CN114317776B - 一种与鸭产蛋性状相关的分子标记组合、获得方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种与鸭产蛋性状相关的分子标记组合、获得方法及应用，涉及水禽分子生物技术领域。从母鸭基因组中扩增Z号性染色体，测序获得一种作为金定鸭产蛋性状相关的纯和的分子标记组合，该分子组合涉及三段产蛋性状相关的基因片段，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，分子标记为SEQ ID NO.1的第81bp处发生A81G的碱基突变，SEQ ID NO.2的第80bp处发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处发生A127G的碱基突变。通过该分子标记组合能够为金定鸭产蛋性能的早期选育提供一种快速、简便、价格低廉的基因分析方法，有利于筛选出产蛋性能相对较好的金定鸭个体，指导金定鸭产蛋性能早期分子标记辅助选育。
Description
技术领域
本发明涉及水禽分子生物技术领域，具体为一种与鸭产蛋性状相关的分子标记组合、获取方法及其应用。
背景技术
维甲酸相关孤核受体ROR，是核受体大家族的亚家族之一，由RORa、RORb、RORc三大亚型构成，ROR在哺乳动物的发育、免疫、生物节律、细胞代谢等方面均起到了关键作用，其中对生物节律的调节起作用的主要是RORb，已有研究表明，RORb-/-雄性小鼠表现出生育能力的延迟[Andre等人，1998]，Wang(2015)等人在蓝白光鸽子的卵巢转录组测序中发现RORb差异表达，Chen(2021)等人在高低产的母鸡卵泡中筛选到RORb差异表达基因，从而推测RORb与产蛋性能可能相关，有关鸭RORb基因位点多态性与鸭产蛋性能的相关性尚未见报道。
芳基硫酸酯酶B(ARSB)是一种溶酶体酶，又称N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，在人类中，多项研究表明，这种酶活性的缺乏会导致未降解底物的积累和溶酶体储存障碍，即Maroteaux-Lamy病(粘多糖病VI型)，尚未见其在家禽中的相关研究报道。
金定鸭，又称绿头鸭、华南鸭，是中国福建省的一个蛋鸭品种，被列入《中国家禽品种志》和国家级畜禽遗传资源保护名录，金定鸭属麻鸭，体格大、耐粗饲、产蛋多、蛋大、蛋壳为青色，金定鸭适宜滩涂地区放牧，产蛋量高，年产蛋260至300枚，平均蛋重72g，通过对鸭种进行持续优化选择，培育出符合市场需求的产蛋高，蛋重大的优良品系已成为现今畜禽育种专家的目标之一。
本发明将鸭RORb和ARSB基因作为金定鸭早期产蛋性状的候选基因，提供了鸭RORb基因内含子1，ARSB内含子1和外显子8的三个SNP位点作为金定鸭早期产蛋性能的分子标记组合，并公开了应用方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种中国地方鸭金定鸭早期产蛋性状相关基因的分子标记组合，另外，本发明还公开了该分子标记的获取方法和应用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种中国地方鸭金定鸭早期产蛋性状相关基因的分子标记组合，另外，本发明还公开了该分子标记的获取方法和应用。
本发明公开了一种中国地方鸭金定鸭早期产蛋性状相关基因的分子标记组合，选择RORb基因内含子1第50630位核苷酸A→G的突变点，基因ARSB的内含子1的第2330位核苷酸G→A突变和外显子8的第65882bp位核苷酸A→G的突变点作为分子标记组合，所述分子标记组合的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，在SEQ ID NO.1的第81bp处发生A81G的碱基突变，SEQ ID NO.2的第80bp处发生G80A的碱基突变，SEQ IDNO.3的第127bp处发生A127G的碱基突变。
本发明还公开了一种利用以上所述金定鸭早期产蛋性状相关基因的分子标记组合进行快速选育方法，检测RORb和ARSB基因的SNP位点，即SEQ ID NO.1的第81bp是否发生A81G的碱基突变，SEQ ID NO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处是否发生A127G的碱基突变作为选育条件。
