CN111763745B

CN111763745B - 一种用于选择暗纹东方鲀体重快速生长的snp位点与应用

Info

Publication number: CN111763745B
Application number: CN202010654288.XA
Authority: CN
Inventors: 王秀利; 余云登; 仇雪梅; 朱浩拥; 王耀辉; 朱永祥; 钱晓明
Original assignee: Dalian Ocean University
Current assignee: Dalian Ocean University
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: CN111763745A

Abstract

本发明提供一种暗纹东方鲀快速生长相关的SNP位点与应用，所述的SNP位点位于核苷酸序列为SEQ ID NO：1的leptin基因的第126位，其碱基为T或G。本发明提供的SNP位点用于选育具有快速生长潜力的暗纹东方鲀个体。本发明通过分析位点基因型频率与暗纹东方鲀生长性状的相关性，发现暗纹东方鲀的leptin基因的126位碱基处存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为TG杂合型个体的体重显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。因此，生产中可优先选择该位点基因型为TG型个体进行规模化养殖。

Description

一种用于选择暗纹东方鲀体重快速生长的SNP位点与应用

技术领域

本发明属于鱼类遗传选育技术领域，具体涉及一种暗纹东方鲀快速生长相关的SNP位点与应用。

背景技术

暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)属于硬骨鱼纲，鲀形目，鲀科，东方鲀属，是我国特有河鲀物种，著名的“长江三鲜”之一，具有很高的经济价值。但与其他种类的养殖河鲀如红鳍东方鲀相比，暗纹东方鲀有着生长速度慢的缺点，例如2年龄养殖型红鳍东方鲀平均体长30.4cm左右，平均体重1062g左右；而同龄养殖型暗纹东方鲀平均体长只有24.9cm左右，平均体重只有611g左右。低生长速度直接导致暗纹东方鲀的产量低，影响其养殖效益。因此，改良暗纹东方鲀生长速度的工作对于暗纹东方鲀养殖产业的发展具有积极意义。

分子标记辅助育种是快速获得理想家系、品系或品种的现代生物育种的理想方法之一。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组DNA上由单个核苷酸突变所引起的DNA序列多态性，通过确定SNP及基因型分型进行选种是成熟的分子生物技术，已在畜禽及水生动物中得以应用，与传统方法相比，提高了选育效率。但在暗纹东方鲀育种领域中还缺少可以应用的辅助分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种暗纹东方鲀快速生长相关的SNP位点与应用，即筛查出基因中与体重相关的SNP位点，并用于选育快速生长的暗纹东方鲀。

本发明首先提供一种与暗纹东方鲀生长性状相关的SNP位点，所述的位点位于核苷酸序列为SEQ ID NO：1的核酸片段的第126位，其碱基为T或G；

本发明提供的SNP位点用于选育具有快速生长潜力的暗纹东方鲀。

本发明另一个方面提供一种筛选快速生长潜力的暗纹东方鲀个体的方法，是通过检测上述的SNP位点来实现的；

所述的方法，是通过PCR扩增方法检测暗纹东方鲀个体，PCR产物进行测序分析后确定待检测的个体是否具有上述的SNP位点的基因型分型；

所述的PCR扩增方法，其中所使用的引物的序列信息如下：

SNP-f:5’-TATGGGACGATGGTGAAACG-3’(SEQ ID NO:2)，

SNP-r:5’-ATGGCATCACGGAGGAAGAC-3’(SEQ ID NO:3)；

所述的测序分析，是确定SNP位点的基因型分型，其中基因型为TG杂合型个体的体重显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。

本发明通过分析位点基因型频率与暗纹东方鲀生长性状的相关性，发现暗纹东方鲀的leptin基因的126碱基处存在与生长性状相关的SNP位点，基因型为TG杂合型个体的体重显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。因此，生产中可优先选择该位点基因型为TG型个体作为亲本或者进行规模养殖。

