CN118207342A - 用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点组合、引物组合和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点组合、引物组合和方法，SNP位点组合包括AJ1位点到AJ6位点。采用本发明提供的SNP位点组合进行矮脚鸡品种鉴定时，全部6个SNP位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率为100％，只要有一个SNP位点基因型不符合矮脚鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于矮脚鸡。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒矮脚鸡产品的行为。
Description
技术领域
本发明涉及家禽品种鉴定方法，具体地，涉及一种用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点组合、引物组合和方法。
背景技术
矮脚鸡是我国著名的地方鸡种，也是贵州省兴义市的地方特色品种，其主要分布于贵州省兴义市，主要特征是胫短，整个体躯似匍匐地面，公鸡胫长6.5cm左右，母鸡胫长5.9cm左右，具有节粮、生产性能好，肉质鲜美，耐粗饲，抗病性能良好的特点，广受人们喜爱。在外来品种引进的情况下，对兴义矮脚鸡缺乏应有的保护措施，导致矮脚鸡品质退化，数量锐减。
目前矮脚鸡的品种鉴定多采用外观观察方式，缺乏科学有效的技术手段，导致鉴定错误率高，开发一种能有效准确鉴定矮脚鸡品种的方法，应用于矮脚鸡品种鉴定工作具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述矮脚鸡的品种鉴定缺乏科学有效的手段的问题，本发明提供了一种用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点组合、引物组合和方法，通过检测提供的矮脚鸡6个SNP位点的基因型来联合判断待测个体是否属于矮脚鸡。该方法操作简便，准确性高，可以准确鉴定矮脚鸡品种。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点组合，包括以下AJ1位点到AJ6位点：
| 序号 | 染色体 | 位点 | SNP位点ID | 参考基因组 | 突变位点 |
| AJ1 | NC_006088.5 | chr1:7507930 | rs734407661 | A | G |
| AJ2 | NC_006101.5 | chr14:8827506 | rs315122889 | T | C |
| AJ3 | NC_006089.5 | chr2:56863061 | rs14257422 | G | A |
| AJ4 | NC_006090.5 | chr3:109043732 | rs312884493 | G | A |
| AJ5 | NC_006098.5 | chr11:6572920 | rs317324839 | G | A |
| AJ6 | NC_006114.5 | chr27:4463767 | rs312736515 | G | A |
各SNP位点引物的核苷酸序列如下：
所述SNP位点的筛选方法为：利用2023年优化的55K京芯一号芯片(参考Gallus_gallus 6基因组重新设计，北京康普森生物技术有限公司)对12个鸡种(矮脚鸡，可能存在杂交的同为贵州地区的7个鸡种：乌蒙凤鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、乌蒙乌骨鸡、高脚鸡；其他地区代表性乌骨鸡品种：金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡；国外代表性引进用于杂交配套的品种：哈伯德肉鸡、来航鸡)的55000个SNP位点进行筛选确定，根据每个品种与其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数top 5％，最小等位基因频率>0.4，缺失率<0.2进行筛选，确定220个SNP位点，优先选择矮脚鸡参考基因组位点等位基因频率为1或0，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与矮脚鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，其他群体该等位基因频率为接近0或接近1的位点，最终确定用于矮脚鸡品种鉴定的6个SNP位点。
本发明另一方面提供一种矮脚鸡品种的鉴定方法，具体地，鉴定方法包括如下步骤：
(1)提取待测鸡基因组总DNA；
(2)根据所选SNP位点组合，利用对应的引物对分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)如果SNP位点组合对应的基因型有一个不符合矮脚鸡对应的基因型，则判定该个体不属于矮脚鸡；如果6个SNP位点组合对应的基因型全部符合矮脚鸡的基因型，则判定该个体属于矮脚鸡，6个SNP位点AJ1～AJ6的基因型依次为GG、CC、GG、GG、GG、GG。
步骤(2)中，AJ1～AJ6的PCR产物长度分别为250bp、227bp、205bp、239bp、167bp、213bp。各对应PCR产物信息如下：
AJ1--250(SNP位点：126bp处A/G)
GCTTTCACATGACCAGCAGAGAATACGATTTACATGGTGGATCTGA CCAACAGTGTAGCCACCTTTGAGTCCTTTGCAGCTGAATACTGTCCAA AACCAGGAACAGAATGAGAAGATCTAGCCAAK(A/G)CTCAGAAACAAACACAGATTTCATGGGCAAGTAGTTGTCTTTTTTTTAAGGGGGGAGGTGGGTTGAAGAAAGTGTGGAATTCTTTATGCTGACTGATGTCAAGATTGCTTTTGTAGCACTGCCA