优选的，检测RORb和ARSB基因的SNP位点，即SEQ ID NO.1的第81bp是否发生A81G的碱基突变，SEQ ID NO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处是否发生A127G的碱基突变所采用的步骤包括：
1)样本基因组DNA提取；
2)样本质量检测；
3)多重PCR；
4)二代测序的方法对扩增子进行高通量测序；
5)测序结果使用生物信息学方法，区分不同的样本，最终获得每个位点的突变信息。
优选的，利用RORb和ARSB基因的分子标记组合进行快速选育方法中所用的样本为鸭的血液样本，其提取采用天跟生化科技(北京)有限公司血液基因组DNA提取系统(0.1-20mL)(天跟生物，DP349)。
优选的，采用琼脂糖凝胶电泳和生物风光光度计检测样本质量，琼脂糖凝胶电泳检测有目的条带，拖带不明显，生物风光光度计检测DNA浓度在20ng/μL,OD260/280和OD260/230在1.8-2.0之间的判定为合格样本。
优选的，该方法所用的PCR扩增引物组合为：
上游引物序列1：5’-ttgatatgacactacaacagttcc-3’，(SEQ ID NO.4)
下游引物序列1：5’-ctggtttttctccctcttaaatt-3’，(SEQ ID NO.5)
上游引物序列2：5’-agagtactgcaaaaatagctttcc-3’,(SEQ ID NO.6)
下游引物序列2：5’-aaaagcctaacaggtaacaactac-3’,(SEQ ID NO.7)
上游引物序列3：5’-ttcgtgatcctgaagagaaaaatg-3’,(SEQ ID NO.8)
上游引物序列3:5’-tacataaaatgaactctgctgcag-3’。(SEQ ID NO.9)
优选的，该方法需进行多重PCR扩增。
其中，第一轮PCR配置方法为，三对引物工作液配制PCR mix，分装于每个个体相对应的96孔板中，取样本板充分解冻、震荡，1000rpm离心1s后进行加样，加样时每板预留2个孔，分别加入阳性及阴性对照，一轮扩增体系为Primer(50mM)2μL，dNTP(2.5mM)0.8μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，10X buffer1μL，基因组DNA(20ng/μL)2μL，Mg2+(100mM)1μL，石蜡油10μL，ddH2O 3.2μL，共计20μL，第一轮PCR反应条件如下：①95℃15min，1cycle；②94℃30s，60℃10min，4cycles；③94℃30s，60℃1min，72℃30s，20cycles。
第二轮PCR扩增体系为，一轮产物每孔加ddH2O 100μL，瞬时离心，室温静置10min，以稀释液作为二轮扩增模板，扩增体系Barcode(2μM)3.6μL，dNTP(2.5mM)0.8μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，一轮产物样本10μL，Mg2+(100mM)1μL，10X buffer 2μL，ddH2O 3.6μL，石蜡油20μL，总体系40μL。
第二轮PCR扩增反应条件为：①95℃15min，1cycle；②94℃30s，60℃4min，5cycles；③94℃30s，65℃1min，72℃30s，10cycles。
优选的，对二轮扩增获得的产物进行混样，对混样后的文库进行纯化，对纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度(10ng/μL)。
优选的，该方法中的高通量测序由上海翼和生物有限公司采用Illumina X-10测序平台测序完成。
优选的，采用生物信息学的方法，对三个突变位点的信息进行分类汇总，获得每个样本每个突变位点的信息。
(三)有益效果
本发明提供了一种与鸭产蛋性状相关的分子标记组合、获得方法及应用。
具备以下有益效果：
1、本发明通过检测RORb和ARSB基因的SNP位点，即SEQ ID NO.1的第81bp是否发生A81G的碱基突变，SEQ ID NO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处是否发生A127G的碱基突变对金定鸭早期产蛋性状进行选育。
