CN112322756B - 一种与红鳍东方鲀生长性状相连锁的snp位点 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种关于红鳍东方鲀的快速生长相关的SNP位点及可以降低选种成本并且确保筛选出具有快速生长优良性状的苗种选育方法，所述的SNP位点位于核苷酸序列SEQ ID NO：1的第366位，其碱基为C或A。本发明提供的SNP位点可用于选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体。本发明通过分析等位SNP位点基因型与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现红鳍东方鲀核苷酸序列SEQ ID NO：1的366碱基处存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为AA纯合型个体的体重、体长、体全长显著高于CA与CC基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。并通过基因测序技术筛选，通过测序峰图可筛选出基因型为AA的优良个体。

Description

一种与红鳍东方鲀生长性状相连锁的SNP位点

技术领域

本发明属于鱼类遗传选育技术领域，主要涉及一种与红鳍东方鲀生长性状相连锁的SNP位点。

背景技术

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)属鲀形目(Telraodontiformes)，东方鲀属(Fugu)，主要分布在日本沿海，在我国沿海自然分布数量较少；且由于海洋污染等因素导致其野生群体数量不断缩减，故此每年的捕捞量在逐渐减少。红鳍东方鲀肉质细腻，味道鲜美，营养丰富，素有“鱼类之王”的美誉。

虽然红鳍东方鲀属于有毒鱼类，其肝脏及卵巢等组织含有强烈的神经毒素，然而其毒素制剂在临床上对于治疗关节炎、风湿痛、头痛等疾病有一定效果。因此，此种鱼类具有较高的综合利用价值。

目前红鳍东方鲀自然资源量下降严重，虽然人工养殖规模在逐年增大，但在人工养殖过程中出现了种质退化现象。因此，选育出具有优良生长性状的红鳍东方鲀品种是非常有必要的。

水产动物的常规育种方法主要有选择育种、杂交育种、雌(雄)核发育、人工诱导多倍体发育等，但是常规育种方法只是对不同家系群体进行表征(体重、体长、体全长)选择，并且需要较长的选择周期，并且养殖环境的不同也会对选择造成影响，导致选择结果可信度降低；而分子遗传学标记辅助选择技术是利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行间接选择，是在分子水平对目标性状进行选择，不受环境影响，选择结果可靠，还可以根据遗传背景选择，减少连锁累赘，加速育种进程，因此分子标记辅助育种是一种快速获得理想家系、品系或品种的现代生物育种的理想方法。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种与红鳍东方鲀生长性状相连锁的SNP位点，即一种与红鳍东方鲀体重、体长、体全长生长性状相关的SNP位点，并用于选育具有快速生长性状的红鳍东方鲀，从而弥补现有繁育技术的不足。

本发明首先提供一种与红鳍东方鲀生长性状相关的SNP位点，所述的位点位于序列为SEQ ID NO：1的核苷酸片段的第366位，其碱基为C或A；

本发明提供的SNP位点用于选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体。

本发明另一个方面提供一种筛选具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体的方法，是通过检测上述的SNP位点来实现的；

所述的方法，是通过PCR扩增待检测的红鳍东方鲀个体的核酸样品，PCR产物进行基因测序分析后确定待检测的个体的基因型，来确定是否具有快速生长潜力；

所述的PCR扩增方法，其中所使用的引物的序列信息如下：

F:5’-TGAGCACCTTTAGGAACACG-3’(SEQ ID NO：2)，

R:5’-TTGACAATGCGCTGGGAT-3’(SEQ ID NO:3)；

所述的PCR与基因测序分析，是确定SNP位点的基因型分型，其中基因型为AA纯合型个体的体重、体长、体全长均显著高于CA和CC基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。

本发明通过分析位点基因型与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现红鳍东方鲀与生长性状相关的SNP位点，基因型为AA纯合型个体的体重、体长、体全长均显著高于CA与CC基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)，并通过PCR与基因测序法可快速鉴定对应性状。因此，生产中可优先选择该位点基因型为AA型个体作为亲本进行规模养殖。

