CN115109856A

CN115109856A - 与绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用

Info

Publication number: CN115109856A
Application number: CN202210697353.6A
Authority: CN
Inventors: 王维民; 程江博; 李发弟; 张小雪; 张德印; 李晓龙; 张煜坤; 赵源; 徐丹; 李文馨; 王江荟; 赵利明; 林长春; 周步博
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2022-09-27

Abstract

本发明提供了一种与绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用。本发明通过对绵羊GHR基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段如SEQ ID NO.1所示序列的第196位存在一个A/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对375只湖羊、31只滩羊和82只杜泊羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与阶段体重的性状进行关联分析，最终确定了本发明扩增的GHR基因片段可以作为与绵羊阶段体重相关的分子标记。本发明通过检测分子标记，可用于选留基因为AA纯合型湖羊进入核心群作为种羊，以绵羊的阶段体重，有助于提高生产的效率。

Description

与绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用

技术领域

本发明属于分子标记的技术领域，具体涉及GHR基因片段作为影响绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用。

背景技术

种业是畜牧业的上游核心产业，也是畜牧业的“芯片”。育种在畜牧的科技贡献中所占比例最高，达40％以上。而性能测定是育种的基础，没有性能测定的育种是不切实际的。在肉羊生产实践中，阶段体重反映了绵羊产肉的能力，因此提高阶段体重对经济和生产效率具有重要的意义。长期以来，阶段体重(Body weight，BW)作为衡量肉羊生产性能的一项重要的经济指标，研究表明阶段体重属于中等遗传力(0.35～0.46)，受遗传控制且能够通过选择改良(朱波，李姣，汪聪勇，徐凌洋，陈燕，高雪，张路培，高会江，李俊雅.我国肉用西门塔尔牛群体生长发育性状遗传参数估计及其遗传进展[J].畜牧兽医学报，2020，51(08):1833-1844.)。但是有关绵羊阶段体重相关的候选基因报道较少。

生长激素受体(Growth hormone receptor，GHR)属于细胞分裂素/造血生成素受体超家族的成员，由9个内含子和10个外显子组成。GHR基因最初在家兔的肝细胞中被发现，后来在牛、羊、小鼠和鸡中被检测到(Ilkbahar,Ilkbahar，Y.N.，et al.，Expression anddistribution of messenger ribonucleic acids for growth hormone(GH)receptorand GH-binding protein in mice during pregnancy.1995，386-392.)。它编码一种特定的膜蛋白，并通过影响生长激素(GH)的作用来影响身体的生长和发育(Tanaka，M.，et al.，Expression of aberrantly spliced growth hormone receptor mRNA in the sex-linked dwarf chicken，Gifu 20.1995，218-223.)。生长激素可以有效通过加快肌细胞的分化与发育来影响机体肌肉的生成与发育，进而影响其阶段体重。阶段体重属于中等遗传力，受到基础代谢、所处环境、饲料效率、机体活动、饲料营养等多种因素的影响。GHR基因与绵羊阶段体重是否有关系，有什么关系并不清楚。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种作为与绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用。本发明的分子标记是从绵羊GHR基因中扩增得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过扩增绵羊GHR基因的DNA序列并测序，寻找GHR基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊阶段体重相关性，并建立含多态性位点的检测方法，并可将该分子标记应用于高产型优质肉羊新品种的培育中。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种与绵羊阶段体重相关的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第196bp位的R表示A或G，由于上述序列在第196位碱基处有一个A/G突变，从而导致了绵羊GHR基因在该位点的A/G多态性。

用于检测上述分子标记的PCR引物对，优选地，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

用于检测上述分子标记的KASPar引物对，其包括用于检测AlleleA的引物A1、用于检测AlleleG的引物A2和通用反向引物，所述用于检测AlleleA的引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述用于检测AlleleG的引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述通用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

用于检测上述分子标记的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含了检测上述分子标记的PCR引物对或KASPar引物对。

一种检测与绵羊阶段体重相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第196bp位的R表示A或G，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对湖羊的基因组DNA进行检测，具体检测方法包括如下步骤：

a)使用上述的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对湖羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤b)中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、基因芯片法、探针法、高分辨率溶解曲线法。