AJ2--227bp(SNP位点：69bp处T/C)
GACTTGACCAAAATCGCATGTGGGCAACTGGGTGGCAGCACCGTACTTGGAAAACAGGTCTGGTGAGAK(T/C)GTCATGTGCTGAGAAGGAACCCCAACTCTATCAGCAATAAGCCTTTAACTCCCATGGGTTCACCCCATCCAGCCTCAGGGCTCAGTGAGCTCCCAGGCAGTACTGTACTACAGTGCAACACACTGGGCACACAACCCAGTGCAGCAGACAAGCAACAT
AJ3--205bp(SNP位点：153bp处G/A)
CAGACCTCCAAGCCTGAATCTGTGTACCACCCATCAGACTATCAGCCTTAGTTAATAAAACACCAGTTACTTTTGTAATTCTTGACACAAACATTCAGCAAATCAAAACAGATCTGCCTGCAGACCTATGAAAACAACACTAGGCTAGCAACK(G/A)GTCCTTTTCAGAAACTATTCTCCCTTTCAATTTTGCACTTGTGGATTGCCTA
AJ4--239bp(SNP位点：173bp处G/A)
CCAGAAACAGGCATAAACCATTCATAAGAGCTGAAAGAGTTTAGCCTGATTTTCAGTACATGGCTACTGCACACATGTTCAAGTTTCATGTGGTTCACTCTCTCCCTGCCCAGGTGTACAGGGAGAAGAAAGGGGAGAAAAAGGCTTCTTCCCAAGGTGAAGGACACAAAAAK(G/A)GTGAATTGAATCCAACTGTCAGCCCCAGCCTGCTGAACTTCACCATTTGCACTGAACACCTTCTGC
AJ5--167bp(SNP位点：128bp处G/A)
CGCTCCAAGCAAACAAAAGTCTCTCCCAGTTCACCCTTTTATGATCCTACAGATGCTATTAACAGATCAGCCTAAGGAACAGCAAATATTTGGTGAATCTTCAGGAGCATCAAGGAACTCACTGACCK(G/A)CATGGTAAATCTATGCAAATGAATCCCCAGAAAGAAACG
AJ6--213bp(SNP位点：171bp处G/A)
CCAAGGCCAATTTAGGTTGAGGCATAAACTATCTGTACTGAGAGTTTAAAGGATTGAATCTATCGCTCTCTACACAGCATTGTAGGAGTAGATATTTACAATAAGAACTCAGTGACTTATTTATACTTGAACCAAAGTACTGAGTCCTACTTCTCATGGAAGCTTTGTAAK(G/A)CTTAAAATAACCTGGACTA CTGAATGAATTATCCCCGAAGTT
通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
采用本发明提供的SNP位点组合进行矮脚鸡品种鉴定时，全部6个SNP位点联合基因型判定为乌矮脚鸡的概率为100％，只要有一个SNP位点基因型不符合矮脚鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于矮脚鸡。这种方法操作简便，准确性高，可以有效打击市场假冒矮脚鸡产品的行为。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1：SNP位点的筛选
利用2023年优化的55K京芯一号芯片(参考Gallus_gallus 6基因组重新设计，北京康普森生物技术有限公司)对12个鸡种(矮脚鸡；可能存在杂交的同为贵州地区的7个鸡种：乌蒙凤鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、乌蒙乌骨鸡、高脚鸡；其他地区代表性乌骨鸡品种：金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡；国外代表性引进用于杂交配套的品种：哈伯德肉鸡、来航鸡；每个品种随机选择200个个体)的55000个SNP位点进行筛选确定，根据每个品种与其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数top 5％，最小等位基因频率>0.4，缺失率<0.2进行筛选，确定220个SNP位点，优先选择矮脚鸡参考基因组位点等位基因频率为1或0，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与矮脚鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，其他群体该等位基因频率为接近0或接近1的位点，最终确定用于矮脚鸡品种鉴定的6个SNP位点。
SNP位点在矮脚鸡及其他品种中的基因型频率如下表：
6个SNP位点信息见下表：
| 序号 | 染色体 | 位点 | SNP位点ID | 参考基因组 | 突变位点 |
| AJ1 | NC_006088.5 | chr1:7507930 | rs734407661 | A | G |
| AJ2 | NC_006101.5 | chr14:8827506 | rs315122889 | T | C |
| AJ3 | NC_006089.5 | chr2:56863061 | rs14257422 | G | A |
| AJ4 | NC_006090.5 | chr3:109043732 | rs312884493 | G | A |
| AJ5 | NC_006098.5 | chr11:6572920 | rs317324839 | G | A |
| AJ6 | NC_006114.5 | chr27:4463767 | rs312736515 | G | A |