附图说明

图1：本发明的SNP标记位点筛选的序列比对图，其中方框代表SNP位点的不同碱基突变，K代表TG杂合基因型个体；

图2：本发明的SNP标记位点处TG、GG和TT三种基因型的测序峰图；TG、GG和TT三种基因型对应的SNP位点的测序峰图分别为单峰、套峰和单峰。

具体实施方式

本发明通过测序和Clustal比对，筛查SNP位点，并分析位点基因型频率与暗纹东方鲀生长性状的相关性，发现序列SEQ ID NO.1的瘦素基因(leptin)第126碱基处，基因型为TG杂合型个体的体重显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。因此，生产中可优先选择该位点基因型为TG型个体作为亲本或者进行规模养殖。

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1克隆暗纹东方鲀leptin基因核苷酸序列

瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene)的产物，属Ⅰ型细胞因子。在鱼体内调节摄食、能量代谢、繁殖等与生长发育相关的生理过程。本发明克隆leptin基因的步骤如下：

a)暗纹东方鲀基因组的提取：采用常规酚仿法抽提暗纹东方鲀鱼鳍中的基因组DNA。取暗纹东方鲀背鳍组织120mg于1.5ml的离心管中，并用眼科剪将其剪碎；向已剪碎尾鳍的离心管中加入700μL DNA提取液；加蛋白酶K(20mg/ml)5μL，轻轻混匀，放入55℃水浴中消化2小时；将溶液冷却至室温，加等体积苯酚，抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积酚，仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；取上清加入一新的1.5ml离心管中，加等体积氯仿抽提10分钟，12000rpm离心10分钟；取上清加入一新的离心管中，加2倍体积无水乙醇，12000rpm离心5分钟；弃掉乙醇溶液，用70％乙醇洗沉淀2次，5000rpm离心5分钟；弃掉乙醇，室温放置10分钟，用100μL TE溶解沉淀DNA。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，DNA溶液于-4℃或-20℃保存备用。

b)引物设计：根据Genbank上已报道的红鳍东方鲀染色体NC_042293.1上2871689-2874138bp间的leptin基因核苷酸序列，设计出能够扩增包含目的基因编码区序列的引物：

leptin-f1:5’-TATGGGACGATGGTGAAACG-3’，

leptin-r1:5’-ATGGCATCACGGAGGAAGAC-3’，

克隆暗纹东方鲀的leptin基因核苷酸序列的编码区。

c)目的基因PCR扩增。反应体系为50μl：10×buffer 5μl，dNTP 4μl，leptin-f1引物2μl，leptin-r1引物2μl，基因组DNA 2μl，EX Taq酶0.5μl，双蒸水补足至50μl。PCR反应程序为：98℃，30s；98℃10s，65℃30s，72℃2min30s，30个循环；72℃3min。扩增产物使用1％琼脂糖电泳检验。

d)目的片段测序。PCR产物直接送北京六合华大基因科技有限公司进行Sanger测序。获得的暗纹东方鲀leptin基因全长681bp(SEQ ID NO:1)，与红鳍东方鲀leptin基因序列比对，同源性为96.71％。利用DNAMAN8.0软件推导氨基酸序列、ExPaSy(https://www.expasy.org/)网站分析氨基酸理化性质及蛋白质疏水性、SignalP4.1

(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件预测信号肽位点。克隆得到的基因片段长681bp；ORF 459bp，编码152个氨基酸，在第19-20氨基酸处有信号肽剪切位点；leptin蛋白分子量19948.69Da，等电点6.90，总平均亲水性-0.089。

实施例2：筛选获得SNP位点

确定暗纹东方鲀leptin基因与生长性状关联的SNP的位点，包括下列步骤：

a)SNP位点筛选样品的获取：所用样品为采自江苏中洋集团养殖场养殖的2龄的暗纹东方鲀的鱼鳍，共随机采集了24尾鱼的鱼鳍。

b)基因组DNA的提取：提取上述24个样品的基因组DNA。

c)PCR反应及测序：反应体系为50μl：10×buffer 5μl，dNTP 4μl，leptin-f1引物2μl，leptin-r1引物2μl，基因组DNA 2μl，EX Taq酶0.5μl，双蒸水补足至50μl。PCR反应程序为：98℃，30s；98℃10s，65℃30s，72℃2min30s，30个循环；72℃3min。扩增产物使用1％琼脂糖电泳检验。使用ABI3730测序仪对PCR产物直接进行Sanger测序，将测序得到的序列进行Clustal比对分析筛选出DNA序列SEQ ID NO.1第126碱基处存在SNP位点，结果见图1。等位基因为T和G，有TG、GG和TT三种基因型，结果见图2。

