CN116769931B - 一种与猪胴体直长有关的snp标记及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种与大白猪胴体直长相关的SNP标记及应用，所述SNP标记为国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体HOXA5基因(Ensembl数据库，登录号为MARC0046138)rs81238314位点的多态性，该多态性表现为A或C。通过该SNP标记来确定所述大白猪胴体直长生长性状，从优到劣的基因型排序依次为：AA基因型、AC基因型、CC基因型。本申请提供的SNP标记与大白猪肌肉的胴体直长极显著相关，可以通过鉴定该SNP标记来筛选胴体直长优劣的大白猪品系，具有重要的经济效益、实用价值和社会价值。

Description

一种与猪胴体直长有关的SNP标记及应用

技术领域

本申请涉及猪胴体分子标记技术领域，具体涉及一种与猪胴体直长有关的SNP标记及应用。

背景技术

猪胴体直长是指猪肉的背部从颈椎至臀部最宽处的长度，也称为“长身”。对于猪肉来说，胴体直长是一个重要的品质指标之一，与肉质的嫩度、口感和营养含量等相关。猪的遗传类型、饲养环境、饲料和管理条件等因素均会影响猪的胴体直长。其中，遗传类型是决定猪肉品质的主要因素之一，而饲养环境、饲料和管理条件则可以通过改善饲养条件来提高肉品质量。研究表明，胴体直长与猪肉的嫩度、水分含量、pH值和色泽等指标都有一定的关联性。具体而言，胴体直长较大的猪肉通常比较嫩，含水量较高，pH值较低，色泽较浅。猪胴体直长是衡量猪的品质的一个重要指标，因此，寻找与猪胴体直长有关的分子标记已成为当前猪基因组学研究的热点之一。

利用常规的育种方法选育难度较大，且进展缓慢。随着分子生物学的发展，全基因组SNPs分子标记逐渐应用于猪胴体直长的选择育种中。许多鉴定全基因组碱基对序列的基因组项目使生物遗传变异的探索技术得到了迅速发展。由于使用微阵列的DNA芯片技术的发展，通过基于基因型的固体表面选择性杂交，可以对数亿个单核苷酸多态性(SNP)标记进行详尽的分析，因此可以在短时间内鉴定出许多基因，研究人员利用全基因组关联分析技术在嵊县花猪、金华猪群体分别筛选了160124个达到显著性水平的SNP，还利用全基因组SNPs芯片在杜洛克猪中筛选了乳腺癌抗雌激素耐药基因3(BCAR3)、N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)等初情期日龄潜在的候选基因。

虽然目前已经取得了一些进展，但是研究中仍存在一些问题和挑战。迄今为止，尚未通过科学有效的手段筛选出与猪胴体直长直接相关的分子标记。

发明内容

猪胴体直长受到多种因素的影响，包括基因、环境和管理等多方面因素。因此，为了更好地预测猪胴体直长，需要综合考虑多个因素，而不仅仅是单一分子标记的作用。另外，由于猪品种众多，不同品种群体间的遗传差异较大，因此，需要在多个不同的品种中进行系统性的研究才能找到更可靠、有效的分子标记。

本申请目的在于克服现有的技术缺陷，完善与大白猪胴体直长相关的育种分子标记，利用60K的基因芯片对SNP进行分型，并使用全基因组关联分析技术(GWAS)筛选得到与大白猪胴体直长相关的SNP，为猪的遗传育种提供了新的分子标记资源和标记辅助选择的应用基础。

为此，本申请提供了如下技术方案：

一种与大白猪胴体直长相关的SNP标记，所述SNP标记包括：国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体HOXA5基因rs81238314位点发生单核苷酸突变形成的核苷酸序列，所述单核苷酸突变的多态性表现为A/C多态性，其中，AA基因型的大白猪胴体直长最长。

一种核酸分子，其具有国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体HOXA5基因rs81238314位点发生单核苷酸突变形成的核苷酸序列，所述单核苷酸突变的多态性表现为A/C多态性，其中，AA基因型的大白猪胴体直长最长；所述核酸分子作为鉴别和/或检测大白猪胴体直长的生长性状的分子标记。