2、本发明能够为金定鸭早期产蛋性状相关基因的检测提供一种快速、简便、价格低廉的基因分析方法，有利于筛选出产蛋量高，蛋重大的金定鸭个体，指导金定鸭早期产蛋性状的分子标记辅助选育。
3、本发明将鸭RORb和ARSB基因作为金定鸭早期产蛋性状的候选基因，其中RORb内含子1的第50630位核苷酸，A→G突变，ARSB内含子1的第2330位核苷酸G→A突变和外显子8的第65882bp位核苷酸A→G的突变点作为分子标记组合作为筛选位点组合，建立了基于二代测序的SNP快速检测方法，并公开了应用方法。
附图说明
图1为核苷酸序列所用引物对序列信息图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，如无特殊说明，所用专业术语按照以下所述理解：
1)SNP：单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)。
实施例一：
选取中国地方鸭金定鸭为本发明实施例，具体应用本发明的步骤如下：
金定母鸭群体从0日龄开始地面饲养，100d时开始转移至笼上饲养，每只鸭一个笼位，观察并记录每只鸭的产蛋情况，300d时，随机选取225只金定鸭母鸭，连续称蛋重3d，统计每只鸭从开产日到300d的产蛋量，翅静脉采血，放入含有抗凝剂的2mL EP管中，用于基因组DNA的提取，采用琼脂糖凝胶电泳和生物风光光度计检测样本质量，质量合格的样本用于后续高通量测序。
PCR扩增SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列所用引物对序列信息为：
上游引物序列1：5’-ttgatatgacactacaacagttcc-3’，(SEQ ID NO.4)
下游引物序列1：5’-ctggtttttctccctcttaaatt-3’，(SEQ ID NO.5)
上游引物序列2：5’-agagtactgcaaaaatagctttcc-3’,(SEQ ID NO.6)
下游引物序列2：5’-aaaagcctaacaggtaacaactac-3’,(SEQ ID NO.7)
上游引物序列3：5’-ttcgtgatcctgaagagaaaaatg-3’,(SEQ ID NO.8)
上游引物序列3:5’-tacataaaatgaactctgctgcag-3’.(SEQ ID NO.9)
采用多重PCR方法对样本进行扩增，其中，第一轮PCR配置方法为，三对引物工作液配制PCR mix，分装于每个个体相对应的96孔板中，取样本板充分解冻、震荡，1000rpm离心1s后进行加样，加样时每板预留2个孔，分别加入阳性及阴性对照，一轮扩增体系为Primer(50nM)2μL，dNTP(2.5mM)0.8μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，10X buffer 1μL，基因组DNA(20ng/μL)2μL，Mg2+(100mM)1μL，石蜡油10μL，ddH2O 3.2μL，共计20μL，第一轮PCR反应条件如下：①95℃15min，1cycle；②94℃30s，60℃10min，4cycles；③94℃30s，60℃1min，72℃30s，20cycles。
第二轮PCR扩增体系为，一轮产物每孔加ddH2O 100μL，瞬时离心，室温静置10min，以稀释液作为二轮扩增模板，扩增体系Barcode(2μM)3.6μL，dNTP(2.5mM)0.8μL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，一轮产物样本10μL，Mg2+(100mM)1μL，10X buffer 2μL，ddH2O 3.6μL，石蜡油20μL，总体系40μL。
第二轮PCR扩增反应条件为：①95℃15min，1cycle；②94℃30s，60℃4min，5cycles；③94℃30s，65℃1min，72℃30s，10cycles。
对二轮扩增获得的产物进行混样，对混样后的文库进行纯化，对纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度(10ng/μL)。