根据6个SNP位点的物理位置，基于红色原鸡参考基因组序列(Galgal5)，利用UCSC网站https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？hgsid＝791993043_MvNmFj6QPMRQsauOxQixq3gPtEUU，获得6个SNP位点DNA序列，然后利用Primer5.0设计引物。各SNP引物序列、PCR产物长度和退火温度见下表：
实施例2：矮脚鸡品种鉴定
随机选择江苏省重点实验室家禽种质资源遗传材料库保存的矮脚鸡30只、高脚鸡30只、黔东南小香鸡30只、竹乡鸡30只、乌蒙凤鸡30只、乌蒙乌骨鸡30只、兴文乌骨鸡30只、哈伯德30只，并做标记。翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组DNA，用AJ1～AJ6合计6个SNP位点的引物进行PCR扩增。
PCR总反应体系50μL：DNA模板2μL，dNTP(2mmol/L)4μL，Mg2+(3mmol·L-1)0.6μL，1×PCR反应缓冲液5μL，上、下游引物(10μmol·L-1)各1μL，Taq聚合酶(1U·μL-1)2.5μL，补超纯水至50μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。PCR扩增目的片段用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物送生物公司进行测序，同时序列进行多态性检测和基因型判定。
根据测序结果，6个位点联合基因型为GGCCGGGGGGGG的30个体判定为矮脚鸡，结果与标记一致。其余个体均不完全符合GGCCGGGGGGGG基因型，因此判定为非矮脚鸡。
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点组合，其特征在于，包括以下AJ1位点到AJ6位点：
AJ1位于NC_006088.5染色体1上第7507930位，其为A或G多态；
AJ2位于NC_006101.5染色体14上第8827506位，其为T或C多态；
AJ3位于NC_006089.5染色体2上第56863061位，其为G或A多态；
AJ4位于NC_006090.5染色体3上第109043732位，其为G或A多态；
AJ5位于NC_006098.5染色体11上第6572920位，其为G或A多态；
AJ6位于NC_006114.5染色体27上第4463767位，其为G或A多态。
2.根据权利要求1所述的SNP位点组合，其特征在于，所述SNP位点的筛选方法为：
利用55K京芯一号芯片对12个鸡种的55000个SNP位点进行筛选确定，根据每个品种与其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数top 5％，最小等位基因频率>0.4，缺失率<0.2进行筛选，确定220个SNP位点，优先选择矮脚鸡参考基因组位点等位基因频率为1或0，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与矮脚鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的SNP位点，其他群体该等位基因频率为接近0或接近1的位点，最终确定用于矮脚鸡品种鉴定的6个SNP位点，
其中，所述12个鸡种包括矮脚鸡、乌蒙凤鸡、兴文乌骨鸡、竹乡鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、乌蒙乌骨鸡、高脚鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、哈伯德肉鸡、来航鸡。
3.权利要求1或2所述的SNP位点组合对应的引物组合，其特征在于，各SNP位点的引物的核苷酸序列为：
AJ1-F：5’GCTTTCACATGACCAGCAGA3’
AJ1-R：5’TGGCAGTGCTACAAAAGCAA 3’
AJ2-F：5’GACTTGACCAAAATCGCATGT 3’
AJ2-R：5’ATGTTGCTTGTCTGCTGCAC 3’
AJ3-F：5’CAGACCTCCAAGCCTGAATC 3’
AJ3-R：5’TAGGCAATCCACAAGTGCAA3’
AJ4-F：5’CCAGAAACAGGCATAAACCA 3’
AJ4-R：5’GCAGAAGGTGTTCAGTGCAA 3’
AJ5-F：5’CGCTCCAAGCAAACAAAAGT 3’
AJ5-R：5’ATGTTGCTTGTCTGCTGCAC 3’
AJ6-F：5’CCAAGGCCAATTTAGGTTGA3’
AJ6-R：5’AACTTCGGGGATAATTCATTCA 3’。
4.矮脚鸡品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测鸡基因组总DNA；
(2)根据权利要求1或2所述的SNP位点组合，利用权利要求3对应的引物组合分别进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物测序后、判断基因型；
(4)如果SNP位点组合对应的基因型有一个不符合矮脚鸡对应的基因型，则判定该个体不属于矮脚鸡；如果6个SNP位点组合对应的基因型全部符合矮脚鸡的基因型，则判定该个体属于矮脚鸡，6个SNP位点AJ1～AJ6的基因型依次为GG、CC、GG、GG、GG、GG。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中待测鸡的基因组DNA由该鸡种的个体翅静脉采血得到。
6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，AJ1～AJ6的PCR产物长度分别为250bp、227bp、205bp、239bp、167bp、213bp。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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