CN104357553B - 一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法，它包括黄颡鱼亲本和子代基因组DNA提取、多态性微卫星标记筛选和引物合成、微卫星位点基因分型及家系鉴定等步骤，本发明采用了6对微卫星引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1－12所示。本发明首次在黄颡鱼上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了98.9％，能快速、高效地鉴别黄颡鱼不同家系，为黄颡鱼的选育和繁殖配组提供了依据。本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，可以用于黄颡鱼的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定，也能够用于分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择。

Description

一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法

技术领域

本发明涉及鱼类遗传育种的分子标记辅助技术，具体涉及一种利用荧光微卫星标记鉴定黄颡鱼家系的方法。

背景技术

黄颡鱼是我国江河、湖泊中的一种重要的经济鱼类，对生态环境适应性较强，广泛分布于我国淡水水体中。因其具有肉质细嫩，营养丰富，含肉率高，除脊刺外没有肌间刺等优点，颇受广大消费者欢迎。近年来，由于商品黄颡鱼主要靠天然捕捞，滥捕现象日益严重。加之湖泊河流受农药、工业废水等污染程度加剧之因素，黄颡鱼自然受到一定程度的破坏，保护黄颡鱼资源及相关的研究势在必行。黄颡鱼繁殖亲本主要是野生捕捞或培养数代的种群，没有经过人工选育,其生长速度、抗病能力和其它养殖性能等还未达到良种化的程度，适应集约化养殖能力较弱。因此，尽快开展黄颡鱼良种选育工作对于黄颡鱼种群保护和满足当前健康养殖业的迫切需要具有极其重要的意义。

在鱼类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。传统的水产动物选择育种中，养殖单位需要对不同的家系进行分养来维持家系信息，所需水体大且不便管理。尤其需要考虑的是，每个分养池之间在环境因子上会存在一些差异，不同的环境因素会使育种相关的遗传参数估计产生偏差。此时可以把不同家系混养在一起,但是需对所有家系进行非常复杂的标记。在混合养殖群体中保持家系信息，大多数畜牧上的研究以物理标记为手段，而物理标记对于水产动物存在操作繁琐、对生长有一定影响及对幼体伤害较大等局限性。此外，黄颡鱼等无鳞鱼类受到物理标记损伤后容易发病而死亡。分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到罗非鱼、大菱鲆、凡纳滨对虾、牙鲆和鳜鱼等水产经济动物育种中。目前，尚未见将微卫星标记应用于黄颡鱼家系鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法，以减少在黄颡鱼群体选育中存在的近亲繁殖现象。

该方法包括以下步骤：

1)黄颡鱼亲本和子代基因组DNA提取

剪取用于构建家系的黄颡鱼亲本的鳍条组织，以及将子代全鱼去头和内脏，采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA，检测质量和浓度后，稀释至100ng/μl；

2)多态性微卫星标记筛选和引物合成

选取6对微卫星引物，按照片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黄色)三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

3)微卫星位点基因分型及家系鉴定

采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤2)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarker V1.5软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，

所述的6对微卫星引物的核苷酸序列分别为：

第1对：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；

第2对：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；

第3对：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；

第4对：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示；

第5对：正向引物如SEQ ID NO.9所示；反向引物如SEQ ID NO.10所示；

第6对：正向引物如SEQ ID NO.11所示；反向引物如SEQ ID NO.12所示；

其中，第1、2、4对为一组，第3、5、6对为另一组；第1、3对采用FAM荧光基团进行修饰；第2、5对采用HEX荧光基团进行修饰；第4、6对采用TAMRA荧光基团进行修饰。

本发明具有以下优点：

1)首次在黄颡鱼上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了98.9％。本发明能快速、有效地鉴别黄颡鱼不同家系，为黄颡鱼的选育和繁殖配组提供了依据。

2)本发明按照微卫星荧光标记的颜色不同进行分组，将每组的3个微卫星位点产物混合在一起上样，比正常PCR检测方法提高了3倍效率，同时节约了成本和时间。

3)本发明可应用于黄颡鱼混养家系的鉴定，在生产中不需要将各家系子代分开饲养，节约了水体和人工管理，降低了成本，同时克服了环境因素所造成的误差，使得亲子鉴定技术可以在生产中大力推广。

4)本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，可以用于黄颡鱼的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定，也能够用于分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细地说明。

1)黄颡鱼家系的建立

从洪湖、洞庭湖、钟祥南湖和长湖四个湖泊中收集野生黄颡鱼亲本进行杂交繁殖，后代F1群体中随机选取雌雄各18尾，进行人工催产繁殖，雌雄配比1:1，建立18个全同胞家系。剪取每个家系亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，并做好家系信息记录，于-20℃保存备用。将18个家系分别放于18个塑料水箱中分养，待鱼苗孵出30天后，从每个家系中随机选取10尾鱼左右，用无水乙醇固定，作为家系鉴定的样本。