一种引物对，其用于扩增如所述的核酸分子，其序列为：

CRCL2-F：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

CRCL2-R：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种鉴别和/或检测大白猪胴体直长生长性状的试剂盒，其包括所述的引物对。

一种确定大白猪胴体直长优劣的方法，所述方法包括：

确定大白猪的所述的SNP标记，并根据所述SNP标记确定大白猪胴体直长生长性状的优劣；

所述大白猪胴体直长生长性状从优到劣，以所述SEQ ID NO.1和/或2所示的基因型排序依次为：AA基因型、AC基因型、CC基因型。

所述SNP标记、所述核酸分子、所述方法在确定大白猪胴体直长优劣的应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：

本发明提供的SNP标记与大白猪胴体直长相关，基于该SNP开发的分子标记及引物可用于SNP的检测。因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选大白猪胴体直长品系，所得的猪高胴体直长品系具有重要的食用价值、经济效益与社会价值。

附图说明

图1为本申请实施例提供的曼哈顿图；其中黑色圆圈指向标记的为本申请筛选的分子标记，该分子标记位于大白猪第1号染色体上。

图2为本申请实施例所提取的大白猪基因组DNA的凝胶电泳图，M表示10000bpMarker分子量标准，1～3表示提取的基因组DNA，其中，10000bp Marker分子量条带，从上到下依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、200bp。

图3为本申请实施例提供的筛选SNP突变位点的序列比对分型图，其中箭头处表示突变位点，突变点核苷酸为A或C。

图4为本申请实施例提供的扩增所筛选分子标记所在DNA片段的凝胶电泳图，M表示1000bp Marker分子量标准。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了更好地理解本申请而不是限制本申请的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

本申请提供了如下具体实施方式：

SNP标记的筛选和确认

一、试验样品采集

实验猪群来自湖北某种猪场的1066头纯种大白猪公猪(已阉割，体重为90kg左右)。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

在屠宰前，采集所有试验猪的耳组织样品，放入75％乙醇中保存，为提取猪基因组DNA备用，具体方法参照北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒提供的说明书。

二、猪基因组DNA的提取与检测

本试验采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANampGenomic DNA Kit)从猪耳组织中提取猪基因组DNA，具体操作步骤如下：

用酒精消毒后的眼科手术剪，将猪耳样剪成糊状，加200μl缓冲液GA(该试剂盒自带)，振荡至彻底悬浮；加入20μl蛋白酶K溶液(该试剂盒自带)，混匀，置于56℃水浴锅消化过夜；加入200μl缓冲液GB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作步骤7；将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；取2μl上一步所得溶液DNA溶液和1μl加样缓冲液混匀，上样在1.2％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20min左右，紫外灯下观测电泳结果并拍照，以判断DNA的完整性；

用NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher Scientific，USA)对提取后的DNA进行质量检测，A260/A280的比值在1.7～2.1之间，A260/A230在1.8～2.2之间被判定为合格。对合格的DNA进行浓度测定，然后将浓度统一稀释至200ng/μl，放入-20℃的冰箱存放；不合格的DNA样品则需要重新提取。

三、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控

将1066头猪耳样中提取的基因组DNA样品在Illumina公司研制的PorcineSNP60BeadChip 6全基因组芯片上杂交。该芯片中包含61565个SNP位点。采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，以SNP基因型检出率(SNPcall rate)>90％、最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.01、哈代-温伯格平衡(Hardy-WeinbergEquilibrium,HWE)检验的P值<10^-6以及样本检出率(sample call rate>90％)等指标为标准。

四、数据整理与分析

(1)表型数据分析

利用R统计分析软件，对猪胴体直长进行描述性统计分析，包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。

(2)全基因组关联分析

采用PLINK软件，进行GWAS分析。申请人运用下述混合模型分析数据。

模型为：Yij＝μ+Gi+εij

其中，Yij为处理后的性状值；μ为每个性状的均值；Gi为基因型效应；εij为随机效应。

(3)检验SNP与性状关联的显著性。

当某个SNP符合P<10^-4条件时，我们就认为这个SNP达到了全基因组的基因组水平显著。

(4)SNP注释

根据芯片SNP信息，在Ensembl网站(www.ensembl.org)的Sus scrofa Buid 11.1数据库中，运用Variant Effect Predictor工具，注释该SNP，即确定SNP位点所在染色体及其在染色体上的物理位置，并由此确定这些显著SNPs在Ensembl数据库中已知基因的内部还是侧翼区域内。然后利用生物信息学方法，根据Ensembl、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等提供的基因结构、基因类型、基因功能和通路等信息，对目标区域内的基因进行功能注释。最后通过QTLdb(cn.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index)网站检索该位点是否落在已报道的与肉质性状有关的QTLs中，进一步确定与大白猪胴体直长相关联的SNPs。

五、结果分析

GWAS结果显示，大白猪1号染色体上存在与猪胴体直长显著关联的SNP位点(如图1所示)；此位点位于国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体HOXA5基因(Ensembl数据库，登录号为MARC0046138)rs81238314位点的核苷酸S，对应于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列上的从5’端起第101位点的核苷酸S，所述核苷酸S选自A或C，导致影响猪胴体直长优劣的三种基因型，分别为AA、AC、CC。

表1为猪内含子变体多态性位点rs81238314(MARC0046138基因)基因型检测结果；从表1中可以看出，在1066个个体中，AA基因型有289个，AC基因型有443个，CC基因型有334个。对于大白猪胴体直长生长性状，基因型为AA的个体胴体直长极显著高于AC基因型个体，基因型为AA的个体胴体直长显著高于CC基因型个体；即，所述大白猪胴体直长生长性状从优到劣，以所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列上的从5’端起的101位点的基因型排序依次为：AA基因型、AC基因型、CC基因型；综上，A是有利于大白猪胴体直长的等位基因。

表1

个体数	基因型	胴体直长(cm)
			289	AA	101.22±1.45
443	AC	100.45±0.99
			334	CC	98.85±1.01
		P-value
				AA-AC	0.0361
	AA-CC	0.0250
				AC-CC	0.1689

(注：p＜0.05为差异显著；p＜0.01为差异极显著。)

SNP标记的应用

基于上述发现的SNP，本申请实施例还提供了一种核酸分子，其具有国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体HOXA5基因rs81238314位点发生单核苷酸突变形成的核苷酸序列，所述单核苷酸突变的多态性表现为A/C多态性，其中，AA基因型的大白猪胴体直长最长；所述核酸分子作为鉴别和/或检测大白猪胴体直长的生长性状的分子标记。

在一些实施例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.1和/或2所示。

本申请实施例还提供了一种引物对，用于扩增如SEQ ID NO.1和/或2所示的核酸分子，其序列为：

CRCL2-F：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

CRCL2-R：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本申请实施例还提供了一种鉴别和/或检测大白猪胴体直长生长性状的试剂盒，其包括所述的引物对。

基于此，本申请实施例还提供了所述的SNP标记、所述的核酸分子、所述的方法在确定大白猪胴体直长优劣的应用。

例如，本申请实施例提供了一种利用前述SNP标记确定大白猪胴体直长优劣的方法，所述方法包括：

确定大白猪样品所述的SNP标记，并根据所述SNP标记确定大白猪胴体直长生长性状的优劣；

所述大白猪胴体直长生长性状从优到劣，以所述SEQ ID NO.1和/或2所示的基因型排序依次为：AA基因型、AC基因型、CC基因型。

在一些实施例中，利用前述SNP标记确定大白猪胴体直长优劣的方法包括以下步骤：

(1)提取猪基因组DNA

随意筛选出三个大白猪仔样品，分别编号1～3。用酒精消毒后的眼科手术剪，将猪耳样剪成糊状，加200μl缓冲液GA(该试剂盒自带)，振荡至彻底悬浮；加入20μl蛋白酶K溶液(该试剂盒自带)，混匀，置于56℃水浴锅消化过夜；加入200μl缓冲液GB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，短暂离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(该试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作步骤7；将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；取2μl上一步所得溶液DNA溶液和1μl加样缓冲液混匀，上样在1.2％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20min左右，紫外灯下观测电泳结果并拍照(如图2所示)，以判断DNA的完整性。

