CN116334251A

CN116334251A - 一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用

Info

Publication number: CN116334251A
Application number: CN202310557311.7A
Authority: CN
Inventors: 屠云洁; 束婧婷; 刘一帆; 章明; 巨晓军; 单艳菊; 姬改革; 肖芹; 盛中伟; 邹剑敏; 赵伟东; 郑国庆
Original assignee: Taihe Fengsheng Agriculture And Animal Husbandry Technology Co ltd; Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Taihe Fengsheng Agriculture And Animal Husbandry Technology Co ltd; Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2023-05-17
Filing date: 2023-05-17
Publication date: 2023-06-27

Abstract

本发明公开了一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用。所述引物组合扩增选自如下JHWF1位点到JHWF9位点中的任意4到9种。只要有一个SNP位点基因型不符合金湖乌凤鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于金湖乌凤鸡；任选4个SNP位点组合，符合金湖乌凤鸡基因型的判定概率即可达到98％以上。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒的金湖乌凤鸡产品。

Description

一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用

技术领域

本发明涉及家禽品种鉴定方法，具体地，涉及一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用。

背景技术

金湖乌凤鸡是我国著名的地方乌骨鸡品种，具有典型的麻羽、凤头、绿耳、桑葚冠、毛脚、裙羽、乌皮、乌肉、乌骨等典型品种特征。金湖乌凤鸡核心产区为福建省泰宁县，其肉质细嫩、风味鲜美、营养丰富，并具有极高的药膳价值，深受广大消费者的喜爱。由于金湖乌凤鸡的药用价值和经济价值，市场上出现很多金湖乌凤鸡与国内外其他品种乱杂乱配的冒充品种，这些品种体型外貌酷似金湖乌凤鸡，消费者很难辨别，使广大养殖户利益受到损害，同时影响了金湖乌凤鸡原种的保种与选育。

目前市场上鉴别金湖乌凤鸡真伪的方法主要依靠外观观察，这种观察主观性较强，没有科学的鉴定标准，尤其在鉴定金湖乌凤鸡与其他品种鸡杂种后代时，因其外貌相似，鉴定错误率较高。

单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP），具有数量多、分布广、多态性丰富、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。利用基因组DNA中特有的品种差异性较大的SNP位点，通过不同位点组合的基因型进行品种鉴定，鉴定结果更加客观、准确。鉴于此，利用SNP位点组合，开发一种能有效准确鉴定金湖乌凤鸡品种的方法，应用于金湖乌凤鸡品种鉴定工作具有十分重要的意义。

发明内容

针对金湖乌凤鸡品种鉴定难的问题，本发明提供了一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用，通过检测提供的金湖乌凤鸡9个SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于金湖乌凤鸡。该方法操作简便，准确性高，可以准确鉴定金湖乌凤鸡品种，有效打击市场上金湖乌凤鸡地方品种的假冒伪劣产品。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合，所述引物组合扩增选自如下JHWF1位点到JHWF9位点中的任意4到9种：

各SNP位点引物的核苷酸序列如下：

本发明还提供了一种上述SNP位点引物组合在金湖乌凤鸡品种鉴定中的应用。

具体地，鉴定方法包括以下步骤：

(1)提取待测鸡基因组总DNA；

(2)根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；

(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；

(4)根据基因型结果，判断个体是否属于金湖乌凤鸡品种。

具体判断方法为：如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合金湖乌凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于金湖乌凤鸡；如果所选至少4个SNP位点组合对应的基因型全部符合金湖乌凤鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于金湖乌凤鸡的概率。

优选地，所述步骤(1)中待测鸡的基因组DNA由该鸡种的个体翅静脉采血得到。

步骤（2）中，JHWF1~JHWF9的PCR产物长度分别为261 bp、219 bp、235 bp、199 bp、202 bp、169 bp、151 bp、250 bp、154 bp。

优选地，所述金湖乌凤鸡中9个SNP位点JHWF1～JHWF9的基因型依次为AA、CT、GG、GG、GG、CC、TT、CC、TT。

通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：

任意1个SNP位点基因型判定为金湖乌凤鸡的概率最低65.15％，最高85.50％；任意2个SNP位点联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率达到78.63％以上；任意3个SNP位点联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率达到92.83％以上；任意4个SNP位点联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率达到98.70％以上；任意5个SNP位点联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率达到99.78％以上；任意6个SNP位点联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率达到99.80％以上；任意7个SNP位点联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率达到99.96％以上；任意8个SNP位点的联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率为达到99.99％以上；全部9个SNP位点的联合基因型判定为金湖乌凤鸡的概率为100％。任意一个SNP位点基因型排除金湖乌凤鸡的概率即达到100％。

