CN113801941B - 用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因突变检测技术领域，具体涉及用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法。所述引物组包括如SEQ ID NO.1～9所示的引物，更优选所述引物组中还包括SEQ ID NO.10～12所示的引物。本发明能同时检测牛Celtic无角基因、Mongolian无角基因和Friesian无角基因，可以快速、准确、批量地实现对牛无角性状的表型和/或基因型的检测。将本发明应用于牛无角性状的分子育种中时，可以选择无角基因纯合子，以高效提升后代牛群的无角基因频率。

Description

用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，具体涉及用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
在自然界中，牛角是抵御天敌、争夺配偶的工具，而在集约规模化养殖条件下，角的存在不仅会给动物间带来互相伤害，也给饲养人员带来安全威胁。目前规模化牛场通常对出生一周内的犊牛进行去角，然而其缺点在于给牛带来了应激反应，影响了动物生长及动物福利，同时耗费人力、物力、财力。天生无角是牛生产中的有利性状，开发牛无角基因检测方法，可用于牛无角性状的分子育种。例如，在选择种牛时，鉴定和选择无角基因纯合子，可以快速提升后代牛群的无角基因频率。
牛的无角性状遗传方式为常染色体显性遗传，具有多等位基因的特点，目前已知有三类不同来源的无角基因，均位于牛的1号染色体上(参考基因组：Bos_taurus_UMD_3.1)。第一种称为Celtic等位基因(Medugorac et al.2012)，存在于以安格斯牛、弗莱维赫牛、西门塔尔牛等肉牛及乳肉兼用牛品种中，属于插入缺失类突变(InDel)，即在1号染色体上1,705,834-1,706,045bp处存在一段212bp的重复，该重复代替了一段位于1,706,051-1,706,060bp长度为10bp的序列，该位点表示为P202ID。第二种称为Mongolian等位基因(Medugorac et al.2017)，发现于蒙古牛中，该突变有两个特异性突变位点，一是在1,975,461–1,975,487bp处存在1bp的插入缺失，表示为P1ID；二是在1,976,128bp处存在一个219bp的插入，表示为P219ID。第三种称为Friesian等位基因(Medugorac et al.2012)，主要存在于以荷斯坦牛、娟姗牛为代表的奶牛品种中。该等位基因存在5个紧密连锁的候选突变位点，其中3个是单核苷酸多态(SNP)，分别为：1,654,405bp处G→A(PG1654405A)；1,655,463bp处C→T(PC1655463T)；1,768,587bp处C→A(PC1768587A)。另外2个为插入缺失(InDel)，即在1,649,163–1,649,169bp处有一段5bp的InDel(P5ID)、在1,909,352-1,989,480bp后存在一段长度为80,128bp的串联重复(P80kbID)，该串联重复内部还存在一个SNP(1,909,354:T→A)和一个2bp的缺失(1,909,396D2:TG)。
目前已有研究报道了这3类牛无角基因的检测技术。检测Celtic无角基因可以通过PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(Medugorac et al.2012)或PCR扩增产物片段长度分析(毛细管电泳)(Wiedemar et al.2014)。检测Mongolian无角基因也是通过PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳(Medugorac et al.2017)。针对复杂的Friesian无角基因，Medugorac et al.(2012)报道了5个紧密连锁突变位点的检测方法，即利用商业化的试剂盒(KASPar,KBioscience)检测PG1654405A和PC1655463T；利用限制性片段长度PCR(PCR-RFLP)检测PC1768587A；利用PCR扩增产物片段长度分析检测P5ID；对于复杂的80kb重复片段(P80kbID)，针对其内部的2bp缺失通过PCR扩增产物片段长度分析来分型。Wiedemar et al.(2014)则报道通过PCR扩增产物直接Sanger测序方法，对Friesian无角基因相关联的SNP及P5ID进行分型，而对P80kbID则设计重复片段特异性引物，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，通过观察产物条带的有无来判断是否携带无角基因。
