CN103320517A

CN103320517A - 一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物和方法

Info

Publication number: CN103320517A
Application number: CN2013102788768A
Authority: CN
Inventors: 刘新富; 刘滨; 胡鹏; 孟振; 陈松林
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-07-04
Also published as: CN103320517B

Abstract

本发明公开了一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物和方法，本发明针对红鳍东方鲀雌雄个体性别差异基因上存在的G-C单核苷酸突变位点，设计了分别扩增性别差异基因序列的一对外侧PCR引物和含有针对突变位点的错配碱基的内侧PCR引物。利用所述引物，红鳍东方鲀不同性别DNA样品可以得到不同扩增结果，从而判断红鳍东方鲀性别差异。本发明成本低廉、操作简单、快速、准确并适合于推广应用，可在提取1龄以内红鳍东方鲀基因组DNA的基础上快速准确对红鳍东方鲀幼鱼的性别进行鉴定，对加快红鳍东方鲀单性选育进程及分子生物学领域快速的PCR检测方法研究有着重要的应用价值。

Description

一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物和方法。

背景技术

红鳍东方鲀（Takifugurubripes）是鲀形目中最名贵的海水鱼类，虽然属于有毒鱼类，但是日本、韩国和我国民间嗜食鲀类的习俗由来已久，早有“拼死吃河鲀”一说，特别是日本，更是将红鳍东方鲀奉为“鱼中之王”、“百鱼之首”，其生鱼片独领风骚，价格昂贵，历来是日本食文化的重要代表。红鳍东方鲀不仅具有极高的食用价值，其卵巢、肝脏、血液等组织所含的河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX）及其制剂是缓解肌肉痉挛和镇痛的高级药物，国际市场上售价高达人民币5～7×10⁴元/g，其外皮还可制革，其养殖和开发应用前景广阔。

我国的红鳍东方鲀苗种培育技术在20世纪90年代初即由黄海水产研究所研究开发成功，但是由于红鳍东方鲀有毒，在我国的食用受到限制，阻碍了对它的开发和利用。自1992年以来，由于日本和韩国市场对红鳍东方鲀的需求增加，我国的红鳍东方鲀产业化养殖才逐步在河北秦皇岛和昌黎、辽宁大连、庄河和丹东以及山东烟台和威海等地兴起和发展，养殖规模不断扩大，至2006年年养殖产量已高达5,000吨，产值近5亿元，成为我国北方沿海海水养殖重要的出口创汇品种之一，对于促进我国北方，特别是辽宁省的方海水养殖经济发展发挥了重要作用。

红鳍东方鲀雌雄生长速度虽然差异不是很大，但是商品鱼市场价格差别很大，成熟季节雄鱼的肉质要比雌鱼好，雄鱼所含有的精巢在日本又称“白子”，被视为不可多得的美味，市场价格达到每公斤1400元，养殖雄鱼的利润是雌鱼的2倍以上，全雄苗种自然成为红鳍东方鲀养殖更为有利的选择。日本从上世纪90年初期即开始对红鳍东方鲀的性别决定机制以及性别控制技术进行研究，近年来，我国对红鳍东方鲀的性别决定机制方面的研究逐步开始加强。

随着分子生物学技术特别是测序技术的不断发展，多种生物的全基因组测序工作宣告完成，决定生物多样性的遗传信息得以揭示，这为各类生物个体差异的鉴定和研究提供了广泛依据。核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指群体中基因组DNA序列上单个核苷酸的变异，生物中的SNP数量多、分布广、高度稳定，并且易于分型，是开发新型分子标记的重要遗传基础。目前，基于SNP的分子标记已经在人类、拟南芥、水稻基因组中大量开发。此外，根据群体中的SNP设计等位基因特异引物，针对性的建立等位基因特异PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)，也成为检测生物的多样性的一种快速、简便、低成本的检测基因型SNP的方法。

红鳍东方鲀是较早开展全基因组测序的鱼类物种，2002年日本科学家率先宣布红鳍东方鲀全基因组测序完成，近年来其全基因组序列的拼接和分析工作一直在进行，一批在种质鉴定、多样性研究方面具有重要价值的SNP相继被发现。但是如何将这些重要的遗传信息资源有效应用于红鳍东方鲀良种培育等实际生产中并开发快速、高效的检测技术却成为了水产育种研究人员急需解决的现实问题。迄今为止，关于红鳍东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的等位基因特异PCR方法以及快速检测分子生物学试剂盒国内外尚未见报道。

