CN111793698B - 一种红鳍东方鲀大规格苗种快速生长相关的snp位点及其应用 - Google Patents

一种红鳍东方鲀大规格苗种快速生长相关的snp位点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种红鳍东方鲀的快速生长相关的SNP位点及可降低选种成本并确保子代性状良好的苗种筛选应用，所述的SNP位点位于核苷酸序列SEQ ID NO：1的第162位，其碱基为C或G。本发明提供的SNP位点可用于选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体。本发明通过分析等位SNP位点基因型与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现红鳍东方鲀核苷酸序列SEQ ID NO：1的162碱基处存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为CC纯合型个体的体重、体长显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。并通过SSCP技术筛选，通过差异的电泳带型可筛选出基因型为CC的优良个体。因此，生产中可使用此方法，筛选该位点基因型为CC型个体作为亲本进行培育及大规格苗种的规模化养殖。

Description

一种红鳍东方鲀大规格苗种快速生长相关的SNP位点及其 应用
技术领域
本发明属于鱼类遗传选育技术领域，具体涉及一种红鳍东方鲀大规格苗种快速生长相关的SNP位点及其应用。
背景技术
红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)属鲀形目(Telraodontiformes)，东方鲀属(Fugu)，以日本沿海为主要分布中心，在我国沿海自然数量较少；且其野生群体因受海洋污染等因素在缩减，故此其每年的捕捞量在逐渐减少。红鳍东方鲀肉质细腻，味道鲜美，蛋白质含量高，素有“鱼类之王”的美称。虽然红鳍东方鲀系有毒鱼类，其肝脏及卵巢等组织所含的毒素是很强烈的神经毒，然而其毒素制剂可以在临床上用于治疗关节炎、风湿痛、头痛等。因此，此种鱼类具有较高的综合利用价值。目前红鳍东方鲀自然资源量下降严重，养殖规模虽然逐渐增大，但在人工养殖过程中出现了种质退化现象。因此，选育出有优良生长性状的红鳍东方鲀品种是非常有必要的。
分子标记辅助育种是快速获得理想家系、品系或品种的现代生物育种的理想方法之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种红鳍东方鲀快速生长相关的SNP位点与应用，即一种与红鳍东方鲀体重、体长生长性状相关的SNP位点，并用于选育具有快速生长性状的红鳍东方鲀，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种与红鳍东方鲀生长性状相关的SNP位点，所述的位点位于序列为SEQ ID NO：1的核苷酸片段的第162位，其碱基为C或G；
本发明提供的SNP位点用于选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体。
本发明另一个方面提供一种筛选具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体的方法，是通过检测上述的SNP位点来实现的；
所述的方法，是通过PCR-SSCP分析检测红鳍东方鲀个体，PCR产物进行SSCP分析后确定待检测的个体是否具有快速生长潜力；
所述的PCR扩增方法，其中所使用的引物的序列信息如下：
F:5’-GATGAAGTCAAAGGTGACCTGG-3’(SEQ ID NO：2)，
R:5’-ACAGAGGTGGATCCCTCCAC-3’(SEQ ID NO:3)；
所述的PCR-SSCP分析，是确定SNP位点的基因型分型，其中基因型为CC纯合型个体的体重、体长显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。
本发明通过分析位点基因型与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现红鳍东方鲀核苷酸序列SEQ ID NO：1的第162bp处碱基存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为CC纯合型个体的体重、体长显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)，并通过PCR-SSCP法可快速鉴定对应性状。因此，生产中可优先选择该位点基因型为CC型个体作为亲本进行规模养殖。
附图说明
图1：本发明SNP标记位点处CC、GG两种基因型的测序峰图。
图2：本发明PCR-SSCP法检测核苷酸序列SEQ ID NO：1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中泳道1,2:CG型；泳道3:GG型；泳道4,5:CC型。
具体实施方式
单链构象多态性分析技术(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)是基于PCR基础之上的以构象为基础的检测基因组中单核苷酸变异的方法。其原理是在不含变性剂的非变性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段有基因变异存在。