总结现有的检测方法，存在以下问题：1、没有统一的检测技术能够同时对三种无角等位基因进行检测；2、现有基于Sanger测序技术的检测方法，操作步骤多、耗时长，无法实现快速检测；3、针对Friesian无角基因，已报道的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，只能判断是否携带无角基因，无法区分无角等位基因的杂合子和纯合子，未达到精确分型的效果。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是近年来新出现的一种DNA变异分型技术，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，具有准确、灵活、成本低的特点，对SNP、Indel及大片段缺失插入等不同变异类型均可检测。本发明基于KASP原理，优化设计特异性的引物组合，开发了同时检测牛3种无角基因的新方法，显著提高了牛无角基因检测的效率。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法。
为了实现上述目的，本发明选取了3种无角基因的特异性位点，包括Celtic无角基因位点P202ID，Mongolian无角基因位点P1ID，Friesian无角基因的中涉及以下两个位点——PC1768587A和P80kbID。本发明发现，利用P80kbID鉴别是否携带Friesian无角等位基因，同时利用PC1768587A位点辅助判定其为无角基因的纯合子或杂合子，可以精准地实现对Friesian无角基因的检测。
针对上述4个位点，分别优化设计特异性的引物组合(见图1，下表1)，每个引物组合包含3条引物，包括上游引物2条和下游引物1条，其中2条上游引物是根据位点等位基因序列差异而设计的，在KASP扩增过程中分别加上不同的荧光基团(FAM和HEX)，最后根据PCR产物荧光信号进行基因型分型。利用这些引物组合能够实现采用相同的技术平台，对3种无角基因同时检测，从而根据这些分子标记位点基因型可以实现牛无角性状的快速、准确、批量检测。
表1引物序列
Figure BDA0002543779760000031
Figure BDA0002543779760000041
根据上述发现，本发明首先提供了一种用于检测牛无角基因的引物组，包括：
引物组I：上游引物：
5’-GATAGTTTTCTTGGTAGGCTGGTATTCTT-3’(SEQ ID NO.1)，
5’-GTGAGATAGTTTTCTTTGCTCTTTAGATCA-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物：
5’-TTGGGATAGACTTAAAAATGAAAAGAGAGT-3’(SEQ ID NO.3)；
引物组II：上游引物：
5’-TGTCAAGTGTCTCTGTCAAGAGATTCAG-3’(SEQ ID NO.4)，
5’-CTGTCAAGTGTCTCTGTCAAGATTCAGA-3’(SEQ ID NO.5)；
下游引物：
5’-CCTGCCATGATAAAGATGTTGGCT-3’(SEQ ID NO.6)；
引物组III：上游引物：
5’-CCCCTCCCCTGTGTGTG-3’(SEQ ID NO.7)，
5’-CCCTCCCCTGTGTGCA-3’(SEQ ID NO.8)；
下游引物：
5’-GGAAGAAACCTACATGAGTGAGTG-3’(SEQ ID NO.9)。
上述引物组可以同时鉴别可以同时鉴别待测对象是否携带Celtic无角基因、Mongolian无角基因和Friesian无角基因。其中，引物组I和引物组II还可以分别鉴定出Celtic无角基因和Mongolian无角基因的基因型。
作为优选，所述的基因组还包括：
引物组IV：上游引物：
5’-CCAGTTTTATCTTTTTCCCCTCCAC-3’(SEQ ID NO.10)；
5’-CCAGTTTTATCTTTTTCCCCTCCAA-3’(SEQ ID NO.11)；
下游引物：
5’-GGTCAGGAGGCAAAACCAACAAT-3’(SEQ ID NO.12)。
由于引物组IV可以进一步鉴定出Friesian无角基因的基因型，因此使用此引物组时，可以同时鉴定出Celtic无角基因、Mongolian无角基因和Friesian无角基因的基因型。
本发明的引物组在应用于KASP时具有很好的检测效果，优选地，在采用KASP进行检测时，两条所述上游引物分别连接不同的荧光序列(如FAM和HEX)。
本发明进一步提供所述的引物组在制备牛无角基因检测试剂中的应用。
本发明还提供用于检测牛无角基因的试剂盒，包括上述的引物组。
优选的，所述试剂盒还包括PCR预混液和/或对照品。
作为优选方案，所述试剂盒在工作时的反应程序如下：
(1)95℃变性15min；
(2)降落PCR扩增10个循环，变性温度95℃，退火温度在10个循环中从61℃降落到55℃，每个循环变性20～30sec、延伸45～60sec；
(3)常规PCR扩增26个循环，变性温度95℃，退火温度55℃，每个循环变性20～30sec、延伸45～60sec；
(4)37℃延伸60sec。
作为一种优选的实施方案，步骤2)中，所述PCR扩增的反应程序如下：
(1)95℃，15min；