定量后的纯化产物，由上海翼和生物有限公司采用Illumina X-10测序平台进行高通量测序测序。
生物信息学的方法对测序后获得三个突变位点的信息进行分类汇总，获得每个样本每个突变位点的信息。
本标记组合的三个SNPs位点均位于鸭的Z号性染色体，分别为A→G，G→A，A→G，其突变组成的单倍型组合有六种，分别为GAG,AGG,AGA,AAG,GGA,GAA。
利用SPSS 20.0软件的一般线性模型对6种单倍型与300日龄金定鸭产蛋性状进行关联分析，关联分析结果见表1，数据以mean±S.D的方式呈现。
表1，6种单倍型与300日龄金定鸭产蛋性状的关联分析
注：同一生长性状基因型间差异显著用不同肩标表示。
由表1可知，金定鸭GAG单倍型频率最高，为0.6，300日龄时的平均蛋重最高，为77.93g，产蛋数最低，平均为123.24个，总蛋重较高，为9564.32g，该单倍型为蛋重大的优选单倍型；平均蛋重其次的是AGG单倍型，平均蛋重为75.3g，产蛋数较高，为135个，总蛋重最高，为10170g，但其单倍型频率最低，仅为0.013，该单倍型可作为蛋重和产蛋量高的优选单倍型；而GAA单倍型的鸭平均蛋重最低，仅为66.30g，但其产蛋量较高，为139个，总蛋重也居于中间水平，可作为蛋重小、产蛋数高的优选单倍型，结果表明，综合蛋重，产蛋数和总蛋重三个指标，GAG单倍型在金定鸭品种中占比大，平均蛋重大，产蛋数虽然略低，但总蛋重较高；AAG单倍型在金定鸭中的比重其次，蛋重、产蛋量和总蛋重均都相对较高；AGG单倍型在金定鸭中的比重较低，但蛋重、产蛋数及总蛋重均较高；因此，GAG，AAG，AGG单倍型为有利单倍型，可用于金定鸭早期产蛋性状的选育。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
SEQ NO:1: 长度为210bp, 在该序列的第81bp 处有一个A/G 突变，已用斜体标出。
TTGATATGACACTACAACAGTTCCCAACCTGAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAA ATAAATAAAATAAACAGATAAATAAATTATACATAATTATAATAAACAGATAAATAAATTTATAAAAT
ATAATTTATAATAAATTATAAATTATTATAAACATTATAATTTATAGTTAGAGCCTGGTTTTTCTCCC
TCTTAAATT
SEQ NO:2:长度为204bp, 在该序列的第80bp 处有一个G/A 突变，已用斜体标出。
AGAGTACTGCAAAAATAGCTTTCCTAGCCTTTGCCACCTTTTCCTCCAGTAAATACTCCAATAAA GGCACAAGCCCTGTGGCTGTAACTGCATTGCACCTTTTTGTCCATCTGCGTTCTATTTTAATTTTT
GCATTCCACGTTGAGGTGCTATCCCTATTCCTTCAGGAAGACTGTAATGGTAGTTGTTACCTGTT
AGGCTTTT
SEQNO:3: 长度为223bp, 在该序列的第127bp处有一个A/G 突变，已用斜体标出。
TTCGTGATCCTGAAGAGAAAAATGA GTTGTCTGAAAAATATCCTCATGTGGTGAAAAAACTGC TCTCACGTCTTCAGTACTATTATAAACGTTCAGTGCCTGTATTCTACCCTGATGAGGATCCCAACT
GTGATCCAGCAGCAACTGGGGTTTGGGGTCCTTGGGCATAATGCACAGCACTATGCCCTGCAAA
ACACACCTGCAGCAGAGTTCATTTTATGTA
SEQ ID NO.4:5'-ttgatatgacactacaacagttcc-3',
SEQ ID NO.5: 5'-ctggtttttctccctcttaaatt-3'-3',
SEQ ID NO.6:5'-agagtactgcaaaaatagctttcc-3',
SEQ ID NO.6:5'-aaaagcctaacaggtaacaactac-3',
SEQ ID NO.7: 5'-ttcgtgatcctgaagagaaaaatg-3',
SEQ ID NO.8: 5'-tacataaaatgaactctgctgcag-3'.
