。

连锁不平衡(linkage disequilibrium)是指相邻基因座上等位基因的非随机相关，当位于某一基因座上的特定等位与同一条染色体另一基因座位上的某等位同时出现的几率高于或低于人群中的随机分布，就称这两个位点处于连锁不平衡状态。一般来说，在连锁不平衡分析中，野生种的LD值较低，而驯化种由于受到了正选择的作用，LD值就会偏大。

群体进化选择清除分析是指基因组某区域由于受到了正向选择而消除多态性在物种基因组上留下选择印记。栽培或驯化的物种发生选择消除的区域遗传多样性显著降低。

群体遗传分化是指物种群体间存在明显的等位基因频率差异，这种差异通常来源于遗传漂变和选择过程造成的群体间的分化。群体遗传分化指数Fst是检测群体间遗传分化的重要指标之一，对全基因组范围内的单个位点估算Fst值，就能对每个位点分析其分化程度，最终实现选择信号检测， 0≤Fst≤1，Fst越接近1表示亚种群间的种群分化越明显。

群体θπ值反映了群体基因组碱基多样性。θπ分析，通过以一定大小的窗口在基因组上滑动，并对滑动窗口中群体遗传信息的差异进行分析。

其中，优选地使用PLINK软件对所有品种进行连锁不平衡(LD)分析。优选地，同时使用PLINK软件检测选择信号，进行选择清除分析，选择信号检测条件为以100kb为窗口，10kb为step进行滑动的θπ值和Fst分布计算。优选地，群体聚类分析利用MEGA软件NJ聚类法；优选地，上述选择清除分析基于群体分化Fst值和群体θπ值计算。

在研究中多个基因直接注释的结果是得到大量的功能节点，这些功能具有概念上的交叠现象，导致分析结果冗余，不利于进一步的精细分析，因此需要对得到的功能节点加以过滤和筛选，因此在一些可选的实施方式中，基因功能富集分析是基于GO和KEGG的富集分析方法。

基因本体数据库(gene ontology，GO)涵盖了基因生物学过程、分子功能和细胞组分三个方面，GO数据库通过控制注释词汇的层次结构从不同层面查询和使用基因注释信息，从整体上看，GO注释系统是一个有向无环图结构，包含基因生物学过程、分子功能和细胞组分三个节点，注释系统中每一个节点都是对基因或蛋白质的描述，因此，一个基因可以从三个方面得到注释。京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG)是系统分析基因功能和基因组信息的数据库，整合了基因组学、生物化学以及功能组学的信息，KEGG提供了整合代谢途径查询，包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等代谢及有机生物的降解。

在一些可选的实施方式中，筛选出的金湖乌凤鸡的分子标记主要富集的功能区域包括：黑色素沉积、脂肪酸代谢、就巢行为、皮肤发育和免疫力。

金湖乌凤鸡群体与其它地方鸡种群体相比较，通过Fst和θπ检验在金湖乌凤鸡中鉴定出23个受选择区域、104个受选择基因。GO和KEGG分析表明这些受选择基因主要富集在代谢过程、发育过程、细胞信号转导等生物学通路，发掘出多个与黑色素沉积(MC3R、DOK5、GDNF、TBX1)、脂肪酸代谢(SLC1A3、HSD17B4)、就巢行为(PRLR)、皮肤发育(TEK、 THBS4)及免疫力(PDE4D、NFATC2)等种质特性相关基因。

在本发明中，鉴定金湖乌凤鸡品种特性的分子标记的筛选方法的应用，可应用于金湖乌凤鸡种质鉴定，品种特性评价，保种效果检测，金湖乌凤鸡鸡种的遗传分化分析等领域，应用广泛。

本发明还提供了湖乌凤鸡分子标记的筛选方法和筛选出的分子标记筛选出的分子标记在如下(a1)-(a5)中的应用：(a1)个体识别；(a2)家系管理；(a3)种质资源鉴定；(a4)新品系选育；(a5)遗传多态性位点分析。

为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

本发明实施例中建库测序部分由南京集思慧远生物科技有限公司完成；本发明实施例中所用试剂全部为市售常规试剂；金湖乌凤鸡保种群体与其他品种保种群体来自于江苏省家禽科学研究所的国家级地方鸡种基因库。

实施例1金湖乌凤鸡分子标记的筛选

(a)血液样品采集：金湖乌凤鸡保种群体及对照组18个地方鸡品种 (狼山鸡、安义瓦灰鸡、固始鸡、仙居鸡、白耳黄鸡、东乡绿壳蛋鸡、河南斗鸡、文昌鸡、大围山微型鸡、藏鸡、茶花鸡、瓢鸡、惠阳胡须鸡、大骨鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、金湖乌凤鸡和北京油鸡)和2个引入鸡品种(隐性白羽肉鸡和安卡红鸡)自于江苏省家禽科学研究所的国家级地方鸡种基因库，每个群体按照家系选择30个个体间无亲缘关系的个体(10公、20 母)，翅静脉采血1mL～1.5mL，使用柠檬酸钠(ACD)抗凝，-20℃保存备用。