利用上述引物对检测与绵羊阶段体重相关分子标记的KASPar方法，包括如下步骤：

a)以湖羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

如上述所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊阶段体重相关检测中的应用，通过在待测绵羊的基因组DNA中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊的阶段体重高低，进而筛选出阶段体重大的绵羊。

如上所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的GHR基因的基因型，从而可以从中选育出高产型绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。

本发明通过对湖羊代表品种湖羊的GHR基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第196位存在一个A/G多态性位点，并通过检测检测375只湖羊、31只滩羊和82只杜泊羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊80-180日龄阶段体重相关的分子标记，该分子标记可以用于高产型绵羊的选育和高产型优质肉羊新品种的培育，为绵羊阶段体重的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。本发明通过设计KASPar引物对分子标记进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针金标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了与湖羊生长性状相关的分子标记，具体为SEQ ID NO.1片段的第196位的A/G的多态性位点，为快速生长型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致该多态性位点的检测，可用于选留基因为AA纯合型绵羊作为种羊，用于育种，缩短育种周期，用以提高绵羊的生长性状，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。

附图说明

图1为用于作为分子标记的绵羊GHR基因片段的凝胶电泳图。

图2为本发明中绵羊GHR基因突变位点的测序结果。

图3为本发明中绵羊GHR基因g.170196A>G突变位点KASPar SNP分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1GHR基因的扩增

以湖羊GHR基因DNA(GenBank收录号：NC_040267.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物：上游引物M-F和下游引物M-R，引物序列如下：

上游引物M-F(SEQ ID NO.2)：5’-GAGCACCACTCCGTTACTCG-3’

下游引物M-R(SEQ ID NO.3)：5’-TTCCCCAAAATTCTCAGTCCA-3’

(2)GHR基因的扩增和测序

PCR反应的体系采用35μL体系，包括2×PCR Master Mix 17.5μL，上游引物M-F(10μmol/L)1μL，下游引物M-R(10μmol/L)1μL，ddH₂O 14μL，DNA模板1.5μL。其中DNA模板为羊全血细胞提取的基因组DNA。

PCR扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。

对PCR扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，M泳道：DL 2000Marker，1-10泳道：GHR基因扩增的结果。结果显示得到429bp特异扩增片段。将扩增得到的PCR片段进行测序，对测序得到的峰图进行双峰检测，识别突变位点，结果如图2所示，在扩增片段中出现双峰，测序片段的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该片段中存在一个多态性位点，具体在第196bp位点的R是A或G，即扩增的GHR基因片段(SEQ IDNO.1)在第196bp位点存在A/G多态性，该位点位于GHR基因的g.170196(见图2)。

其中，SEQ ID NO.1如下所示：

GAGCACCACTCCGTTACTCGGGGATCCTGGTTGAAATTTCCCCAGTCAGTGCACAGGCCATGGGTACCCCTGGAGGCTTCCTCTCGGGGCTTGGCCCTCACCTGTTCTTACAGGGAATGTTTGCTCACTGCCAAAATAGTAGTCTTTATATCTAAACTTATTCTACTTCTCTCCGAAAGGTAAATTTGAAAAACARTATACCTTTAGTTAAGAGAATTAATCTTTCATCATTTAAATAGCTCTTTACAGCAGCTACTTCAGTTTTAAAGACAATTTGATGCACATAAATAGCTATAAGCCCCTGGAACTCTTTATGCTTGCATTTTAAATTTATTGGACCCAACTTCTGCCAGTAATTCTAGAATTTTCTTTAACCTGTCGTCTTCAAGAAATATATTCCTGTAAATCTGGACTGAGAATTTTGGGGAA。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与湖羊GHR基因DNA(GenBank收录号：NC_040267.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

1、引物序列设计

针对实施例1中扩增片段SEQ ID NO.1中所示的A/G多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，设计的KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleA的正向引物A1(SEQ ID NO.4)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTCTCCGAAAGGTAAATTTGAAAAACAA-3’；

用于检测AlleleG的正向引物A2(SEQ ID NO.5)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTCCGAAAGGTAAATTTGAAAAACAG-3’；

通用反向引物C(如SEQ ID NO.6)：5’-GTCTTTAAAACTGAAGTAGCTGCTGTAAAG-3’。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成。将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C的体积比为12:12:30的比例混匀备用。