(2)95℃，20sec，61～55℃，60sec，每个循环降低0.6℃，10个循环；
(3)95℃，20sec，55℃，60sec，26个循环；
(4)37℃，60sec。
作为优选，所述试剂盒在工作时针对引物组I～IV分别配置反应体系，1μL反应体系如下：
Figure BDA0002543779760000061
其中，所述引物混合液中含有引物组I～IV中的任一组；
优选在所述引物混合液中，每条所述上游引物的浓度为8～12μM，每条所述下游引物的浓度为20～30μM。
本发明进一步提供一种检测牛无角基因的方法，包括：
1)提取待测样品的DNA；
2)利用所述的基因组或所述的试剂盒进行PCR扩增；
3)根据扩增结果，判断所述待测样品是否携带牛无角基因；和/或，判断所述待测样品的牛无角基因型。
如上所述，引物组I和引物组II除了可以分别鉴别待测对象是否携带Celtic无角基因和Mongolian无角基因之外，还可以分别鉴定出Celtic无角基因和Mongolian无角基因的基因型；引物组III可以鉴别待测对象是否携带Friesian无角基因，引物组IV可以进一步鉴定出Friesian无角基因的基因型。本领域人员可以根据需要对本发明所提供的引物组进行选用。
优选地，采用KASP进行检测。
作为优选，步骤2)中所述PCR扩增的反应程序如下：
(1)95℃，15min；
(2)95℃，20～30sec，61～55℃，45～60sec，每个循环降低0.6℃，10个循环；
(3)95℃，20～30sec，55℃，45～60sec，26个循环；
(4)37℃，60sec。
作为优选，步骤2)中，在进行所述PCR扩增时，针对引物组I～IV分别配置反应体系，1μL反应体系如下：
Figure BDA0002543779760000071
其中，所述引物混合液中含有引物组I～IV中的任一组；
优选在所述引物混合液中，每条所述上游引物的浓度为8～12μM，每条所述下游引物的浓度为20～30μM。
在一些实施方案中，当所述PCR扩增结束后，利用荧光信号扫描仪(如北京博奥晶典生物技术有限公司，产品编号G020010)进行扫描，根据荧光信号的散点图判定基因型。
具体判定方法如下：
1)Celtic无角基因P202ID位点检测结果中，“insN/insN”、“-/insN”、“-/-”分别对应的基因型为纯合无角、杂合无角和有角基因型。
2)Mongolian无角基因P1ID位点检测结果中：“insN/insN”；“-/insN”、“-/-”分别对应的基因型为纯合无角、杂合无角和有角基因型。
3)Friesian无角基因P80kbID位点的检测结果中，“insN”、“-/-”分别对应的是携带无角基因和不携带无角基因；在P80kbID位点检测结果为“insN”的个体中，PC1768587A位点检测结果“CA”为杂合无角，“AA”为纯合无角。
本发明进一步提供所述的引物组、试剂盒或者方法在牛的分子育种中的应用。
本发明进一步提供所述的引物组、试剂盒或者方法在牛有角或无角性状早期预测中的应用。
本发明进一步提供所述的引物组、试剂盒或者方法在筛选无角牛、或淘汰有角牛中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明能同时检测Celtic无角基因、Mongolian无角基因和Friesian无角基因，可以快速、准确、批量地实现对牛无角性状的表型和/或基因型的检测。将本发明应用于牛无角性状的分子育种中时，可以高效提升后代牛群的无角基因频率。
附图说明
图1为牛3种无角基因突变位点及本发明设计引物的位置，图中，F为正向引物，R为反向引物；
图2为实施例2中Celtic无角基因P202ID位点分型散点图；
图3为实施例2中Mongolian无角基因P1ID位点分型散点图；
图4为实施例2中Friesian无角基因PC1768587A分型散点图；
图5为实施例2中Friesian无角基因P80kbID分型散点图；
图6为实施例3中Celtic无角基因P202ID位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳分型胶图；
图7为实施例3中Mongolian无角基因P219ID位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳分型胶图；
图8为实施例3中Friesian无角基因PC1768587A位点Sanger测序峰图；
图9为实施例3中Friesian无角基因P80kbID位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳分型胶图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物组的设计与优化过程
根据3种无角基因序列，设计分型引物组I、II、III。其中引物组I是根据P202ID位点2个等位基因的特异性序列进行优化设计，利用了重复序列末端的差异性；引物组II是根据P219ID位点2个等位基因的特异性序列进行优化设计，利用了重复序列上游628bp处6个碱基被7个碱基替换(导致1bp长度差异)；引物III是根据P80kbID位点2个等位基因的特异性序列进行优化设计，利用了重复序列内2bp缺失。