目前已有的发明公开了一种东方鲀属河豚鱼早期性别的鉴别方法，首先提取成熟河豚鱼尾鳍组织mRNA，利用mRNA反转录试剂盒合成双链cDNA，以此为模板，利用cDNA-AFLP法经过预扩增和选择性扩增、AFLP电泳检测，获得雌雄河豚鱼尾鳍组织的差异核酸片段，进一步克隆该片段并测序，后根据测得序列设计出特异引物；利用该引物对1龄以上雌雄河豚鱼进行验证。该发明需要经过mRNA提取、反转录、AFLP-PCR、电泳等多个过程，不仅实验过程繁琐、不易操作而且所需的内切酶等试剂的价格也相对昂贵，因此更加适合一些小样本的检测。

红鳍东方鲀具有极高的经济价值，如果能够对红鳍东方鲀幼鱼的性别分化进行鉴定，对于研究其性别决定机制以及性别控制技术将具有重要的价值。因此，在科学研究和实际生产中十分必要建立一种准确、快速、经济的检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法。

发明内容

本发明的目的是提供了一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物及方法，本发明针对红鳍东方鲀雌雄个体性别差异基因上存在的G-C单核苷酸突变位点，设计了分别扩增性别差异基因序列的一对上、下游PCR引物和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物，所述含有错配碱基的下游PCR引物的3’末端位于突变位点上。利用所述引物，采用双重PCR方法对红鳍东方鲀不同性别DNA样品可以得到不同扩增结果，从而判断红鳍东方鲀性别差异。利用本发明所述技术方案能够快速、准确地对性别差异基因上G-C单核苷酸的多态性和雌雄性别进行了鉴定，可以快速鉴定红鳍东方鲀未成熟幼鱼的性别。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物，所述引物包括扩增性别差异基因序列的上游引物F1、下游引物R1和含有针对单碱基突变位点的错配碱基的下游引物Inner R5，

所述上游引物F1：5’-TAGACACGATGCACACAAACCAC-3’；

所述下游引物R1：5’- CGCAAAATGAGGCTCTCTATGGAG -3’；

所述下游引物Inner R5：5'-GCATCAGATTCCATCTGTTGTGAAGACC-3'。

进一步的，所述单碱基突变位点为G-C单核苷酸突变位点。

进一步的，所述G-C单核苷酸突变位点位于红鳍东方鲀Amhr2基因上的第9个外显子上。

本发明还提供了利用所述引物快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，它包括以下步骤：采集待测红鳍东方鲀幼鱼样品，提取红鳍东方鲀幼鱼的全基因组DNA；采用所述上游引物F1和下游引物R1进行第一轮PCR扩增，进行电泳检测，呈现625bp条带的为性别差异基因序列；将第一轮PCR产物稀释后作为模板，采用所述上游引物F1和下游引物Inner R5进行第二轮PCR扩增，进行电泳检测，扩增出 334bp条带的为红鳍东方鲀雄性个体，该位置无扩增条带的为红鳍东方鲀雌性个体。

进一步的，第一轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括浓度10μM的引物F1和R1各为1μL，浓度2.5mM 的dNTP 1μL，浓度5U/μL 的Taq DNA聚合酶0.5μL，10×Buffe 2.5μL，Mg²⁺15 μM，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

进一步的，所述第一轮PCR反应条件为：预变性95℃5min，变性94℃60s，退火58℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

进一步的，第二轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括浓度10μM的引物F1和R1各为1μL，浓度2.5mM 的dNTP 1μL，浓度5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，10x Buffe 2.5μL，Mg²⁺ 15 μM，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

进一步的，所述第二轮PCR反应条件为：预变性95℃1min，变性94℃60s，退火64℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

进一步的，第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮PCR的模板。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明以红鳍东方鲀幼鱼雌雄个体的基因组DNA为实验材料，针对红鳍东方鲀雌雄个体性别差异基因上存在的G-C单核苷酸突变位点，设计了分别扩增性别差异基因序列的一对上游PCR引物F1、下游PCR引物R1和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物Inner R5。以红鳍东方鲀幼鱼DNA样品为模板进行双重PCR，采用性别差异基因序列的上游PCR引物F1和扩增性别差异基因序列的下游PCR引物R1进行第一轮PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，呈现625bp条带的为性别差异基因序列，该序列包含G-C单核苷酸突变位点，将第一轮PCR产物稀释50倍后作为模板，采用扩增性别差异基因序列的上游PCR引物F1和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物Inner R5进行第二轮PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出 334bp条带的为红鳍东方鲀雄性个体DNA样品，该位置无扩增条带的为红鳍东方鲀雌性个体DNA样品。采取本发明技术方案对不同性别红鳍东方鲀幼鱼进行性别鉴定的结果与通过性腺组织切片方法鉴定的结果完全一致，因此通过对本发明的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳就可以对红鳍东方鲀被测样品的性别作出准确判断。