Claims (11)
1.检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，所述的分子标记分别位于鸭Z号染色体40062944，24633879及24697431bp位，对应基因RORb的内含子1的第50630位核苷酸A→G的突变，基因ARSB的内含子1的第2330位核苷酸G→A突变和外显子8的第65882bp位核苷酸A→G的突变，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，在SEQ ID NO.1的第81bp处发生A81 G的碱基突变，SEQ ID NO.2的第80bp处发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处发生A127G的碱基突变；
利用以上所述金定鸭早期产蛋性状相关基因的分子标记组合进行快速选育方法：检测RORb和ARSB基因的SNP位点，即SEQ ID NO.1的第81bp是否发生A81G的碱基突变,SEQ IDNO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处是否发生A127G的碱基突变作为选育条件；检测RORb和ARSB基因的SNP位点，即SEQ ID NO.1的第81bp是否发生A81G的碱基突变,SEQ ID NO.2的第80bp处是否发生G80A的碱基突变，SEQ ID NO.3的第127bp处是否发生A127G的碱基突变所采用的步骤包括：
1)样本基因组DNA提取；
2)样本质量检测；
3)多重PCR；
4)二代测序的方法对扩增子进行高通量测序；
5)对测序结果使用生物信息学方法，区分不同的样本，最终获得每个位点的突变信息。
2.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，其特征在于，该方法所用的样本为鸭的血液样本。
3.根据权利要求2所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，所用的鸭血样样本的基因组DNA提取，其提取采用天跟生化科技(北京)有限公司血液基因组DNA提取系统0.1-20mL天根生物，DP349。
4.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳和生物风光光度计检测样本质量，琼脂糖凝胶电泳检测有目的条带，拖带不明显，生物风光光度计检测DNA浓度在20ng/μL,OD260/280和OD260/230在1.8-2.0之间的判定为合格样本。
5.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，其特征在于，该方法所用的PCR扩增引物组合为：
上游引物序列1：5’-ttgatatgacactacaacagttcc-3’，(SEQ ID NO.4)
下游引物序列1：5’-ctggtttttctccctcttaaatt-3’，(SEQ ID NO.5)
上游引物序列2：5’-agagtactgcaaaaatagctttcc-3’,(SEQ ID NO.6)
下游引物序列2：5’-aaaagcctaacaggtaacaactac-3’,(SEQ ID NO.7)
上游引物序列3：5’-ttcgtgatcctgaagagaaaaatg-3’,(SEQ ID NO.8)上游引物序列3:5’-tacataaaatgaactctgctgcag-3’(SEQ ID NO.9)
多重PCR扩增：第一轮PCR配置方法为，三对引物工作液配制PCR mix，分装于每个个体相对应的96孔板中，取样本板充分解冻、震荡，1000rpm离心1s后进行加样，加样时每板预留2个孔，分别加入阳性及阴性对照，一轮扩增体系为Primer 50nM 2μL，dNTP 2.5mM 0.8μL，Taq酶5U/μL 0.1μL，10X buffer 1μL，基因组DNA 20ng/μL 2μL，Mg2+100mM 1μL，石蜡油10μL，ddH2O 3.2μL，共计20μL。
6.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，需进行多重PCR扩增，其特征在于，第一轮PCR反应条件如下：①95℃15min，1cycle；②94℃30s，60℃10min，4cycles；③94℃30s，60℃1min，72℃30s，20cycles。
7.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，需进行多重PCR扩增，其特征在于，第二轮PCR扩增体系如下，一轮产物每孔加ddH2O 100μL，瞬时离心，室温静置10min，以稀释液作为二轮扩增模板，扩增体系Barcode2μM 3.6μL，dNTP 2.5mM 0.8μL，Taq酶5U/μL 0.1μL，一轮产物样本10μL，Mg2+100mM 1μL，10X buffer 2μL，ddH2O 3.6μL，石蜡油20ul，总体系40μL。
8.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，需进行多轮PCR扩增，其特征在于，第二轮PCR扩增反应条件为：①95℃15min，1cycle；②94℃30s，60℃4min，5cycles；③94℃30s，65℃1min，72℃30s10cycles。
9.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，其特征在于，对二轮扩增获得的产物进行混样，对混样后的文库进行纯化，对纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度10ng/μL。
10.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，其特征在于，高通量测序由上海翼和生物有限公司采用Illumina X-10测序平台测序完成。
11.根据权利要求1所述的检测RORb和ARSB基因的分子标记组合的试剂在进行金定鸭早期产蛋性状快速选育中的应用，其特征在于，采用生物信息学的方法，对三个突变位点的信息进行分类汇总，获得每个样本每个突变位点的信息。
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