以引物III的优化设计过程为例进行具体说明。具体的，发明人对Friesian无角基因P80kbID位点的Sanger测序结果如下,花括号“{}”中代表原始80Kb序列，方括号“[]”中代表为Friesian无角等位基因特有的第2拷贝80Kb序列。
>野生型等位基因部分序列
{AGTGCAGAAGTCGGTGGTCTGAAAGGTCGCCCCTCCCCTGTGTGTGCACACGTACACACTCACTCATGTAGGTTTCTTCCAG(SEQ IDNO.13)……GCTTCCTTGGTGGCTCAGTC}AGTAAAGAATCTGCCTGC(SEQID NO.14)
>无角等位基因部分序列
{AGTGCAGAAGTCGGTGGTCTGAAAGGTCGCCCCTCCCCTGTGTGTGCACACGTACACACTCACTCATGTAGGTTTCTTCCAG(SEQ ID NO.13)……GCTTCCTTGGTGGCTCAGTC}[AGAGCAGAAGTCGGTGGTCTGAAAGGTCGCCCCTCCCCTGTGTGCACACGTACACACTCACTCATGTAGGTTTCTTCCAGGGCCCAGAG(SEQ IDNO.15)……GGGGCTTCCTTGGTGGCTCAGTC]TAAAGAATCTGCCTGCAATGC(SEQ ID NO.16)
比较测序结果发现，Friesian无角等位基因的第2拷贝80Kb序列中有3处碱基变异(由下划波浪线标出)，包括1)起始AGT突变为AGA，2)第39～46bp位置TGTGTGTG突变为TGTGTG，3)80Kb重复之后紧邻碱基由AGTAAA突变为TAAA。发明人尝试过在上述三处突变位点设计分型引物，但只有在第2处突变的引物设计成功，其余两个突变位点的引物设计均失败。
初步检测发现引物组III能检测出有无Friesian无角基因，但无法确定是纯合子和还是杂合子，原因是经Sanger测序发现，野生型序列与突变型的第一个拷贝序列在P80kbID位点的基因型完全一致。为了解决此难题，发明人引入另外一个与Friesian无角基因密切关联的突变位点(PC1768587A)，设计引物组IV，可以实现Friesian无角基因准确分型。
实施例2三种牛无角基因的分型检测
采集39头不同品种牛的公牛冷冻精液，利用高盐法提取基因组DNA。其中样本中包括奶牛9头，品种为荷斯坦牛和娟姗牛；肉牛17头，品种包括安格斯牛、弗莱维赫牛、夏洛莱牛、利木赞牛和西门塔尔牛；此外还有我国三河牛、秦川牛和蒙古牛共13头。
基于KASP竞争性等位基因特异性PCR的原理进行SNP分型，其中PCR反应在微流控芯片(北京博奥晶典生物技术有限公司，产品编号G020010)上完成，方法步骤为：
1)在一个专用的微流控芯片上，在芯片孔中注入待检测样本的基因组DNA(5～10ng)；
2)针对4个位点，均单独配置PCR扩增反应混合液。每个位点的反应混合液中，包含位点特异性引物(表1)、PCR预混液和双蒸水。用移液器将配置的混合液从微流控芯片注液孔注入到芯片反应孔中，并密封进出口；其中，每个芯片孔中的PCR反应体系配制如下：
Figure BDA0002543779760000111
其中，PCR预混液(2×universal KASP Master Mix)购自LGC(UK)，引物混合液中2条等位基因特异性引物浓度均为12μM，下游通用引物浓度30μM。
3)将芯片放入到离心机中4000rpm离心1min；
4)放入芯片热封仪中进行热封1sec；
5)放入平板PCR仪上进行扩增反应，PCR扩增程序为：首先95℃变性15min，之后为降落PCR(touchdown PCR)扩增10个循环，变性温度95℃，退火温度在10个循环中从61℃降落到55℃，每个循环变性20sec、延伸60sec；然后为常规PCR扩增26个循环，变性温度95℃，退火温度55℃，每个循环变性20sec、延伸60sec；最后37℃延伸60sec。
6)PCR扩增程序运行结束后，将芯片放入荧光信号扫描仪，进行扫描，生成图像文件，通过软件转换成数据信号值，然后基于散点图进行分型。
检测详细结果如表2所示。Celtic无角基因P202ID位点分型散点图如图2所示；Mongolian无角基因P1ID位点分型散点图如图3所示；Friesian无角基因PC1768587A、P80kbID位点分型散点图分别如图4、图5所示。
表2检测结果
Figure BDA0002543779760000112
Figure BDA0002543779760000121
Figure BDA0002543779760000131
实施例3常规检测验证KASP方法准确性
为了验证KASP检测结果准确性，对所有39头样本进行目标位点PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳或者Sanger测序检测无角基因型。
(1)PCR引物
针对不同无角基因位点，利用文献中报道和Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在线设计的引物进行检测，引物详情见表3。