本发明能够以基因组DNA为模板，仅仅通过简单的PCR和电泳结果就能够进行基因型的鉴定，从而克服其他方法操作较繁琐，耗时较长的缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。

本发明成本低廉、操作简单、快速、准确并适合于推广应用，可在提取1龄以内红鳍东方鲀幼鱼基因组DNA的基础上快速准确对红鳍东方鲀幼鱼的性别进行鉴定，对加快红鳍东方鲀单性选育进程及分子生物学领域快速的PCR检测方法研究有着重要的应用价值。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是红鳍东方鲀幼鱼6个个体的性别差异基因的第一轮PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为分子量标记，从下至上的条带依次为100bp、200bp、250bp、500bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大；1、3、5泳道为红鳍东方鲀雌性幼鱼，2、4、6泳道为红鳍东方鲀雄性幼鱼。

图2是红鳍东方鲀幼鱼8个个体的性别差异基因的第二轮PCR反应后的电泳检测结果，其中M为分子量标记，从下至上的条带依次为100bp、200bp、250bp、500bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大；1、3、5、7泳道为红鳍东方鲀雌性幼鱼，2、4、6、8泳道为红鳍东方鲀雄性幼鱼。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法包括以下步骤：

1、样品采集

本实施例采用20个不同性别的红鳍东方鲀幼鱼作为研究对象，所有20个个体均随机抽取自某水产公司养殖的红鳍东方鲀幼鱼群体。每个个体分别取性腺组织放入Bouin’s液中固定24h，50%乙醇冲洗后置于70%乙醇中保存；剪取鳍条组织冷冻保存（-20℃）。

2、红鳍东方鲀幼鱼性腺组织切片和性别分化鉴定

将固定好的红鳍东方鲀幼鱼性腺组织样品采用常规方法进行组织切片，切片厚度4~7μm，H.E染色。用OLYMPUS DP72显微镜观察并拍照，测量生殖细胞的大小。

卵母细胞呈卵圆形，体积明显大于卵原细胞，细胞直径9.37-12.45μm，细胞质嗜碱性；细胞核大且较亮，直径4.85～7.23μm，核仁3～6个。初级卵母细胞的出现标志着红鳍东方鲀卵巢细胞学分化的开始。初级精母细胞比精原细胞小，细胞质基本不着色，细胞核嗜碱性强，核染色深；初级精母细胞的出现标志着红鳍东方鲀精巢细胞学分化的开始。在选取的20个红鳍东方鲀幼鱼个体中，经过切片鉴定后，雌雄个体的比例为16：4。

3、提取红鳍东方鲀幼鱼的全基因组DNA

剪取红鳍东方鲀幼鱼的鳍条部分组织冷冻保存（-20℃），采用天根公司的海洋动物基因组DNA提取试剂盒和方法，经优化后提取红鳍东方鲀幼鱼的基因组总DNA。

具体步骤为：首先每个样品取冷冻保存的鳍条组织20mg，加入200μL GA溶液，漩涡震荡15秒，加入20μL Proteinase-K (20mg/mL)漩涡均匀后置于56℃下裂解1小时，然后加入200μL GB，充分混匀后，70℃下放置10分钟，然后加入200μL无水乙醇，充分混合后将溶液和絮状沉淀都加入到1个吸附柱CB3中，12000转/分离心30秒，然后倒掉废液，向吸附柱CB3中加入500μL 缓冲液GD，12000转/分离心30秒，倒掉废液，随后向吸附柱CB3中加入700μL 漂洗液PW，12000转/分离心30秒，倒掉废液，随后向吸附柱CB3中再加入500μL 漂洗液PW，12000转/分离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 12000转/分离心2分钟，倒掉废液，空气中晾干后置于一个干净的离心管中，向吸附柱中心的吸附膜上加入50-100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟后，12000转/分离心2分钟，收集溶液到离心管中。

4、聚合酶链式反应

本发明DNA模板采用4尾红鳍东方鲀雄鱼和4尾红鳍东方鲀雌鱼的全基因组DNA，各反应成分的组成如下：

第一轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括：引物F1（浓度10μM）和R1（浓度10μM）各为1μL，dNTP（浓度2.5mM） 1μL，Taq DNA聚合酶（浓度5U/μL）0.5μL，10×Buffe（含Mg²⁺15 μM） 2.5μL，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

