CN105603098B - 用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用 - Google Patents

用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有6个引物对，分别为PM‑38、PM‑69、PM‑92、PM‑84、PM‑102和PM‑114，还公开了一种斑节对虾微卫星家系的鉴定方法及上述微卫星标记引物在斑节对虾家系鉴定中的应用。采用本发明中的微卫星标记引物，首次在斑节对虾上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了99％；本发明方法能快速、有效地鉴别斑节对虾不同家系及来源，为斑节对虾的选育，繁殖配组和增殖放流评估提供了依据。

Description

用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法 和应用
技术领域
本发明属于虾类遗传育种的分子标记技术领域，具体涉及一种用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用。
背景技术
斑节对虾(Penaeus monodon)是个体最大的对虾种，广泛分布于印度洋和西太平洋的大部分海区，是世界上最主要的养殖对虾之一，养殖面积和产量均位居世界前列，也是中国南方沿海诸省的重要养殖对象。
斑节对虾养殖种苗大部分是通过人工繁殖得到的，只有少数来自海捕。供人工繁殖的亲虾主要来自两方面：一是捕捞野生怀卵虾，二是通过摘除眼柄和人工诱导野生雌虾性成熟和产卵，但二者均依赖野生资源。近年来也从泰国、马来西亚以及非洲等国家进口亲虾，但来源困难，价格昂贵，且还容易引入病菌。斑节对虾养殖的迅速发展对野生资源造成了极大的压力，大量的近亲繁殖导致种质严重退化；同时，长期依赖野生亲体培育苗种产生了一些弊端，如生长减慢，抗病力下降等问题，严重制约影响了对虾养殖业的持续健康发展。因此培育具有优良性状的斑节对虾新品种已迫在眉睫。
而在虾类遗传育种研究中，苗种的来源比较杂乱，仅采用物理和形态标记难以区分不同来源、不同品质的苗种，因而有必要寻找出特异的分子标记，用以明确个体间亲缘关系，建立正确系谱，这样既有利于优良养殖品种的筛选和推广，也有利于规范我国斑节对虾的苗种市场，可见清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。
通过亲缘关系鉴定，开展家系分析研究可以阐明繁殖成功率，增殖放流幼体扩散等许多有关遗传学方面和繁殖生态学的科学问题。以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到扇贝、太平洋牡蛎、耳鲍、凡纳滨对虾、中国对虾、牙鲆等水产经济动物育种中。
目前，关于将微卫星标记应用于斑节对虾家系鉴定研究的报道甚少。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，该引物多态性高，微卫星位点等位基因数目多，多态性高，PCR产物稳定可靠。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种利用上述微卫星标记引物进行斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，该方法易于同时分型检测，可以用于斑节对虾的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。
本发明所要解决的最后一个技术问题是提供一种利用上述用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在斑节对虾家系鉴定中的应用。
本发明所要解决的第一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有6个引物对，分别为PM-38、PM-69、PM-92、PM-84、PM-102和PM-114，其中：
引物对PM-38的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中所示；
引物对PM-69的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中所示；
引物对PM-92的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中所示；
引物对PM-84的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所示；
引物对PM-102的核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中所示；
引物对PM-114的核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中所示。
本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)斑节对虾亲本及子代DNA提取：选取斑节对虾作为亲本进行全同胞家系繁殖，繁殖后选取亲本及子代肌肉组织，采用Magen动物DNA提取试剂盒提取，获得斑节对虾亲本及子代的DNA作为模板待用；
(2)微卫星标记引物荧光修饰：选取权利要求1中的6个引物对，分成2组，其中PM-38、PM-69和PM-92为一组，PM-84、PM-102和PM-114为一组，在每组引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX和TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；
(3)荧光PCR：采用荧光PCR反应利用步骤(2)中荧光基团修饰过的6个引物对分别对步骤(1)中的亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品；
(4)斑节对虾微卫星家系鉴定：将上机待测样品采用基因分析仪进行分析，读取每个样品的基因型，对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，获得斑节对虾的微卫星家系。
在上述斑节对虾微卫星家系的鉴定方法中：
步骤(3)中荧光PCR反应时，20μL反应体系优选包括15.2μL双蒸水，2μL10×PCR缓冲液，浓度为10μm/L的正、反引物各0.6μL，浓度为10mm/L的dNTP 0.3μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.3μL，1μL DNA模板。
步骤(3)中荧光PCR反应时，优选95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环，最后72℃再延伸10min。
步骤(4)中优选采用软件CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
采用软件CERVUS3.0可计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率等信息，从而判定子代个体的父母本。
进一步的，本发明提供的一种斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)斑节对虾DNA提取
选取健康发育良好的斑节对虾作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取亲本及子代肌肉组织样品放于无水乙醇中，采用Magen动物DNA提取试剂盒来操作，检测质量和浓度后，稀释至100ng/μL，存放于-20℃保存备用；
(2)多态性微卫星标记筛选和引物合成
选取6对微卫星引物，按照片段大小分成2组，其中，引物PM-38，PM-69，PM-92，为一组，引物PM-84，PM-102，PM-114，为一组；在正向引物5’端分别用FAM，HEX，TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；
(3)荧光PCR
采用荧光PCR反应对亲本和子代DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行对应的PCR产物混合，作为上机检测的样品；
(4)微卫星位点基因分型以及斑节对虾微卫星家系鉴定