表3引物序列及扩增片段长度
Figure BDA0002543779760000132
(1)PCR扩增
PCR反应体系：总体积25μL，其中10×Buffer 2.5μL，dNTP混合物(各2.5mM)2μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，上下游引物各(20μM)0.5μL，基因组DNA模板1μL(约50ng)，用双蒸水补足25μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；然后35个循环，94℃变性30sec，在引物对应的退火温度下复性30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸7min。
仪器为Applied Biosystems 9700型PCR仪。
(3)PCR产物的凝胶电泳和Sanger测序
P219ID、P80kbID和P202ID位点的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测分型，PC1768587A位点采用PCR产物直接Sanger测序分型。
制作浓度为2％的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物4μL点样，在TAE缓冲液中110V电压下电泳20min，在凝胶成像系统中观察电泳结果。PCR产物胶图分别如图6，图7，图9所示。Sanger测序峰图如图8所示。
分型结果与本发明KASP结果完全一致，说明检测方法准确。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 用于检测牛无角基因的引物组、试剂盒及方法
<130> KHP201112663.2
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatagttttc ttggtaggct ggtattctt 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgagatagt tttctttgct ctttagatca 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgggataga cttaaaaatg aaaagagagt 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtcaagtgt ctctgtcaag agattcag 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtcaagtg tctctgtcaa gattcaga 28
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctgccatga taaagatgtt ggct 24
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccctcccct gtgtgtg 17
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccctcccctg tgtgca 16
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaagaaacc tacatgagtg agtg 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccagttttat ctttttcccc tccac 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccagttttat ctttttcccc tccaa 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtcaggagg caaaaccaac aat 23
<210> 13
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtgcagaag tcggtggtct gaaaggtcgc ccctcccctg tgtgtgcaca cgtacacact 60
cactcatgta ggtttcttcc ag 82
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcttccttgg tggctcagtc agtaaagaat ctgcctgc 38
<210> 15
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcttccttgg tggctcagtc agagcagaag tcggtggtct gaaaggtcgc ccctcccctg 60