在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DNA分成单链，再用凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNA上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性，通过确定SNP及基因型分型进行选种，是成熟的分子生物技术，SNPs分子标记在禽畜及水产经济动物研究中已得到了广泛地应用，包括QTL定位、分子标记辅助选择等方面。作为新一代的遗传标记技术，SNPs将在水产经济动物遗传育种研究领域发挥巨大的作用。
本发明通过对红鳍东方鲀肥胖基因(obesity gene)连续设计多对引物对红鳍东方鲀鱼苗个体进行PCR-SSCP法带型分析，其中一对引物(为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)扩增的片段进行单链构象多态性分析可产生3种带型，对对该扩增片段行测序，其序列SEQ IDNO：1。
通过Clustal比对，筛查出一个SNP位点位于序列SEQ ID NO：1的片段的第162碱基处。再通过PCR-SSCP法的不同带型对红鳍东方鲀鱼苗296尾个体分析点突变基因型频率与红鳍东方鲀生长性状的相关性，发现基因型为CC纯合型个体的体重、体长显著高于GG基因型个体对应生长性状的表型值(p<0.05)。
因此，生产中可优先选择该位点基因型为CC型个体作为亲本或者进行规模养殖。
下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1筛选SNP位点
本发明的SNP位点的筛选步骤如下：
a)红鳍东方鲀基因组的提取：采用酚-仿抽提法从红鳍东方鲀肌肉中提取基因组DNA。取其肌肉100mg放入1.5毫升的离心管中，并用眼科剪尽量将其剪碎，加入500ul提取液和3μl蛋白酶K后充分混匀；混匀后，将离心管放入55℃水浴锅中水浴加热，每15分钟翻转一次，待样品裂解成澄清粘稠状液体后，取出加入等体积饱和酚，轻柔混匀10分钟。以12000rpm，离心10min；取上清液，加入等体积苯酚/氯仿(1：1)混合液轻柔混匀10分钟，放入离心机中，以12000rpm，离心10min；取上清液，加入等体积氯仿轻柔混匀10分钟。放入离心机中，以12000rpm，离心10min；取上清液，加入2倍体积的无水乙醇(摇匀)，沉淀DNA；弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2-3次后，常温晾干；加入100ulTE水溶解成母液(4℃或-20℃保存备用)；加入RNA酶2ul轻弹混匀后，放入37℃水浴锅中水浴1h；琼脂糖凝胶电泳检测DNA。
b)引物设计及筛选：根据红鳍东方鲀ob基因的序列，利用引物设计软件Primer5.0在其DNA序列上设计多对引物，对若干红鳍东方鲀鱼苗个体进行PCR-SSCP法带型分析，筛选出一对扩增产物有不同分型，存在SNP位点的引物，其引物序列信息如下：
F:5’-GATGAAGTCAAAGGTGACCTGG-3’，
R:5’-ACAGAGGTGGATCCCTCCAC-3’，
c)目的基因PCR扩增。反应体系为25μl：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，F引物(SEQID NO.2)1μl，R引物(SEQ ID NO.3)1μl，基因组DNA 1μl，Taq酶0.2μl，双蒸水补足至25μl。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸7min。得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶下电泳检测。
d)目的片段的克隆。PCR产物使用切胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)回收目的片段，再与pMD19T-Vector载体(大连宝生物工程有限公司)连接，转化至感受态大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选法挑选阳性克隆，接种于涂有ITPG(4μl)和X-Gal(40μl,20mg/μl)的LB固体培养基上。从上述LB平板上选取白色单菌落接种于5ml Amp抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养14-16小时。将菌液吸取1ul作为模板进行菌液PCR鉴定，鉴定完成后，提取质粒并送大连宝生物工程有限公司进行Sanger测序，获得的目的片段的序列如下：
Figure BDA0002586278950000051
实施例2：PCR-SSCP法证明SNP位点与生长性状的相关性
为确定序列为SEQ ID NO：1的红鳍东方鲀片段与生长性状关联的SNP位点，进行PCR-SSCP法检测，包括如下步骤：
a)红鳍东方鲀样品的获取：所采用的实验样品鱼全部采自大连富谷水产养殖有限公司，于相同的养殖管理和营养条件下长成随机选出日龄为102天的红鳍东方鲀鱼苗个体296尾。
b)数据的采集与基因组DNA的提取：对296尾个体的体重和体长的表型值进行测量和记录，同时采取肌肉组织用于基因组DNA的提取。
c)PCR反应及测序。反应体系为25μl：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，F引物(SEQ IDNO：2)1μl，R引物(SEQ ID NO：3)1μl，基因组DNA 1μl，Taq酶0.2μl，双蒸水补足至25μl。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸7min。得到的PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶下电泳检测。