2)黄颡鱼亲本和子代基因组DNA提取；

将亲本个体的鳍条组织和子代全鱼去头和内脏分别放于2ml的离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μL的细胞裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mm/L，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM)，在每个管中加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K 9μL，放入60℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解。将离心管冷却至室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却5min，12,000rpm 4℃离心10min，取500ml上清液至新1.5ml离心管。加入600ml异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1-2min，12,000rpm 4℃离心10min，弃去异丙醇。加入70％的酒精洗涤DNA，12,000rpm 4℃离心5min，弃去70％的酒精。加入无水乙醇，12,000rpm 4℃离心5min，弃去无水乙醇，反复几次，室温干燥约30min，加入100μL双蒸水溶解DNA。用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL。

3)多态性微卫星标记筛选和反应体系：

从转录组测序中的微卫星引物进行筛选，最终选择6对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物。在每组微卫星引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰(见表1)，引物在北京擎科新业生物技术有限公司合成。PCR反应体系为10μL：含有3.5μL双蒸水，正、反引物各0.5μl(10μm/L)，5μL MIX酶，0.5μL DNA模板。扩增反应在C1000DNA Engine Thermal Cycler上完成，PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，Ta退火30s，72℃延伸45min，反应进行35个循环；最后72℃再延伸7min。Ta值见表1。

表1.用于黄颡鱼家系鉴定的微卫星引物序列信息和反应条件

其中：F正向引物R反向引物

4)微卫星位点基因分型及亲子鉴定分析

扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarkerV1.5软件读取个体的基因型。采用软件CERVUS 3.0计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，并跟据LOD值鉴定每个家系个体的父母本(见表2)。

5)家系鉴定结果

在模拟分析中(使用CERVUS 3.0)，用18对亲本模拟产生10000个子代，在80％和95％的置信区间范围内亲子鉴定成功率均可达到100％。在实际鉴定的18个家系180个个体中，有2例没有找到真正的母本父本，发生错配。从候选亲本中找到真正父母亲的概率为98.9％，能够满足遗传育种中系谱分析和家系管理的要求。

表2.6个微卫星位点的遗传多样性统计及排除概率

Primer名称	k	HO	HE	PIC	Excl1	Excl2	HW	F(Null)
									20	18	0.907	0.901	0.891	0.337	0.202	NS	-0.0044
147	15	0.897	0.866	0.851	0.421	0.265	NS	-0.0214
									152	13	0.907	0.885	0.872	0.381	0.234	NS	-0.0148
159	15	0.882	0.895	0.883	0.360	0.218	NS	+0.0070
									160	11	0.852	0.865	0.850	0.425	0.268	NS	+0.0079
260	15	0.822	0.877	0.863	0.399	0.248	NS	+0.0292

注：k为等位基因数目，Ho为观察杂合度，HE为期望杂合度，PIC为多态含量，Excl1为双亲未知时排除率，Excl2为已知单亲时排除率，HW为哈迪温伯格平衡检验，NS表示偏离不显著，F(Null)表示无效等位基因频率。

Claims (1)

1.一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

1)黄颡鱼亲本和子代基因组DNA提取

将亲本个体的鳍条组织和子代全鱼去头和内脏分别放于2ml的离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μL的细胞裂解液，在每个管中加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K 9μL，放入60℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解，将离心管冷却至室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却5min，12,000rpm4℃离心10min，取500ml上清液至新1.5ml离心管，加入600ml异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1-2min，12,000rpm 4℃离心10min，弃去异丙醇，加入70％的酒精洗涤DNA，12,000rpm 4℃离心5min，弃去70％的酒精，加入无水乙醇，12,000rpm4℃离心5min，弃去无水乙醇，反复几次，室温干燥30min，加入100μL双蒸水溶解DNA，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL；

2)多态性微卫星标记筛选和引物合成

选取6对微卫星引物，按照片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；

3)微卫星位点基因分型及家系鉴定

采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤2)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarker V1.5软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，

所述的6对微卫星引物的核苷酸序列分别为：

第1对：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；

第2对：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；

第3对：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；

第4对：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示；

第5对：正向引物如SEQ ID NO.9所示；反向引物如SEQ ID NO.10所示；

第6对：正向引物如SEQ ID NO.11所示；反向引物如SEQ ID NO.12所示；

其中，第1、2、4对为一组，第3、5、6对为另一组；第1、3对采用FAM荧光基团进行修饰；第2、5对采用HEX荧光基团进行修饰；第4、6对采用TAMRA荧光基团进行修饰。