tgtgcacacg tacacactca ctcatgtagg tttcttccag ggcccagag 109
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggggcttcct tggtggctca gtctaaagaa tctgcctgca atgc 44
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcaagaaggc ggcactatct 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tataggcaga gggtcagttt atca 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccatgggtca ctcctacctt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgttgcatt gttcagcaat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggaggttgg catttgattg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaatccagag ttgagccgat 20
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tatcacctgc catgataa 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtcccatc tattgtcc 18

Claims (12)

1.一种用于同时检测牛无角基因的引物组，其特征在于，包括：
引物组I：上游引物：
5’-GATAGTTTTCTTGGTAGGCTGGTATTCTT-3’，
5’-GTGAGATAGTTTTCTTTGCTCTTTAGATCA-3’；
下游引物：
5’-TTGGGATAGACTTAAAAATGAAAAGAGAGT-3’；
引物组II：上游引物：
5’-TGTCAAGTGTCTCTGTCAAGAGATTCAG-3’，
5’-CTGTCAAGTGTCTCTGTCAAGATTCAGA-3’；
下游引物：
5’-CCTGCCATGATAAAGATGTTGGCT-3’；
引物组III：上游引物：
5’-CCCCTCCCCTGTGTGTG-3’，
5’-CCCTCCCCTGTGTGCA-3’；
下游引物：
5’-GGAAGAAACCTACATGAGTGAGTG-3’；
引物组IV：上游引物：
5’-CCAGTTTTATCTTTTTCCCCTCCAC-3’；
5’-CCAGTTTTATCTTTTTCCCCTCCAA-3’；
下游引物：
5’-GGTCAGGAGGCAAAACCAACAAT-3’。
2.权利要求1所述的引物组在制备牛无角基因检测试剂中的应用。
3.用于检测牛无角基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液和/或对照品。
5.一种检测牛无角基因的方法，其特征在于，包括：
1)提取待测样品的DNA；
2)利用权利要求1所述的引物组或权利要求3或4所述的试剂盒进行PCR扩增；
3)根据扩增结果，判断所述待测样品是否携带牛无角基因；和/或，判断所述待测样品的牛无角基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用KASP进行检测。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述PCR扩增的反应程序如下：
(1)95℃，15min；
(2)95℃，20～30sec，61～55℃，45～60sec，每个循环降低0.6℃，10个循环；
(3)95℃，20～30sec，55℃，45～60sec，26个循环；
(4)37℃，60sec。
8.根据权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于，步骤2)中，在进行所述PCR扩增时，针对引物组I～IV分别配置反应体系，1μL反应体系如下：
Figure FDA0004101070220000021
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述引物混合液中，每条所述上游引物的浓度为8～12μM，每条所述下游引物的浓度为20～30μM。
10.权利要求1所述的引物组、权利要求3或4所述的试剂盒或者权利要求5～9中任一项所述的方法在牛的分子育种中的应用。
11.权利要求1所述的引物组、权利要求3或4所述的试剂盒或者权利要求5～9中任一项所述的方法在牛有角或无角性状早期预测中的应用。
12.权利要求1所述的引物组、权利要求3或4所述的试剂盒或者权利要求5～9中任一项所述的方法在筛选无角牛、或淘汰有角牛中的应用。
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