2、DNA质控

对羊的全血进行基因组DNA的提取，可采用DNA提取试剂盒进行。对提取得到的基因组DNA的进行质量检测，采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测，合格的DNA要求到达：

琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA浓度成为10～20ng/μL备用。

3、基因分型检测

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5μL和空白对照(No template control，NTC，采用灭菌水)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。

将上述KASPar引物对中各引物均稀释成10μmol/L，并按照正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C的体积比为12:12:30的比例混匀作为引物混合液备用。

然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板，货号：Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪及Fusion激光封膜仪上进行封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示。图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点，表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近中间的绿色圆点，表示该位点是杂合基因型“AG”或“GA”；靠近右侧的蓝色圆点，表示该位点是纯合基因型“AA”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即为水对照。

4、本发明的分子标记在湖羊生长性状关联分析中的应用

试验共检测了375只、31只滩羊和82只杜泊羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与阶段体重进行关联分析。

Y_ijkl＝μ+Genotype_i+P_j+M_l+ε_ijkl

其中，Y_ijkl是阶段体重的观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，M_l为品种效应，ε_ijkl为随机误差，假定ε_ijkl相互独立，服从N(0，σ2)分布。

本发明中阶段体重的测定时间为80d，100d，120d，140d，160d和180d。

基因型检测结果表明在488个个体中AA因型有105个，GA基因型有116个个体，GG基因型有252个个体，未分型成功15个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，表中BW表示阶段体重，单位为kg。BW80d表示80日龄体重；BW100d表示100日龄体重，以此类推。

表1绵羊GHR基因多态性与阶段体重关联分析

注：同行数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

结果显示，随着测定周期的延长，GHR g.170196A>G突变位点与绵羊阶段体重显著相关。其中AA基因型个体的阶段体重显著高于GA型和GG型个体(P<0.05)。由此可知AA基因型为优势基因型，A等位基因为优势等位基因。表明GHR g.170196A>G突变位点可作为影响绵羊阶段体重的潜在分子标记(P<0.05)。在育种时选择AA基因型进行保种，繁育时以AA基因型作为种羊，与其它绵羊进行杂交，可以有效提高后代绵羊的生产效率。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 与绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcaccact ccgttactcg gggatcctgg ttgaaatttc cccagtcagt gcacaggcca 60

tgggtacccc tggaggcttc ctctcggggc ttggccctca cctgttctta cagggaatgt 120

ttgctcactg ccaaaatagt agtctttata tctaaactta ttctacttct ctccgaaagg 180

taaatttgaa aaacartata cctttagtta agagaattaa tctttcatca tttaaatagc 240

tctttacagc agctacttca gttttaaaga caatttgatg cacataaata gctataagcc 300

cctggaactc tttatgcttg cattttaaat ttattggacc caacttctgc cagtaattct 360

agaattttct ttaacctgtc gtcttcaaga aatatattcc tgtaaatctg gactgagaat 420

tttggggaa 429

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagcaccact ccgttactcg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttccccaaaa ttctcagtcc a 21

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc ttctctccga aaggtaaatt tgaaaaacaa 50

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat ttctccgaaa ggtaaatttg aaaaacag 48

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtctttaaaa ctgaagtagc tgctgtaaag 30

Claims

1.一种与绵羊阶段体重相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第196bp处的R表示A或G，该突变导致分子标记的A/G多态性。

2.用于检测权利要求1所述分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

3.用于检测权利要求1所述分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括用于检测AlleleA的引物A1、用于检测AlleleG的引物A2和通用反向引物，所述用于检测AlleleA的引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述用于检测AlleleG的引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述通用反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.用于检测权利要求1所述分子标记的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对。

5.一种检测与绵羊阶段体重相关的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求2的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的检测试剂盒，对湖羊基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定；

其中，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，其第196bp位的R表示A/G突变。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的分型鉴定方法为直接测序法、基因芯片法、荧光探针法或高分辨率溶解曲线法。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的检测试剂盒，或权利要求5-7中任一项所述的方法在绵羊阶段体重相关性状检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7中任一项所述的方法在绵羊育种中的应用，其特征在于，所述育种为培育高产型绵羊。