d)SSCP聚丙烯凝胶电泳。10％非变性聚丙烯酰胺凝胶配制方法：30％丙烯酰胺溶液10ml，5×TBE 3ml，50％甘油3ml，双蒸水14ml，10％过硫酸胺溶液300μl，TEMED 25μl。灌入垂直电泳槽，并插入梳子，30min左右可聚合完全。在电泳槽上端加满1×TBE，110V电压下预电泳10分钟。扩增产物与上样缓冲液按体积比1：5混匀后加入点样孔内。1×TBE，120V恒压电泳10个小时，电泳至凝胶底部即可结束。电泳结束后將凝胶放入加有固定液的瓷盘中(固定液为10％乙醇溶液,每板用量约为200ml)在摇床上缓缓摇动10min。倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗2次。倒掉瓷盘中的水，加入染色液(0.1％AgNO3溶液，每板约200ml)，在摇床上缓缓摇动染色15min。倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗3次。加入显色液(2gNaOH,0.1gNa2CO3,加双蒸水到250ml,在加入800μl甲醛)，振荡显色，一般于5-15min内，带型显现，待带型清晰时，将胶用清水冲洗干净，放置在成像仪上扫描。
SNP基因型与生长性状表型值关联分析：
利用SPSS13.0软件对SEQ ID NO：1的红鳍东方鲀片段上的162位的SNP位点的三种基因型与红鳍东方鲀体重和体长的性状表型值分别进行最小二乘的统计分析关联分析，计算该SNP位点基因型与生长性状的关联性，结果见表1。
采用的模型如下：
Yij＝μ+Gi+eij
其中Yij表示i基因型的第j个个体的体长性状测定值；μ是测定值的均值；Gi是基因型i的遗传效应；eij表示随机误差效应。
表1：红鳍东方鲀核苷酸SEQ ID NO：1序列的SNP-SSCP多态性与生长性状的最小二乘分析(均值±标准差)
Figure BDA0002586278950000071
注：同列中字母相同为差异不显著，相邻字母为差异显著(P<0.05)
由表1可知，基因型为CC纯合型个体的体重、体长显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。
通过检测本发明的SNP位点所筛选的红鳍东方鲀CC基因型个体，其生长速度显著高于GG型个体。因此，本发明提供了一种用于红鳍东方鲀优良品种选育的分子标记。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 一种红鳍东方鲀大规格苗种快速生长相关的SNP位点及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 红鳍东方鲀(Fugu rubripes)
<400> 1
gatgaagtca aaggtgacct ggaaggccca agggctggtg gcccggatag acaagcattt 60
cccggtaacc cgccatttgt ttcacaatct tcgctcttcc ttgattggtt atcggcaccc 120
gtgtcactaa cactggcctt ttcaccgcag gatcgcggcc tccgcttcga caccgacaag 180
gtggagggat ccacctctgt 200
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgaagtca aaggtgacct gg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acagaggtgg atccctccac 20

Claims (9)

1.一种SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其第162位的碱基为C或G。
2.权利要求1所述的SNP分子标记在选育具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体中的应用。
3.一种筛选具有快速生长潜力的红鳍东方鲀个体的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的SNP分子标记来筛选红鳍东方鲀个体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过PCR-SSCP方法分析检测红鳍东方鲀个体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR-SSCP方法中使用的引物的序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
6.一种用于筛选红鳍东方鲀个体快速生长个体的分子试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的试剂。
7.如权利要求6的分子试剂盒，其特征在于，所述的试剂为PCR-SSCP方法所使用的试剂。
8.如权利要求7所述的分子试剂盒，其特征在于，所述的试剂中包含有PCR-SSCP方法所使用的引物。
9.如权利要求8所述的分子试剂盒，其特征在于，所述的引物的序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
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