附图说明

图1：本发明SNP标记位点处AA、CA、CC三种基因型的测序峰图；其中图a-1、a-2、a-3分别为三种基因型；

图2：本发明PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNA上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性，通过确定SNPs及基因型分型进行选种，是成熟的分子生物技术，SNPs分子标记在禽畜及水产经济动物研究中已得到了广泛地应用，包括QTL定位、分子标记辅助选择等方面。作为新一代的遗传标记技术，SNPs将在水产经济动物遗传育种研究领域发挥巨大的作用。

本发明通过对红鳍东方鲀脂肪酸结合蛋白基因(fatty acid binding proteins)(序列为SEQ ID NO：1)上连续设计多对引物对红鳍东方鲀鱼苗与亲本进行PCR扩增，对其进行基因测序，其中一对引物(为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)扩增的目的片段进行基因型分析时发现了一个SNP位点，共有三种3种基因型，通过Chromas和DNAMAN 8软件分析，筛查出一个SNP位点位于序列SEQ ID NO：1的片段的第366碱基处。再通过SPSS22.0软件分析不同基因型红鳍东方鲀鱼苗280尾个体的突变基因型频率与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现基因型为AA纯合型个体的体重、体长、体全长显著高于CA与CC基因型个体对应生长性状的表型值(p<0.05)。

因此，生产中可优先选择该位点AA基因型个体作为亲本或者进行规模养殖。

下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1筛选SNP位点

本发明的SNP位点的筛选步骤如下：

a)红鳍东方鲀基因组的提取：采用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒从红鳍东方鲀肌肉中提取基因组DNA。取其肌肉不多于30mg放入1.5毫升的离心管中，并用眼科剪尽量将其剪碎，加入200ul的GA缓冲液进行涡旋振荡，再加入20μl蛋白酶K后充分混匀；混匀后，将离心管放入56℃水浴锅中水浴加热，待肌肉组织消化完全后取出；加入200ulGB缓冲液，然后在70℃水浴10分钟，加入200ul无水乙醇颠倒混匀，简短离心；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个CB3吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液；向CB3吸附柱中加入500ulGD缓冲液，12000rpm离心30s，倒掉废液；向CB3吸附柱中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液；重复上一步，然后将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液；在室温下放置数分钟，晾干残余的漂洗液，将CB3转入一个干净的离心管中，悬空滴加50-200ul洗脱液TE，室温下放置2-5min，12000rpm离心2min，将提取出的DNA收集到离心管中，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

b)引物设计及筛选：根据红鳍东方鲀脑型FABP基因的序列(登录号：NC_042286)，利用引物设计软件Primer 5.0在其DNA序列上设计多对引物，对若干红鳍东方鲀鱼苗个体进行PCR与基因测序结果进行分析，筛选出一对存在SNP位点的引物，其引物序列信息如下：

F:5’-TGAGCACCTTTAGGAACACG-3’,

R:5’-TTGACAATGCGCTGGGAT-3’,

c)目的基因PCR扩增。反应体系为25μl：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，F引物(SEQID NO.2)1μl，R引物(SEQ ID NO.3)1μl，基因组DNA 1μl，Taq酶0.5μl，ddH₂O补足至25μl。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸7min。得到的PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳检测。

d)基因测序。将PCR产物送至华大基因进行测序，其目的序列如下：

tgagcacctttaggaacacggagatctccgccaagatgggagaggagtttgatgagactacgcctgatgatcgacacgtcaaagtgagccgactaaatgtagaaatgaaaccttaaccttagcatttgctcccactgagatggtctgaaacgctctcttgcagtcaacgttctccatggagggagacaagctggtgcaagtgcagaagtggaatggcaaggagaccaaatttgtcagagaaatcaaggatggaaagatggtgatggtaagagggagcgcacatttaggtgaaaacctggaaaatggttgaggtttgcaaaccagatcacctcaccttatttacagcgtgcagcaacttgtaatccaaaacactgggaagaatctcttttgctttacacgctcaacatgtttgcattttcccttctcctccgacagtctttgacttttgaaggcgtcacggcggtgcgcacatacgaaaaagcctaacctcagcaagtcatcccagcgcattgtcaa(SEQ IDNO：1)。