(2)设计PCR扩增引物

根据提取的大白猪仔DNA的序列(如SEQ ID NO.1所示)，设计的PCR扩增引物对如下：CRCL2-F：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CRCL2-R：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

(3)PCR扩增

以提取的大白猪仔DNA为扩增模板，根据所设计的引物进行PCR扩增，其中，PCR反应体系为：DNA模板1μl、CRCL2-F和CRCL2-R引物各0.5μl、PCR Mix试剂10μl(2×M5 TaqHiFi PCR Mix，Mei5bio)；PCR扩增程序为：94℃，3min；30cycles(94℃，25s；55～60℃，25s；72℃，10s)；72℃，5min；4℃，∞。结果如图4所示，PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约569bp。

该569bp的目的片段如下：

catggccaggggttgaatctgcatcctcacagagactatgttgggttcttaatccactgagccacaatgggaactcccactactgagtatcaaatgcagaatatggagtcaagaggacacaatatagaattattaatcatatattccatcctcatagaaaaaaagacaaaaggtaagagagtgtaaacaattttaatacaaggattgaaatagtactgggctaggaggaagaaaggcatattaggtcctccaccaagaaacccctagggtggcagcactgaggaagctgctttccaaataA/Ccattttggggggctccgtccatggtaggaaaattgtgtgagaagctatgcaagaaggctatctaaagaggcaagcctgccccttctcttttgatattcatggcaaactaattttctttctccttccatttctccattaattctactacttcaatggccattcttccttttagttcctcacatctatctttggacattggagctatatgtgaaatctaaaatgtgaaaaaaaggaaaagaagtgggtgtaggagagtgggcatgacctt。其中，大写即下划线处即为本申请提供的SNP位点，当下划线为A时如SEQ ID NO.1所示，当下划线为C时如SEQ ID NO.2所示。

(4)基因分型和表型

对以上三个大白猪仔DNA样品的PCR扩增产物进行测序，Snapgene软件与GenBank中猪的相关基因片段进行序列比对、分析(如图3所示)，判读204652721位点的基因型。从猪胴体直长优劣顺序，基因型依次可分为AA型、AC型、CC型其中AA型即为要筛选出的猪胴体直长生长性状优的品种。最终基因分型的结果为，1～2号均为AA型，3号为AC型，1、2号大白猪仔是筛选出来猪胴体直长生长性状优的品种。并对1、2、3号大白猪的猪胴体直长生长表型进行检测，其中，1号大白猪的胴体直长101.2cm，2号大白猪的胴体直长100.1cm，3号大白猪的胴体直长99.8cm，再次说明猪胴体直长生长性状与上述SNP标记的基因型直接相关。

本申请实施例提供的SNP标记还可以用于种猪的筛选，将选基因型为AA型的雄性和雌性亲猪作为种猪进行交配繁育后代，所产的仔猪的基因型均为AA型，即猪胴体直长生长性状优的品种。

综上所述，本申请提供的SNP标记与大白猪胴体直长相关，基于该SNP开发的分子标记及引物可用于SNP的检测。因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选大白猪胴体直长品系，所得的猪胴体直长长的品系具有重要的食用价值、经济效益与社会价值。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种确定大白猪胴体直长优劣的方法，所述方法包括：

确定大白猪胴体直长相关的SNP位点的基因型，所述SNP位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体rs81238314位点；以及

根据所述基因型确定大白猪胴体直长优劣，所述基因型为AA、AC或CC，所述AA、AC、CC对应的大白猪胴体直长由大至小依次排序。

2.检测大白猪胴体直长相关SNP位点基因型的试剂、权利要求1所述的方法在确定大白猪胴体直长优劣的应用，所述SNP位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪1号染色体rs81238314位点，所述基因型为AA、AC或CC，所述AA、AC、CC对应的大白猪胴体直长由大至小依次排序。

3.根据权利要求2所述的应用，所述试剂包括用于扩增SEQ ID NO.1和/或2所示的核酸分子的引物对，所述引物对为如SEQ ID NO.3所示的CRCL2-F和如SEQ ID NO.4所示的CRCL2-R。