第一轮PCR反应条件：预变性95℃ 5min，变性94℃ 60s，退火58℃ 45s，延伸72℃ 45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

第二轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括：引物F1（浓度10μM）和R1（浓度10μM）各为1μL，dNTP（浓度2.5mM） 1μL，Taq DNA聚合酶（浓度5U/μL）0.5μL，10x Buffe（含Mg²⁺ 15 μM） 2.5μL，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

第二轮PCR反应条件：预变性95℃1min，变性94℃60s，退火64℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

5、结果与分析

第一轮和第二轮PCR反应结束后分别采用1%琼脂糖凝胶电泳（110V，20min）将扩增条带进行电泳分离，随后用凝胶成像系统进行检测分析。

第一轮PCR结果显示：M为分子量标记（从下至上的条带依次为100bp、200bp、250bp、500bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大），1、3、5泳道为红鳍东方鲀雌性幼鱼，2、4、6泳道为红鳍东方鲀雄性幼鱼，检测结果如图l所示；所有6个个体均扩增出625bp的性别差异基因条带。

第二轮PCR结果显示：M为分子量标记（从下至上的条带依次为100bp、200bp、250bp、500bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大）；1、3、5、7泳道为红鳍东方鲀雌性幼鱼，2、4、6、8泳道为红鳍东方鲀雄性幼鱼，检测结果如图2所示，只有4个红鳍东方鲀雄性幼鱼个体能够扩增出334bp的清晰条带，而4个红鳍东方鲀雌性幼鱼个体在250bp-500bp范围内无扩增条带。红鳍东方鲀幼鱼8个个体在提取基因组DNA前已经通过性腺组织切片方法对性别进行了鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果与性腺切片鉴定结果完全一致。

本发明所述单碱基突变位点为G-C单核苷酸突变位点，所述G-C单核苷酸突变位点位于红鳍东方鲀Amhr2(anti-Müllerian hormone receptor, type II)基因上的第9个外显子上。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物和方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TAGACACGATGCACACAAACCAC 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CGCAAAATGAGGCTCTCTATGGAG 23

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

GCATCAGATTCCATCTGTTGTGAAGACC 28

Claims

1.一种快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物，其特征在于：所述引物包括扩增性别差异基因序列的上游引物F1、下游引物R1和含有针对单碱基突变位点的错配碱基的下游引物Inner R5，

所述上游引物F1：5’-TAGACACGATGCACACAAACCAC-3’；

所述下游引物R1：5’- CGCAAAATGAGGCTCTCTATGGAG -3’；

所述下游引物Inner R5：5'-GCATCAGATTCCATCTGTTGTGAAGACC-3'。

2.根据权利要求1所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物，其特征在于：所述单碱基突变位点为G-C单核苷酸突变位点。

3.根据权利要求1或2所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的引物，其特征在于：所述G-C单核苷酸突变位点位于红鳍东方鲀Amhr2基因上的第9个外显子上。

4.利用权利要求1所述引物快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，其特征在于它包括以下步骤：采集待测红鳍东方鲀幼鱼样品，提取红鳍东方鲀幼鱼的全基因组DNA；采用所述上游引物F1和下游引物R1进行第一轮PCR扩增，进行电泳检测，呈现625bp条带的为性别差异基因序列；将第一轮PCR产物稀释后作为模板，采用所述上游引物F1和下游引物Inner R5进行第二轮PCR扩增，进行电泳检测，扩增出 334bp条带的为红鳍东方鲀雄性个体，该位置无扩增条带的为红鳍东方鲀雌性个体。

5.根据权利要求4所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，其特征在于：第一轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括浓度10μM的引物F1和引物R1各为1μL，浓度2.5mM 的dNTP 1μL，浓度5U/μL 的Taq DNA聚合酶0.5μL，10×Buffe 2.5μL，Mg²⁺15 μM，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

6.根据权利要求5所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，其特征在于：所述第一轮PCR反应条件为：预变性95℃5min，变性94℃60s，退火58℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

7.根据权利要求4所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，其特征在于：第二轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括浓度10μM的引物F1和引物R1各为1μL，浓度2.5mM 的dNTP 1μL，浓度5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，10x Buffe 2.5μL，Mg²⁺ 15 μM，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

8.根据权利要求7所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，其特征在于：所述第二轮PCR反应条件为：预变性95℃1min，变性94℃60s，退火64℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

9.根据权利要求4所述的快速检测红鳍东方鲀幼鱼性别差异的方法，其特征在于：第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮PCR的模板。