CN114717336B

CN114717336B - 一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114717336B
Application number: CN202210522094.3A
Authority: CN
Inventors: 李冲; 黄永亮; 王维民; 陈占玉; 王国秀
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-05-13
Also published as: CN114717336A

Abstract

本发明提供了一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用。本发明通过对绵羊GLP2R基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第389位存在一个G/A多态性位点，进一步使用KASPar引物对900只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与内脏器官重量进行关联分析，最终确定了本发明扩增的GLP2R基因片段可以作为与绵羊内脏器官发育、重量相关的分子标记。通过检测本发明的分子标记，可用于选留GG纯合的绵羊进入核心群，通过分子标记辅助选择选育心脏、肺脏和肾脏发育较好的绵羊，加速绵羊育种进程。

Description

一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记制备技术领域，具体涉及GLP2R基因片段作为影响绵羊内脏器官重量的分子标记及其应用。

背景技术

内脏器官的重量和器官指数在一定程度上反映了动物机体的机能状况和生长发育情况，对于理论研究和生产实践有重要的意义。内脏器官的重量和脏器指数能反映动物健康状况，也是判断其生长、生理状态和进化水平的重要指标。既可以作为动物遗传品质鉴定的重要依据，又可以为动物的饲养提供理论依据。有研究表明动物主要内脏的重量与体重显著正相关。另外，在医学上常用动物的脏器质量及脏器指数来衡量动物的功能状态、评价药品的安全性等。因此，针对内脏器官发育开展遗传改良有利于提高绵羊养殖综合效益。然而内脏发育相关性状难以测量，传统的育种进程耗时长、性状改良成本较高且育种结果不确定性较高。而分子标记辅助选择可将有价值性状相关的DNA标记代替表型选择来加速育种过程。因此，寻找和绵羊内脏器官发育相关的基因和数量性状位点可加速湖羊在生长发育等方面的育种进程，但是具体哪些分子标记能够反应并不清楚。

胰高血糖素样肽-2受体(glucagon-like peptide-2receptor，GLP2R)是胰高血糖素受体家族的成员，迄今已知该家族成员至少包括17个。所对应的配体胰高血糖素样肽-2(GLP2)由肠内的内分泌L细胞和脑中的前胰高血糖素原神经元分泌，二者结合后因作用的靶点不同而作用各异，如在胃肠道内有助于胃肠道生长发育，增加其血流量，提高胃肠道屏障功能，促进胃肠道对营养物质的吸收，发挥调节胃肠道黏膜细胞增殖、分化和修复等；在胰腺内可以调节胰高血糖素的分泌；在下丘脑可以产生饱腹感调控采食量。目前针对GLP2R的研究主要包括人的糖尿病和肥胖症、小鼠的脂肪肝或肝脏炎症、猪肉和羊肉品质等。内脏发育受基础代谢和能量供给等因素的影响，而GLP2R是调控机体能量平衡的关键介质。但绵羊GLP2R基因多态性与内脏重量的关联性仍不清楚。与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用未见报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种作为与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记从绵羊GLP2R基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQID NO.1所示。通过扩增绵羊GLP2R基因的DNA序列并测序，寻找GLP2R基因的多态性位点，从而可以建立绵羊内脏器官重量相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于分子标记辅助育种，选育内脏器官发育较好的绵羊。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一方面，本发明提供了一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记，该分子标记对通过对绵羊GLP2R基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第389bp位的R表示G或A，由于上述序列在第389位碱基处有一个G/A突变，从而导致了绵羊GLP2R基因在该位点的G/A多态性。

第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的PCR引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明还提供了检测上述分子标记的KASPar引物对，所述KASPar引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

第四方面，一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的引物对或KASPar引物对。

第五方面，本发明提供了一种检测与绵羊内脏器官发育相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第389bp位的R表示G或A，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊全血基因组DNA进行检测。

如上所述的方法，其包括如下步骤：

a)使用如上所述的引物对或KASPar引物对，或者如上所述的试剂盒，对绵羊全血基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

优选地，所述步骤b)中的分型鉴定方法为测序法和KASP基因分型技术。

具体地，本发明中利用上述引物对检测与绵羊内脏器官重量相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，

b)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊内脏器官重量相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.4-6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，采用KASP基因分型技术，通过BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

第六方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒或检测方法在绵羊内脏器官发育相关检测中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对GLP2R基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出心脏、肺脏和肾脏发育较快重量较大绵羊品种。

