CN116987795B

CN116987795B - 一种鉴定隐性白羽鸡的分子标记组合及其应用

Info

Publication number: CN116987795B
Application number: CN202311161591.6A
Authority: CN
Inventors: 薛倩; 韩威; 李国辉; 周成浩; 张会永; 殷建玫; 蒋一秀; 朱云芬
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2023-09-11
Filing date: 2023-09-11
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2043-09-11
Also published as: CN116987795A

Abstract

本发明公开了一种鉴定隐性白羽鸡的分子标记组合及其应用，属于分子生物学检测领域。所述分子标记组合的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1‑12所示的序列，包括SNP1‑SNP12多态性位点。本发明基于25个代表性中国地方鸡种和包括隐性白羽鸡在内的2个引进品种的大规模群体鉴定特异性SNPs位点，结合现有特异性SNP位点的检测方法和AHP层次分析法综合考虑特异性位点的等位基因频率和基因型类型，确保了鉴定的准确性，同时提高了检测效率和评价的科学性。本发明通过使用分子标记技术对隐性白羽鸡品种特异性进行科学地鉴定和评价，操作简单，结果可靠，可以为鸡遗传资源保护和合理利用提供科学依据。

Description

一种鉴定隐性白羽鸡的分子标记组合及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种鉴定隐性白羽鸡的分子标记组合及其应用。

背景技术

隐性白羽鸡属于快大白羽肉鸡，是从白洛克(或白温多得)中选育而成，原产于法国。隐性白羽鸡种体质健壮，性情温驯，生长速度快，繁殖性能较好。体型较大，呈元宝形，胸宽而深，体态丰满，其羽毛的白色为隐性性状，皮肤与胫部为黄色。隐性白羽鸡在优质鸡配套上的应用对我国优质鸡产业的发展起到了巨大的推动作用。

分子标记(Molecular Markers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。SNP分子标记是指在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富，理论上，每个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，包括转换、颠换、缺失和插入，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2:1。SNP是基因组中最常见的多态形式，具有很高的遗传稳定性。SNPs被认为是最主要的表型变异性的遗传学来源，它在特定的种群里是有个体差异的，特定的SNP的等位基因频率在不同的种群里可以不同。SNP标记为畜禽品系鉴别、亲缘关系鉴定提供更准确的辨别。标记密度的提高为研究者们提供更为精细的遗传图谱。

SNP分子检测技术有多种，包括微卫星检测、酶切扩增、基因芯片、高通量测序等。限制性酶切位点关联DNA测序技术(restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-seq)是在二代测序技术基础上发展起来的一种简化基因组技术。简化基因组测序(reduced-representation sequencing，RRGS)是一种利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序获得海量遗传多态性标记来充分代表目标物种全基因组信息的测序策略。RAD测序文库构建是对基因组DNA片段进行酶切和随机打断，选取一端带有酶切位点，另一端为随机打断点的片段进行建库测序。RAD-seq能够降低基因组的复杂度，操作简便，同时不受参考基因组的限制，可快速鉴定出高密度的SNP。但是目前报道的隐性白羽鸡的分子标记多为经济性状相关标记，难以用于评价隐性白羽鸡遗传多样性，尚不能用于对隐性白羽鸡的纯种鉴定，因此，基于简化基因组测序对隐性白羽鸡进行SNP分子标记筛选具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定隐性白羽鸡的分子标记组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过在大规模的多个品种鸡群体中筛选出多个特异性SNP分子标记，其可以用于准确鉴定隐性白羽鸡，缓解了现有技术中缺少能够评价隐性白羽鸡遗传多样性的分子标记和现有纯种鉴定方法不准确的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种鉴定隐性白羽鸡品种的分子标记组合，所述分子标记组合的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1-12所示的序列，其中，SEQ ID NO.1-12所示序列的分子标记组合存在以下SNP1-SNP12多态性位点：

所述SNP1为SEQ ID NO.1所示分子标记的11bp处存在C/A突变；

所述SNP2为SEQ ID NO.2所示分子标记的11bp处碱基存在T/C突变；

所述SNP3为SEQ ID NO.3所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变；

所述SNP4为SEQ ID NO.4所示分子标记的11bp处碱基存在G/A突变；

所述SNP5为SEQ ID NO.5所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变；

所述SNP6为SEQ ID NO.6所示分子标记的11bp处碱基存在T/C突变；

所述SNP7为SEQ ID NO.7所示分子标记的11bp处碱基存在G/A突变；

所述SNP8为SEQ ID NO.8所示分子标记的11bp处碱基存在T/A突变；

所述SNP9为SEQ ID NO.9所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变；

所述SNP10为SEQ ID NO.10所示分子标记的11bp处碱基存在G/T突变；

所述SNP11为SEQ ID NO.11所示分子标记的11bp处碱基存在C/G突变；

所述SNP12为SEQ ID NO.12所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变。

优选的是，所述SNP1的基因型为CC、AA和AC；所述SNP2的基因型为TT、CC和CT；所述SNP3的基因型为CC、TT和TC；所述SNP4的基因型为GG、AA和AG；所述SNP5的基因型为CC、TT和TC；所述SNP6的基因型为TT、CC和CT；所述SNP7的基因型为GG、AA和AG；所述SNP8的基因型为TT、AA和AT；所述SNP9的基因型为CC、TT和TC；所述SNP10的基因型为GG、TT和TG；所述SNP11的基因型为CC、GG和GC；所述SNP12的基因型为CC、TT和TC。

本发明还提供扩增所述的分子标记组合的引物组合，所述引物组合包括以下引物对1-引物对12：

本发明还提供所述的分子标记组合，或所述的引物组合在鉴定隐性白羽鸡品种中的应用。

本发明还提供所述的分子标记组合，或所述的引物组合在制备鉴定隐性白羽鸡品种的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种鉴定隐性白羽鸡品种的方法，包括以下步骤：

(1)以待测鸡个体的全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取权利要求1所述的分子标记组合或者包含所述分子标记组合的基因片段组合；

(2)经测序，判断所述分子标记组合中SNP1-SNP12多态性位点的基因型，并对不同多态性位点的基因型进行权重分析，根据计算的最终权重值，评价待测隐性白羽鸡个体的评分，根据所述评分鉴定隐性白羽鸡品种；其中，所述评分的计算公式为：

S＝AX

S为血源评价总得分，X为SNP的基因型类型向量，A为对应基因型的加权评分向量；

所述A的值根据下表得出：

表中，基因型1为野生型纯合子，基因型2为杂合子，基因型3为突变型纯合子；

(3)所述评分﹥50，所述待测鸡个体鉴定为隐性白羽鸡。

优选的是，所述PCR扩增的引物组合为以下表所示的引物对1-引物对12：

优选的是，所述PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，MgCl₂ 2.2uL，dNTPs0.8uL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL以及ddH₂O 11.8μL。

优选的是，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火温度40s，72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物。

本发明还提供一种鉴定隐性白羽鸡的试剂盒，包括用于检测所述的分子标记组合的试剂和引物。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的鉴定隐性白羽鸡的分子标记组合是基于25个代表性中国地方鸡种和包括安卡红鸡在内的2个引进品种的大规模群体鉴定特异性SNPs位点，筛选出得到的；本发明还结合现有特异性SNP位点的检测方法和AHP层次分析法，综合考虑特异性位点的等位基因频率和基因型类型，在确保鉴定准确性的同时提高了检测效率和评价的科学性。本发明通过使用分子标记技术对隐性白羽鸡进行科学的品种特异性鉴定和评价，操作简单且结果可靠，可以为鸡遗传资源保护和合理利用提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的隐性白羽鸡及其他鸡种聚类图；WX、PJ、DL、ZZ、CH、WC、HX、JH、RW、AK、XS、LY、HOU、WS、YB、LA、LS、SG、BY、BJ、DG、DX、WH、BE、XJ、GS和DJ分别为大围山微型鸡、瓢鸡、独龙鸡、藏鸡、茶花鸡、文昌鸡、惠阳胡须鸡、金湖乌凤鸡、隐性白羽鸡、安卡红鸡、萧山鸡、鹿苑鸡、天津猴鸡、汶上芦花鸡、元宝鸡、琅琊鸡、狼山鸡、寿光鸡、北京油鸡、边鸡、大骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、安义瓦灰鸡、白耳鸡、仙居鸡、固始鸡、河南斗鸡27个鸡品种字母简称；

图2为本发明AHP层次分析法进行权重计算流程图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1鸡SNP分子标记的筛选

1、血液样品采集

基于前期针对地方鸡(Gallus gallus)种的遗传进化研究，进一步根据不同鸡种的遗传背景选取25个地方鸡种和2个引进品种作为研究对象。25个地方鸡种素材及2个引入品种主要来源于国家地方鸡种基因库(江苏)的纯种保种群体，每个品种公鸡10只、母鸡20只；元宝鸡(YB，n＝8)样品来源于研究所馈赠；独龙鸡(DL，n＝10)序列来源于NCBI数据库(表1)；各品种确保不会出现杂交群体的干扰，如图1所示系统进化树上每一个品种个体可形成独立的分支。

对上述实验个体采用无菌翅静脉采血1～1.5mL，加入柠檬酸钠抗凝剂混匀，-80℃保存备用。

表1样品信息

2、DNA样品获取

使用DNA快速提取试剂盒提取所有个体基因组DNA，并使用凝胶电泳和Nanodrop进行DNA质量和浓度检测；Qubit 2.0对DNA样品进行准确定量，选取质量≥1μg的样品。将合格样品置于-80℃保存，以备建库测序使用。

3、简化基因组RAD-seq建库测序

抗凝血样提取DNA，对DNA质检合格的样品采用ddRAD建库方式构建长度范围在300～500bp的Pair-end文库，进行简化基因组RAD-seq测序，对测序得到的原始reads(双端序列)进行数据评估，得到各个样品的原始reads，将reads使用BWAMEM0.7.15软件比对到鸡参考基因组(GRCg6a，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1375922358？report＝fasta)上。

4、数据质控

对原始测序数据进行质量控制，利用samtools程序对原始测序数据进行质量控制，对正确率99％的碱基数目比例(Q20)≥95％进行过滤；通过GATK软件进行SNP检测，双酶切基因组测序的覆盖深度≥60％，SNP在鸡群中单核苷酸多态性检出(Callrate)≥70％，最小等位基因频率(MAF)≥0.05；在此基础上，单个鸡种中SNP的检出率≥90％。

5、统计分析及位点筛选

使用Haploview4.1软件进行连锁不平衡(LD)分析；PopGene软件计算平均杂合度(Ho)、近交系数(Fis)和群体分化指数(Fst)；Admixture软件进行群体聚类分析，利用极大似然法(Maximum likelihood，ML)构建系统进化树(phylogenetic tree)，并使用Shimodaira-Hasegawa test方法判断每个节点的可信度；对经过质量控制后的SNP进行选择信号分析，通过PLINK 1.9软件采用遗传分化系数(Fst)方法，以100kb为窗口，10kb为步长进行滑动进行检测，酶切效果不好的染色体片段或个体删除，不用做分析，确保等位基因频率计算准确。

6、特异性位点筛选

鉴定到12个隐性白羽鸡特异性SNPs，分布在1、3、4、5、7、9、10、13和14号染色体上(见表2，SNP1-SNP12对应的序列依次编号为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：12)。

表2鉴定得到的特异性SNPs信息

注：上表中带有下划线的为单核苷酸多肽性突变位点。M表示该位点为C或A，Y表示该位点为T或C，R表示该位点为A或G，W表示该位点为A或T，K表示该位点为G或T，S表示该位点为C或G。

7、隐性白羽鸡特异SNP性位点权重计算

建立特异性位点的层次结构模型(如图2所示)，并使用1～9标度法构造准则层两两比较矩阵(表3)，根据表2的结果，针对现有特异性位点检测效率较低和综合评价准确性较差的薄弱环节，充分考量等位基因频率和优势等位基因型，初始评分使用1～9标度法分级，分别对等位基因频率和优势等位基因型进行分级：

1代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上具有相同的重要性；

3代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者稍重要；

5代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者明显重要；

7代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者极其重要；

9代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者强烈重要；

2，4，6，8表示上述相邻判断的中间值。

表3构造准则层两两比较矩阵

	SNP1	SNP2	SNP3	SNP4	SNP5	SNP6	SNP7	SNP8	SNP9	SNP10	SNP11	SNP12
													SNP1	1.00	0.56	0.56	1.67	1.00	0.71	0.71	5.00	1.00	1.67	1.00	5.00
SNP2	1.80	1.00	1.00	3.00	1.80	1.29	1.29	9.00	1.80	3.00	1.80	9.00
													SNP3	1.80	1.00	1.00	3.00	1.80	1.29	1.29	9.00	1.80	3.00	1.80	9.00
SNP4	0.60	0.33	0.33	1.00	0.60	0.43	0.43	3.00	0.60	1.00	0.60	3.00
													SNP5	1.00	0.56	0.56	1.67	1.00	0.71	0.71	5.00	1.00	1.67	1.00	5.00
SNP6	1.40	0.78	0.78	2.33	1.40	1.00	1.00	7.00	1.40	2.33	1.40	7.00
													SNP7	1.40	0.78	0.78	2.33	1.40	1.00	1.00	7.00	1.40	2.33	1.40	7.00
SNP8	0.20	0.11	0.11	0.33	0.20	0.14	0.14	1.00	0.20	0.33	0.20	1.00
													SNP9	1.00	0.56	0.56	1.67	1.00	0.71	0.71	5.00	1.00	1.67	1.00	5.00
SNP10	0.60	0.33	0.33	1.00	0.60	0.43	0.43	3.00	0.60	1.00	0.60	3.00
													SNP11	1.00	0.56	0.56	1.67	1.00	0.71	0.71	5.00	1.00	1.67	1.00	5.00
SNP12	0.20	0.11	0.11	0.33	0.20	0.14	0.14	1.00	0.20	0.33	0.20	1.00

采用AHP层次分析结果的方法对筛选到的种质特异性SNP位点进行加权评分。利用AHP层次分析法进行权重计算时，需要进行一致性检验分析，用于研究评价权重计算结果的一致性检验结果，即计算一致性指标组合信度(CR值)，具体如下：

第一：先描述上述计算得到的置信区间(CI值)[CI＝(最大特征根-n)/(n-1)]；

第二：结合判断矩阵阶数得到平均随机一致性指标(RI值)；

第三：计算CR值，并且进行一致性判断。

计算公式如下，其中CI为置信区间，λmax为最大特征根，n为对象特征数，A特征矩阵，W为A矩阵的均一化矩阵，公式如下：

结合特征向量(如表4)可计算出最大特征根，接着利用最大特征根值计算得到CI值，CI值用于下述的一致性检验使用。

表4 AHP层次分析结果

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注：其中基因型1为野生型纯合子，基因型2为杂合子，基因型3为突变型纯合子，缺失位点权重为0。

根据表4计算的最终权重值，评价待测隐性白羽鸡个体的评分。

S＝AX

其中S为血源评价总得分，X为SNP的基因型类型向量，A为对应基因型的加权评分向量。

实施例2隐性白羽鸡分子标记的应用

1、隐性白羽鸡、安卡红鸡和金湖乌凤鸡保种群个体血液采集

使用医用一次性注射器随机采集隐性白羽鸡及其近缘的鸡种(安卡红鸡和金湖乌凤鸡)公、母鸡翅静脉全血0.5-1.0mL，每个鸡种以5只为例，采集后迅速注入含有2μL0.5mol/LEDTA-2Na抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用。

2、DNA提取和质量检测

常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2-0.3mL，采用常规酚-氯仿法提取个体血液中基因组DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；将合格样品置于-80℃保存，以备SNP检测使用。

3、隐性白羽鸡品种特异性基因的SNP标记检测

引物设计：对筛选得到的隐性白羽鸡品种特性基因的SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位点的一段序列。利用鸡基因组DNA作为模板，使用Primer3在线软件(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)设计引物(见表5)进行PCR扩增。

PCR扩增和检测：PCR扩增总体积为20μL：1μL DNA模板，其浓度为100ng/μL，2μL10×PCR Buffer，0.8μL dNTP，浓度为10mmol/L，上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL，Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL，2.2μL MgCl₂，浓度为25mmol/L以及ddH₂O11.8μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火温度40s，72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物备用；送测。

表5 SNP位点及PCR扩增引物序列

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4、隐性白羽鸡品种鉴定，结果如下表6所示。

表6隐性白羽鸡与近缘鸡种基因型鉴定

5、隐性白羽鸡个体鉴定评价和T检验，结果如下表7所示。

表7隐性白羽鸡个体鉴定评价和T检验

/>

注：**标示差异极显著，P<0.01。

表7结果显示：利用本发明筛选的分子标记可高效、准确评价隐性白羽鸡个体的血缘纯度，实现品种鉴定。经计算和考虑到基因组重组和检测缺失情况的存在以及杂交群体的影响等多方面的原因，确定血源评价总分﹥50分，即判定为隐性白羽鸡。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种鉴定隐性白羽鸡品种的分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1-12所示的序列，其中，SEQ ID NO.1-12所示序列的分子标记组合存在以下SNP1-SNP12多态性位点：