实施例2：PCR与基因测序法证明SNP位点与生长性状的相关性

为确定序列为SEQ ID NO：1的红鳍东方鲀片段与生长性状关联的SNP位点，进行PCR和基因测序法检测，包括如下步骤：

a)红鳍东方鲀样品的获取：所采用的实验样品鱼全部采自大连天正水产养殖有限公司，于相同的养殖管理和营养条件下长成随机选出日龄60天的红鳍东方鲀鱼苗个体280尾。

b)数据的采集与基因组DNA的提取：对280尾个体的体重、体长、体全长的表型值进行测量和记录，同时采取肌肉组织用于基因组DNA的提取。

c)PCR反应及测序。反应体系为25μl：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，F引物(SEQ IDNO：2)1μl，R引物(SEQ ID NO：3)1μl，基因组DNA 1μl，Taq酶0.5μl，ddH₂O补足至25μl。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸7min。得到的PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳检测。

d)PCR处理与分析。将PCR产物送至华大基因进行测序，获得如下目的序列，利用在Chromas和DNAMAN 8软件进行分析以确定具体的碱基突变位置。

SNP基因型与生长性状表型值关联分析：

利用SPSS22.0软件对SEQ ID NO：1的红鳍东方鲀片段上的366位的SNP位点的三种基因型与红鳍东方鲀体重、体长、体全长的性状表型值分别进行最小二乘的统计分析关联分析，计算该SNP位点基因型与生长性状的关联性，结果见表1。

采用的模型如下：

Yij＝μ+Gi+eij

其中Yij表示i基因型的第j个个体的体长性状测定值；μ是测定值的均值；Gi是基因型i的遗传效应；eij表示随机误差效应。

表1：红鳍东方鲀SNP多态性与生长性状的最小二乘分析(均值±标准差)

注：同列中字母相同为差异不显著，相邻字母为差异显著(P<0.05)

由表1可知，基因型为AA纯合型个体的体重、体长、体全长显著高于CA与CC基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。

通过检测本发明的SNP位点所筛选的红鳍东方鲀AA基因型个体，其生长速度显著高于CA与CC型个体。因此，本发明提供了一种用于红鳍东方鲀优良品种选育的分子标记。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 一种与红鳍东方鲀生长性状相连锁的SNP位点

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagcacctt taggaacacg gagatctccg ccaagatggg agaggagttt gatgagacta 60

cgcctgatga tcgacacgtc aaagtgagcc gactaaatgt agaaatgaaa ccttaacctt 120

agcatttgct cccactgaga tggtctgaaa cgctctcttg cagtcaacgt tctccatgga 180

gggagacaag ctggtgcaag tgcagaagtg gaatggcaag gagaccaaat ttgtcagaga 240

aatcaaggat ggaaagatgg tgatggtaag agggagcgca catttaggtg aaaacctgga 300

aaatggttga ggtttgcaaa ccagatcacc tcaccttatt tacagcgtgc agcaacttgt 360

aatccaaaac actgggaaga atctcttttg ctttacacgc tcaacatgtt tgcattttcc 420

cttctcctcc gacagtcttt gacttttgaa ggcgtcacgg cggtgcgcac atacgaaaaa 480

gcctaacctc agcaagtcat cccagcgcat tgtcaa 516

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgagcacctt taggaacacg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgacaatgc gctgggat 18

Claims (5)

1.一种SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其第366位的碱基为C或A。

2.权利要求1所述的SNP分子标记在选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体中的应用。

3.一种筛选具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的SNP分子标记来筛选红鳍东方鲀个体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过PCR及基因测序分析来确定红鳍东方鲀个体的基因型。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR及基因测序方法中使用的引物的序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

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