因此，只要有一个SNP位点基因型不符合金湖乌凤鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于金湖乌凤鸡；任选4个SNP位点组合，符合金湖乌凤鸡基因型的判定概率即可达到98％以上。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒的金湖乌凤鸡产品。

具体实施方式

本发明针对金湖乌凤鸡品种鉴定难的问题，提供了一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用，所述引物组合扩增选自JHWF1位点到JHWF9位点中的任意4到9种。

9个SNP位点的筛选方法为：利用京芯一号芯片（55K，北京康普森生物技术有限公司）对不同鸡品种（金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、乌蒙凤鸡等国内代表性乌骨鸡品种，竹香鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、矮脚鸡、高脚鸡等非乌骨鸡品种以及国外代表性引进用于杂交配套的哈伯德、来航鸡品种合计12个品种）的55000个SNP位点进行筛选确定，根据每个品种跟其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数（Fst）前1%，最小等位基因频率（MAF）>0.4，缺失率（miss rate）<0.2 进行筛选，确定68个SNP位点，为了进一步筛选出金湖乌凤鸡核心位点信息，优先选择金湖乌凤鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与金湖乌凤鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于金湖乌凤鸡品种鉴定的9个SNP位点。9个SNP位点信息见下表。

根据9个SNP位点的物理位置，基于红色原鸡参考基因组序列(Galgal5)，利用UCSC网站https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?hgsid=791993043_MvNmFj6QPMRQsauOxQixq3gPtEUU，获得9个SNP位点DNA序列，然后利用Primer5.0设计引物。各SNP引物序列、PCR产物长度和退火温度见下表：

用上述SNP引物组合进行金湖乌凤鸡品种鉴定具体方法包括如下步骤：

(1)提取待测鸡基因组总DNA；

(2)根据所选SNP组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；

(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；

(4)根据基因型结果，判断个体是否属于金湖乌凤鸡品种。

在本发明鉴定方法中，优选从待测鸡的翅静脉采血获得全血提取基因组DNA，本发明对基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规提取方法即可，在本发明实施例中，优选酚-氯仿法提取基因组DNA。

本发明中，应用时采用JHWF1～JHWF9中的一个位点或者几个位点进行金湖乌凤鸡品种的鉴定，并采用对应的上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增采用本领域常规PCR扩增方法即可。

本发明中，金湖乌凤鸡中9个SNP位点JHWF1～JHWF9的基因型依次为AA、CT、GG、GG、GG、CC、TT、CC、TT。

通过对待测鸡PCR扩增产物测序后、判断基因型，与所选SNP组合对应的基因型进行比对，如果有一个不符合金湖乌凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于金湖乌凤鸡；如果所选SNP组合对应的基因型全部符合金湖乌凤鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于金湖乌凤鸡的概率。计算公式如下：

其中，Pi表示SNP组合中第i个SNP中其他品种对应基因型的频率。

所述SNP位点在金湖乌凤鸡及其他品种中的基因型频率如下表：

例如，选择JHWF1、JHWF3、JHWF5、JHWF7合计4个SNP位点，如果联合基因型为AAGGGGTT，则该个体属于金湖乌凤鸡的概率为P＝1/(1+0.21×0.33×0.26×0.28)＝0.9950。

其中，其他品种的基因型频率是指选择丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、乌蒙凤鸡、黔东南小香鸡、哈伯德、来航鸡等国内外11个代表性品种，不同品种合并计算得到的每个位点的基因型频率均值。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

随机选择江苏省重点实验室家禽种质资源遗传材料库保存的金湖乌凤鸡25只、丝羽乌骨鸡25只、乌蒙凤鸡25只、乌蒙乌骨鸡25只、黔东南小香鸡25只、哈伯德25只，翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组DNA，选择JHWF2、JHWF4、JHWF6、JHWF8合计4个SNP位点的引物进行PCR扩增。

PCR总反应体系50μL：DNA模板2μL，dNTP（2 mmol/L）4μL，Mg²⁺（3 mmol·L^-1）0.6μL，1×PCR反应缓冲液5μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各1μL，Taq聚合酶（1U·μL^-1）2.5μL，补超纯水至50μL。

PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物送生物公司进行测序，同时序列进行多态性检测和基因型判定。根据测序结果，4个位点联合基因型为CTGGCCCC的25个个体判定为金湖乌凤鸡的概率为P＝1/(1+0.45×0.18×0.06×0.56)＝0.9970，99.70%可以将25个个体全部鉴定为金湖乌凤鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合CTGGCCCC基因型，因此判定为非金湖乌凤鸡。