所述SNP1为SEQ ID NO.1所示分子标记的11bp处存在C/A突变；

所述SNP2为SEQ ID NO.2所示分子标记的11bp处碱基存在T/C突变；

所述SNP3为SEQ ID NO.3所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变；

所述SNP4为SEQ ID NO.4所示分子标记的11bp处碱基存在G/A突变；

所述SNP5为SEQ ID NO.5所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变；

所述SNP6为SEQ ID NO.6所示分子标记的11bp处碱基存在T/C突变；

所述SNP7为SEQ ID NO.7所示分子标记的11bp处碱基存在G/A突变；

所述SNP8为SEQ ID NO.8所示分子标记的11bp处碱基存在T/A突变；

所述SNP9为SEQ ID NO.9所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变；

所述SNP10为SEQ ID NO.10所示分子标记的11bp处碱基存在G/T突变；

所述SNP11为SEQ ID NO.11所示分子标记的11bp处碱基存在C/G突变；

所述SNP12为SEQ ID NO.12所示分子标记的11bp处碱基存在C/T突变。

2.如权利要求1所述的分子标记组合，其特征在于，所述SNP1的基因型为CC、AA和AC；所述SNP2的基因型为TT、CC和CT；所述SNP3的基因型为CC、TT和TC；所述SNP4的基因型为GG、AA和AG；所述SNP5的基因型为CC、TT和TC；所述SNP6的基因型为TT、CC和CT；所述SNP7的基因型为GG、AA和AG；所述SNP8的基因型为TT、AA和AT；所述SNP9的基因型为CC、TT和TC；所述SNP10的基因型为GG、TT和TG；所述SNP11的基因型为CC、GG和GC；所述SNP12的基因型为CC、TT和TC。

3.扩增权利要求1或2所述的分子标记组合的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括以下引物对1-引物对12：

SNP编号引物对编号上游引物下游引物 SNP1 引物对1 CTGCTTCCTACAGCAGTTTTCC CACACACACCAACACCACCT SNP2 引物对2 TGTCAATAGCAACTGATCAAAATG GGCCACCACATCACTGAATA SNP3 引物对3 AGCATCTGTTCAAGGCAGTG CTAATCGGCTGCAATAAGCA SNP4 引物对4 TGGAACATTTTGGAGCTTTCA TTGCAGAAAGCAATTTTCACA SNP5 引物对5 GGAACTGAACTTGGCTTCTCA TGAGTGGAAAAAGCAGCAAG SNP6 引物对6 AAACATCGATTTCATTTTTACTATTCA AATTGCTTTAGAATCTTCCATCTGA SNP7 引物对7 CAAATCCTAACTCATATATTGTCATTG TCCCATTCTCCTCACTTTTTG SNP8 引物对8 AGGGTAAGCATTAAACAAACAATTA ACCCAAAATGGGCACAAAC SNP9 引物对9 GGGAGACCGAAAAGATTGAA CTATCCGTGCAGCCCACAT SNP10 引物对10 GCAGGAGGTCCAGCTGTCT TTCTTGAAATGCAACTGCAAA SNP11 引物对11 GTTTGCCAACTCTCTGCTCCT CAGTCAACGGCTTTCACTCA SNP12 引物对12 TCCCTTTCCCCACAGACTTA TCCAGCTCTGCTCTTTCTGA

。

4.如权利要求3所述的引物组合在鉴定隐性白羽鸡品种中的应用。

5.如权利要求3所述的引物组合在制备鉴定隐性白羽鸡品种的试剂盒中的应用。

6.一种鉴定隐性白羽鸡品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以待测鸡个体的全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取权利要求1所述的分子标记组合或者包含所述分子标记组合的基因片段组合；

（2）经测序，判断所述分子标记组合中SNP1-SNP12多态性位点的基因型，并对不同多态性位点的基因型进行权重分析，根据计算的最终权重值，评价待测隐性白羽鸡个体的评分，根据所述评分鉴定隐性白羽鸡品种；其中，所述评分的计算公式为：

S=AX

S为血源评价总得分，X为SNP的基因型类型向量，A为对应基因型的最终权重向量；

所述X和A的值根据下表得出：

（3）所述评分﹥50，所述待测鸡个体鉴定为隐性白羽鸡。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物组合为以下表所示的引物对1-引物对12：

。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer2µL，MgCl₂ 2.2µL，dNTPs 0.8 µL，上下游引物各1µL，DNA模板1µL，Taq DNA聚合酶0.2µL以及ddH₂O 11.8µL。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火温度40s，72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物。

10.一种鉴定隐性白羽鸡的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的引物组合。