d)SNP与生长关联分析的样品获取：所采用的群体为江苏中洋集团养殖场养殖的2龄的暗纹东方鲀，从养殖群体中随机选出178个暗纹东方鲀个体。

e)数据的采集与基因组DNA的提取：对178个样本的体重表型值进行测量和记录，同时剪取背鳍部分鳍条用于基因组DNA的提取。

f)PCR反应及测序：方法同(c)相同。

SNP基因型与生长性状表型值关联分析：

利用SPSS18.0软件对该SNP位点的三种基因型与暗纹东方鲀体重的性状表型值分别进行最小二乘的统计分析关联分析，计算该SNP位点基因型与生长性状的关联性，结果见表1。

采用的模型如下：

Yij＝μ+Gi+eij

其中Yij表示i基因型的第j个个体的体长性状测定值；μ是测定值的均值；Gi是基因型i的遗传效应；eij表示随机误差效应。

表1：暗纹东方鲀leptin基因SNP与生长性状的相关信息(均值±标准差)

注：同列中字母相同为差异不显著，相邻字母为差异显著(P<0.05)

由表1可知，基因型为TG杂合型个体的体重显著高于GG基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。

利用引物SNP-f(SEQ ID NO.2)和SNP-r(SEQ ID NO.3)扩增2月龄幼鱼的leptin基因序列，测序并检测SNP位点基因型，筛选出符合基因型为TG和GG的幼鱼。测量并记录初始体重并用外挂标签做好标记。混养于水族箱，养殖4个月后，再次测量记录体重值，将鱼体的体重体重增加量与基因型进行关联分析。结果表明，基因型为TG的幼鱼的体重增加量显著高于基因型GG的幼鱼个体。

综上结果表明，通过使用本发明的SNP引物和方法筛选的暗纹东方鲀TG基因型个体，其生长速度显著高于GG型个体，对暗纹东方鲀良品种的选育工作提供了快速准确的检测方法。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 一种用于选择暗纹东方鲀体重快速生长的SNP位点与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaaacggcc agtgagcgaa ggaaatgcgt gaaccgtgcg gctgactttg ttactcttcc 60

aggaagcttt caagagcaac acctggacaa aaaggtgccg acatggatca cattctggcc 120

cttgttctgg ccctgctgcc gctgagcttg tgcgtggccc tgcctggtgc actggatgca 180

atggacgtgg agaagatgaa gtcaaaggtg acctggaagg ccctagggct ggtggcccgg 240

atagacaagc atttcccggt aacccgccat ttgtttcaca atcttcgctc ttccttgatt 300

ggttatcggc acctgtgtca ctaacactgg ccttttcacc gcaggatcgc ggcctccgct 360

tcgacaccga caaggtggag ggatccacct ctgttgtggc ctccctggag agttacaaca 420

acctgatttc ggaccgcttc ggcggcgtct cgcagatcaa gaccgaaatc tcctctctgg 480

cgggttacct caatcactgg agggagggca actgccaaga gcagcagccc aaagtgtggc 540

cgaggaggaa tatcttcaat cacaccgtgt ccctcgaggc tctgatgagg gtgagggagt 600

tcctcaagct gctggtggaa aatcaggatc ttctggagaa atgttagaaa acggaccagt 660

gtttgggagt catggctggt t 681

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatgggacga tggtgaaacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcatcac ggaggaagac 20

Claims

1.一种筛选快速生长潜力的暗纹东方鲀个体的方法，其特征在于，所述的方法是通过PCR扩增来检测与暗纹东方鲀生长性状相关的SNP分子标记，将PCR产物进行测序分析后，确定待检测的个体的基因型是否具有TG基因型分型来确定是否具有快速生长的潜力；所述的SNP分子标记是位于核苷酸序列为SEQ ID NO：1的leptin基因的第126位。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增方法，其中所用的引物的上下游序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。