(b)DNA样品获取：使用酚-氯仿法提取样品的基因组DNA。将获得的DNA进行质检，包括nanodrop初步检测DNA样品浓度；电泳检测DNA 的完整性，包括DNA有无降解，是否存在蛋白质和RNA等其他杂质污染； Qubit 2.0对DNA样品进行准确定量，选取质量≥1ug的样品。将合格样品置于-80℃保存，以备建库测序使用。

(c)建库测序：质检合格的样品采用ddRAD建库的方式构建长度范围在300～500bp的pair-end文库，然后进行RAD-seq简化基因组测序。将得到的raw reads数据进行过滤得到clean reads，过滤标准为：①去除接头污染的reads；②去除质量值小于5的碱基占整条reads比例超过50％的reads；③去掉测为N的碱基占整条reads比例超过10％的reads。

(e)SNP的检测主要使用GATK和samtools软件工具包实现。质控条件包括Q20>95％、ddRAD depth>60％、在所有鸡种群体中的SNP Call rate>70％、在单个鸡种中的SNPCall rate>90％和MAF>0.05。通过数据质控，在金湖乌凤鸡群体中鉴定出SNP 325531个，SNP数量与染色体长度呈正相关，大染色体上SNP分布较多，其中1～9号及Z染色体上SNP数量均超过10,000个，小染色体上SNP分布较少，结果如图1所示。

(f)利用PLINK软件对所有品种进行连锁不平衡(LD)分析发现在总体范围内，金湖乌凤鸡群体和其它地方鸡种群体各等位基因不存在强烈的连锁不平衡现象，结果如图2所示。

(g)PopGen软件计算近交系数Fis、核苷酸多样度Pi、群体分化指数 Fst和观察杂合度H_o，得到金湖乌凤鸡群体近交系数Fis为0.1116，核苷酸多样度Pi为0.2404，观察杂合度Ho为0.2136，与其他18个地方鸡种相比遗传多样性较为丰富，金湖乌凤鸡的平均遗传分化系数Fst为0.1556，在以引入品种为外群的系统发育树中形成一个独立的分支。

(h)利用MEGA软件NJ聚类法进行群体聚类分析，结果表明，金湖乌凤鸡与河南斗鸡(0.2143)、北京油鸡(0.1845)和固始鸡(0.1802)之间的遗传分化系数Fst最高，与瓢鸡(0.1079)、文昌鸡(0.1202)和惠阳胡须鸡(0.1241)之间的遗传分化系数Fst最低，相对应的基因流Nm也最高，分别为20.677、1.8302和1.7647。以隐性白羽肉鸡、安卡红鸡做外群构建的NJ聚类结果表明，金湖乌凤鸡JH形成了一个相对独立的分支结果如图 3所示。

(i)选择信号检测采用PLINK软件，以100kb为窗口，10kb为step 进行滑动的θπ值和Fst分布计算。

(j)对受选择的基因进行GO注释和KEGG分析，确定受选择的基因与金湖乌凤鸡群生物学特性的关系，结果如图4和图5所示，结合核苷酸多样度θπ比率和遗传分化系数Fst的选择信号分析发现23个染色体区域受到选择，104个受选择基因。功能分析结果表明，筛选出的金湖乌凤鸡的分子标记主要富集的功能区域包括：黑色素沉积、脂肪酸代谢、就巢行为、皮肤发育和免疫力。

与地方鸡种相比，金湖乌凤鸡的观察杂合度Ho为0.2136，核苷酸多样度Pi为0.2404，遗传多样性较为丰富。在遗传结构上，金湖乌凤鸡聚类形成一个相对独立的分支，聚类结果与品种间遗传分化、基因流相一致，也与金湖乌凤鸡的地理分布和形成历史相吻合。金湖乌凤鸡与其它地方鸡种的平均遗传分化系数Fst为0.1556，平均基因流Nm为1.3982，金湖乌凤鸡原产地交通闭塞形成自然隔离，很少有外来鸡种进入，与其它地方鸡品种间的基因交流相对较少。

在本实施例中选择信号分析结果表明，与其它18个地方鸡品种及2个引入肉鸡品种相比，金湖乌凤鸡中有23个染色体区域受到选择作用，104 个受选择基因显著富集于不同的生物学通路。受选择基因包括：与神经嵴细胞分化迁移、黑色素细胞发育增殖及黑色素合成相关的基因MC3R、 TFAP2C、GDNF、MC1R、EDN3、TBX1、GLI3、GNAQ、MEF2C等，形成了金湖乌凤鸡全身性色素过度沉积的特征；神经递质代谢的调控基因 RNF180、HTR1A，形成了金湖乌凤鸡机灵活泼、能飞善跑的特征；脂肪酸代谢基因ELOVL7、HSD17B4、SCL1A3等，形成了金湖乌凤鸡全含有丰富的不饱和脂肪酸、必需脂肪酸和花生四烯酸的特征；与就巢及母性行为有关的基因PRLR、CYP24A1、VIPR-1等，形成了金湖乌凤鸡高就巢率的特征；与皮肤发育、内皮细胞分化增殖相关的基因THBS4、TEK、THAP1 等，形成了金湖乌凤鸡较其它地方鸡种更厚的皮肤和粗大的毛孔的特征；T 细胞信号通路、白细胞介素生成、B细胞增殖、嗜中性粒细胞趋化及免疫球蛋白生成等免疫基因PDE4D、NFATC2、TNFAIP8，形成了金湖乌凤鸡较强的抗病力的特征。

附图中缩写表示：BE-白耳黄鸡；ZZ-藏鸡；CH-茶花鸡；XJ-仙居鸡； GS-固始鸡；DG-大骨鸡；BY-北京油鸡；DX-东乡绿壳蛋鸡；HX-惠阳胡须鸡；JH-金湖乌凤鸡；LS-狼山鸡；XS-萧山鸡；WH-瓦灰鸡；WX-大围山微型鸡；WC-文昌鸡；PJ-瓢鸡；DJ-斗鸡；LY-鹿苑鸡；BJ-金湖乌凤鸡；RW- 隐性白羽肉鸡；AK-安卡鸡。

实施例2金湖乌凤鸡分子标记的应用

(a)金湖乌凤鸡保种群个体血液采集：使用医用一次性注射器采集保种群随机选留公、母鸡翅静脉全血0.5～1.0ml(公鸡不少于10只，母鸡不少于20只)，采集后迅速注入含有2μL 0.5mol/L Na₂EDTA抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用。

(b)DNA提取和质量检测：常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2～0.3ml，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液 DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；将合格样品置于-80℃保存，以备SNP检测使用。

(c)金湖乌凤鸡品种特异性基因的SNP标记检测

引物设计：对筛选得到的金湖乌凤鸡品种特性基因的SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位点的一段序列。利用鸡基因组DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增。

PCR扩增和检测：PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为 100ng/μL，2μL10×PCRBuffer，1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，ddH2O13.3μL； PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用；把PCR产物送入上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。

(d)金湖乌凤鸡保种效果的评价，结果如表1所示：

表1金湖乌凤鸡保种效果的评价

本发明采用计算机模拟方法研究了一对基因在群体内的实际频率和假设不同基因频率和不同群体规模闭锁群体内单个双等位基因座位的遗传漂变，发现不同初始基因频率下4种群体规模100次重复模拟中等位基因A 发生丢失的概率。可以看出：无论在何种初始频率下，等位基因A固定的次数均随着群体规模的降低而升高，且A发生固定的概率受其初始频率的影响较为明显。当初始频率为0.1时，规模为100只和300只的群体在第 10代时A发生丢失的概率分别为4.4％和1.49％，当初始频率为0.5时，100 只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为2.4％和0.8％。即使到了20世代，规模为400只的群体发生A的丢失或固定仅为1.2％。当初始频率为0.9时，100只和300只的群体在第10代时A发生丢失的概率分别为0.4％和0.1％。这表明，初始频率过低将会加速基因在群体中的丢失(结果见表2)。

表2不同基因频率和群体规模下1对等位基因固定概率的数学模型理

论预测结果

基于上述计算机模拟的理论结果，本申请将金湖乌凤鸡品种特性记基因的等位基因频率75％作为临界点，大于75％的基因频率代表金湖乌凤鸡保种效果较好(主要的种质特性不丢失、不下降)，由上表1和表2可知在保种过程中金湖乌凤鸡群体未发生较强的遗传漂变。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种检测金湖乌凤鸡分子标记的试剂在如下（a1）-（a5）中的应用：

（a1）个体识别；

（a2）家系管理；

（a3）种质资源鉴定；

（a4）新品系选育；

（a5）遗传多态性位点分析；

所述分子标记包括：位于鸡第20号染色体第12273356位、第12273390位、第12460267位、第12461462位、第12461467位、第13402345位、第13402397位和第13402425位以及位于鸡第Z号染色体第11727345位、11738906、第71548012位、第71553833位、第71555002位、第11202054位、第11221493位、第11221552位、第10631149位、第10647552位、第10654361位、第22012357位、第22012705位、第68589375位、第68589397位、第18273474位、第18294675位和第18307878位。

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