如上所述的应用，优选在绵羊育种中的应用。其育种目的是为挑选出内脏器官发育好、重量较大的绵羊品种。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的与绵羊内脏器官重量相关的分子标记，还提供了检测该分子标记的引物对或试剂盒或检测方法在绵羊内脏器官重量检测中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对GLP2R基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出心脏、肺脏和肾脏发育较快重量较大绵羊品种，为内脏器官增重快，发育好、健康型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为GG纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的内脏器官重量，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。

附图说明

图1为对绵羊GLP2R基因片段扩增的凝胶电泳结果图。

图2为本发明中绵羊GLP2R基因突变位点的测序结果。

图3为本发明中绵羊GLP2R基因34409249G>A突变位点KASPar SNP分型结果。

具体实施方式

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对GLP2R基因进行PCR扩增、测序和分析，选择900只湖羊为试验群体分析GLP2R基因不同基因型与绵羊内脏器官重量的关联性，筛选出对内脏发育有利的基因型，开发一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记，为绵羊内脏器官重量相关的分子标记辅助育种提供依据，为促进绵羊遗传改良提供基因素材，加速优质肉羊的培育进程。结果发现在扩增片段的第389位存在一个G/A多态性位点，并通过检测900只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记，该分子标记可以为绵羊内脏器官发育方面的遗传改良提供有效的基因工程手段，具有一定的实际应用价值。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明还通过设计KASPar引物对分子标记进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele SpecificPCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针金标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1

(1)引物设计

以绵羊GLP2R基因DNA(GenBank收录号：NC_040259.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物GLP2R-F和GLP2R-R，引物序列如下

GLP2R-F(SEQ ID NO.2)：TGAAGTCACCCTCGCTGCT，

GLP2R-R(SEQ ID NO.3)：CGGTGAGATTTCCAGCTCCCT

(2)GLP2R基因的扩增和测序

取绵羊的血液进行提取的基因组DNA，将获得的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增，PCR反应体系采用25μL体系，其中包括DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，上游引物GLP2R-F(浓度为10μmol/L)0.8μL，下游引物GLP2R-R(浓度为10μmol/L)0.8μL，ddH₂O 10μL。PCR扩增反应的程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示该扩增片段有727bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该575bp片段中存在一个多态性位点，具体在第389bp位点的R是G或A，即扩增该GLP2R基因片段在第389bp位点存在G/A多态性(结果见图2)。

其中，SEQ ID NO.1：

TGAAGTCACCCTCGCTGCTCTCCGACAGGCTGCTGCCGCGGGGCCAGGCTGCGTGGCCTTGACGAGGCGGGGTGCCCGCCACCCCTAGGCTCTCCCTGGTCGAGTGCAGGAGCCGCCCACCACCAGGCAAGGGCCGCGCCTTCTGCAGTGACCCAGAGTTGGTCCCTTCCGAGAGCTTCTTGGGACATTTCCCCAGGAATCGGAAGTTCTTTCCCAGGACCCAGGCTCTGCAGCCCGAGTGGTGGGCTAGCAAGAAGCGGGCCCACTGCTTTCGCAGCTCGGCCTTCACCTGCCAGGTGAGAAGAGAGCAAGGTTACTGCCCGGGAGTCATTGAATCCTGCATCCACTCAGCAAATGCGTGTTGAGTGGCTACTCAGGACCACCCTTCRGAAACTTGCATTCTCACTAGGGGAGAGGAAGAGAGAAGCAAACACAGACATTTGAGCAGAGCAGAGGGTGGTAACACCTGTGGCTGTTAAGCAGGACCACGGGAGGAGGCAACAAAAATATGAGACACAGTGTTTAGAAAAGGACTGTGTCAAGGTGGCATTTGACACCTGCTTGATGAATTAAGGGTCCCTGCGTGAAGACATAGAAAAGGCAGCAGTGAGCAACAGACAAGGTTTTGCTGTCAAGCAGCTTACATTCTAGTGGAAGGTGGCAGAGATCAATATTTAAACCTGGGGTTGGGAGAGGGGAGGGTGAAAGGGAGCTGGAAATCTCACCG

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊GLP2R基因DNA(GenBank收录号：NC_040259.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

(1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段的G/A多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleX的正向引物A1，如SEQ ID NO.4所示，

SEQ ID NO.4：CGGTGAGATTTCCAGCTCCCT；

用于检测AlleleY的正向引物A2，如SEQ ID NO.5所示，

SEQ ID NO.5：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCTAGTGAGAATGCAAGTTTCT；