实施例2

其他条件同实施例1，区别在于，采用JHWF1、JHWF2、JHWF3、JHWF6、JHWF7、JHWF8、JHWF9对应的7个SNP位点的引物进行PCR扩增。根据测序结果，7个位点联合基因型为AACTGGCCTTCCTT的25个个体判定为金湖乌凤鸡的概率为P＝1/(1+0.36×0.45×0.35×0.06×0.31×0.56×0.50)＝0.9997，99.97%可以将25个个体全部鉴定为金湖乌凤鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合AACTGGCCTTCCTT基因型，因此判定为非金湖乌凤鸡。

实施例3

其他条件同实施例1，区别在于，采用JHWF1~JHWF9对应的9个SNP位点的引物进行PCR扩增。根据测序结果，9个位点联合基因型为AACTGGGGGGCCTTCCTT的25个个体判定为金湖乌凤鸡的概率为P＝1/(1+0.36×0.45×0.35×0.18×0.17×0.06×0.31×0.56×0.50)＝1.0000，100%可以将25个个体全部鉴定为金湖乌凤鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合AACTGGGGGGCCTTCCTT基因型，因此判定为非金湖乌凤鸡。

以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一套用于金湖乌凤鸡品种鉴定的SNP位点引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增选自如下JHWF1位点到JHWF9位点中的任意4到9种：

JHWF1位于NC_006091.4染色体4上第30532120位，其为G或A多态；

JHWF2位于NC_006089.4染色体2上第10600720位，其为C或T多态；

JHWF3位于NC_006090.4染色体3上第91034398位，其为T或G多态；

JHWF4位于NC_006091.4染色体4上第29376163位，其为T或G多态；

JHWF5位于NC_006092.4染色体5上第15566677位，其为C或G多态；

JHWF6位于NC_006108.4染色体21上第3349522位，其为T或C多态；

JHWF7位于NC_006095.4染色体8上第11567912位，其为T或A多态；

JHWF8位于NC_006091.4染色体4上第87270080位，其为C或T多态；

JHWF9位于NC_006096.4染色体9上第3172322位，其为T或A多态。

2. 根据权利要求1所述的SNP位点引物组合，其特征在于，各SNP位点引物的核苷酸序列为：

JHWF1-F：5’AGCAGAGAGCTAGTAGCACCTTCC 3’

JHWF1-R：5’TGGTTCAGTGACAGCAGTGATGTTG 3’

JHWF 2-F：5’ACGAGAAGCCAGAGCATCAT 3’

JHWF 2-R：5’CCTTGCAGCACAGGTATTGA 3’

JHWF3-F：5’CAGCCAATGCTACAGAGCAC 3’

JHWF3 -R：5’ATCAAAGTGCTGGTCATCCA 3’

JHWF4-F：5’GGCACTGCCATTCAAGAGTT 3’

JHWF4-R：5’AGTTAAATGCGGTGCTCCAG 3’

JHWF5-F：5’CAGTCCGCACAGCCTCAGAAAAG 3’

JHWF5-R：5’TGCTTTCCCTGCCCTCGTACAG 3’

JHWF6-F：5’ACTGCAGGTTTCCCACAGTT 3’

JHWF6-R：5’TCGTGTGTGGCAGGAAATTA 3’

JHWF7-F：5’AAGTTCATCCGACCACTTCA 3’

JHWF7-R：5’GCTTCAGCCAGTCTGGTTTT 3’

JHWF8-F：5’TTCACTTCTTCACTAGCTGCTCA 3’

JHWF8-R：5’TCCTGTGGGTGAATTCTCAG 3’

JHWF9-F：5’CCTGCATGAGACAAAACAGC 3’

JHWF9-R：5’AATCTCACTGCTTGGGATGG 3’。

3.权利要求1或2所述的SNP位点引物组合在金湖乌凤鸡品种鉴定中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，鉴定方法包括如下步骤：

（1）提取待测鸡基因组总DNA；

（2）根据所选SNP组合，利用权利要求2对应的引物对分别进行PCR扩增；

（3）将PCR扩增产物测序后、判断基因型；

（4）根据基因型结果，判断个体是否属于金湖乌凤鸡品种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中待测鸡的基因组DNA由该鸡种的个体翅静脉采血得到。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述金湖乌凤鸡中9个SNP位点JHWF1~JHWF9的基因型依次为AA、CT、GG、GG、GG、CC、TT、CC、TT。

7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，JHWF1~JHWF9的PCR产物长度分别为261 bp、219 bp、235 bp、199 bp、202 bp、169 bp、151 bp、250 bp、154 bp。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，判断方法为：如果所选SNP组合对应的基因型有一个不符合金湖乌凤鸡对应的基因型，则判定该个体不属于金湖乌凤鸡；如果所选的至少4个SNP位点组合的基因型符合金湖乌凤鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于金湖乌凤鸡的概率。