通用反向引物C，如SEQ ID NO.6所示，

SEQ ID NO.6：AAATGCGTGTTGAGTGGCTACTCAG。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30(引物A1：引物A2：引物C)的比例混匀备用。

(2)DNA质控

通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对绵羊的全血提取得到的基因组DNA的质量进行检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA浓度成为10～20ng/μL备用。

(3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站，将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5μL和空白对照(No template control,NTC)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板货号Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“GA”或“AG”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即是水为模板的空白对照。

(4)本发明的分子标记在绵羊内脏器官重量标记性状关联分析中的应用

试验共检测了900只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与内脏器官重量进行关联分析。

Y_ijkl＝μ+Genotype_i+P_j+F_k+M_l+ε_ijkl

其中，Y_ijkl是内脏器官重量的观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，F_k为父系效应，M_l为母系效应，ε_ijkl为随机误差，假定ε_ijkl相互独立，服从N(0，σ2)分布。

本发明中，在试验群体达到180日龄时进行屠宰，测其内脏器官的重量及宰前活重，计算其内脏相对重量，即：内脏相对重量＝内脏器官重量/宰前活重。

基因型检测结果表明在900个个体中GG基因型有218个，AG基因型有256个个体，AA基因型有426个个体，基因型与性状关联分析的结果如表1所示。

表1绵羊GLP2R基因多态性与内脏发育关联分析

注：同行数据间角标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

由上表的结果显示，随着测定周期的延长，GLP2R g.34409249G>A突变位点与绵羊内脏器官重量显著相关。其中GG基因型个体的内脏器官重量显著高于AA型个体(P<0.05)，AG型个体的内脏器官重量低于GG型个体，高于AA型个体，但差异不显著(P>0.05)，随着A等位基因数的增加其个体内脏器官重量减小，由此可知G等位基因为优势等位基因。内脏器官的重量是动物主要的生物学特性指标之一，除了能反映动物健康状况，也是判断其生长、生理状态和进化水平的重要指标，可以作为动物遗传品质鉴定的依据。寻找内脏发育相关的分子标记可加速绵羊在生长发育等方面的育种进程。因此GLP2R g.34409249G>A突变位点可作为影响湖羊内脏器官重量的潜在分子标记，并为在育种中鉴别是否为内脏器官快速增重型的绵羊提供检测技术手段。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaagtcacc ctcgctgctc tccgacaggc tgctgccgcg gggccaggct gcgtggcctt 60

gacgaggcgg ggtgcccgcc acccctaggc tctccctggt cgagtgcagg agccgcccac 120

caccaggcaa gggccgcgcc ttctgcagtg acccagagtt ggtcccttcc gagagcttct 180

tgggacattt ccccaggaat cggaagttct ttcccaggac ccaggctctg cagcccgagt 240

ggtgggctag caagaagcgg gcccactgct ttcgcagctc ggccttcacc tgccaggtga 300

gaagagagca aggttactgc ccgggagtca ttgaatcctg catccactca gcaaatgcgt 360

gttgagtggc tactcaggac cacccttcrg aaacttgcat tctcactagg ggagaggaag 420

agagaagcaa acacagacat ttgagcagag cagagggtgg taacacctgt ggctgttaag 480

caggaccacg ggaggaggca acaaaaatat gagacacagt gtttagaaaa ggactgtgtc 540

aaggtggcat ttgacacctg cttgatgaat taagggtccc tgcgtgaaga catagaaaag 600

gcagcagtga gcaacagaca aggttttgct gtcaagcagc ttacattcta gtggaaggtg 660

gcagagatca atatttaaac ctggggttgg gagaggggag ggtgaaaggg agctggaaat 720

ctcaccg 727

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagtcacc ctcgctgct 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggtgagatt tccagctccc t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggtgagatt tccagctccc t 21

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tcccctagtg agaatgcaag tttct 45

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaatgcgtgt tgagtggcta ctcag 25

Claims

1.一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其第389bp处的R表示G或A，该突变导致分子标记的G/A多态性。

2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的序列。

3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2所述的PCR引物对或/和权利要求3所述的KASPar引物对。

5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊全血基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的分型鉴定方法为测序法和KASP基因分型技术。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊心、肺和肾脏重量相关检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用，其中，所述育种为挑选出内脏器官发育好、重量较大的绵羊品种，其中内脏器官是指心、肺和肾脏。