待测样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMapperV 3.2软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在斑节对虾家系鉴定中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)采用本发明中的引物，首次在斑节对虾上利用荧光标记的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了99％；
(2)本发明方法能快速、有效地鉴别斑节对虾不同家系及来源，为斑节对虾的选育，繁殖配组和增殖放流评估提供了依据；
(3)本发明按照微卫星引物扩增片段大小和荧光标记的颜色不同进行组合，将3个微卫星位点PCR产物混合在一起上样检测，比普通PCR检测方法提高了3倍效率，同时节约了成本和时间；
(4)本发明选择的微卫星引物的位点等位基因数目较多，多态性高，可以用于斑节对虾的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。
具体实施方式
以下结合具体实施方法对本发明进行详细说明。
实施例1用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物的筛选与合成
从斑节对虾转录组文库中挑选含有微卫星标记的序列来设计引物，通过转录组测序筛选到含有斑节对虾微卫星重复序列的unigene，然后从斑节对虾转录组文库将其中检测到含有微卫星位点的序列设计微卫星特异性引物，检测其多态性，经过筛选之后最终选择了6对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。
本发明中选择的微卫星标记引物多态性丰富、片段大小间隔适宜且标记间不连锁，易于同时分型检测，可以用于斑节对虾的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。
表1用于斑节对虾家系鉴定的微卫星引物信息
引物编号 正向序列(5’-3’) 反向序列(5’-3’ 重复碱基 退火温度℃ 修饰荧光
PM-38 TCAGCAGCAGTGTTATTCAGA CAGTGCTAGTGCGTCGAATC (CT)43 56 FAM
PM-69 TCCTCTTCTCTTCCCTTCCC AGAGTGTTATCGTCCCCGTG (TC)14 56 HEX
PM-84 TGTTGACTTTGTTCCCGAAA TGTTCCATCTACGCAAACCA (AT)13 56 HEX
PM-92 ATGACCAAAGAGGTTCCTTTCAT TAGTGGTGGTGATGTTGGGATTA (GA)12 56 TAMRA
PM-102 TCATGAATCGATAACTAACTGGAGA ATTAGCGTCGCTTCATCTAACAA (AAT)13 56 FAM
PM-114 GGGAGCGATGTAACCTGTGT CCTCTGACATGCATCTCCACT (AGG)8 56 TAMRA
实施例2斑节对虾微卫星家系的鉴定方法
(一)斑节对虾亲本及子代DNA提取
(1)斑节对虾家系的建立
选育斑节对虾新品种"南海1号"和泰国野生群体中挑选雌雄各10个，进行人工繁殖，雌雄配比1:1，建立10个全同胞家系，剪取每个家系亲本的肌肉组织放于无水乙醇中，并做好家系信息记录，于-20℃保存，将10个家系分别放在不同的水池养殖，待半年之后，从每个家系中随机选取10只虾，取其肌肉用无水乙醇固定，作为家系鉴定的样本。
(2)斑节对虾亲本和子代基因组DNA的提取
采用Magen动物组织DNA提取试剂盒，把20-50mg组织样品处理成尽量小的碎片，并转移至1.5mL离心管中。加入550μL Buffer MTL和20μL蛋白酶K，涡旋混匀。55℃振荡温育3h或过夜消化样品。加入5μL RNase Solution至消化液中，颠倒混匀。室温静置30-60min消化RNA。13000xg离心3min。转移上清液至新的2.0mL离心管中。加入500μL Buffer DL至消化液中，涡旋混匀20s，70℃水浴10min。加入500μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀20s。把HipuregDNA Mini Column装在2mL收集管中。转移混合液至柱子中，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，加入500μL Buffer GW1至柱子上，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，加入650μL Buffer GW2至柱子上，10000xg离心1min。倒出流出液，把柱子重新装回收集管中，10000xg离心2min。将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入30-200μL预热至55℃Buffer AE至柱子的膜中央。放置2min，10000xg离心1min。丢弃DNA结合柱，用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL，把DNA保存-20℃备用。
(二)微卫星标记引物荧光修饰
选取实施例1中的6个引物对，分成2组，其中PM-38、PM-69和PM-92为一组，PM-84、PM-102和PM-114为一组，在每组引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX和TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，具体如表1中所示，用于PCR分析。
采用荧光PCR反应利用上述荧光基团修饰过的6个引物对分别对上述亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照上述分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品。
PCR反应体系为20μL：含有15.2μL双蒸水，2μL 10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μm/L)，dNTP 0.3μL(10mm/L)，0.3μL Taq酶(5U/μL)，1μL DNA模板。
扩增反应PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环；最后72℃再延伸10min。
(三)微卫星位点基因分型及家系鉴定
(1)微卫星位点基因分型
扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作为内参，用GeneMapper V 3.2软件读取个体的基因型。
采用软件CERVUS3.0计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率(见表2)。
表2 6个微卫星位点引物的遗传多样性统计及排除概率
注：k为等位基因数目，Ho为观察杂合度，HE为期望杂合度，PIC为多态含量，Excl1为双亲未知时排除率，Excl2为已知单亲时排除率，HW为哈迪温伯格平衡检验，ND表示未做检验，***表示偏离极显著，NS表示偏离不显著，F(Null)表示无效等位基因频率。
(2)家系鉴定结果
在模拟分析中(使用CERVUS3.0)，用10对亲本模拟产生10000个子代，在80％和95％的置信区间范围内亲子鉴定成功率均可达到99％。
在实际鉴定的10个家系100个个体中，有1例没有找到真正的父本，母本都能成功找到，从候选亲本中找到真正父母亲的概率分别为99％、100％，总体鉴定成功率为99％，能够满足遗传育种中系谱分析和增殖放流评估的要求。
显然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。

Claims (6)

1.一种用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，其特征是：所述微卫星标记引物共有6个引物对，分别为PM-38、PM-69、PM-92、PM-84、PM-102和PM-114，其中：
引物对PM-38的核苷酸序列如SEQ ID NO ：1和SEQ ID NO ：2中所示；
引物对PM-69的核苷酸序列如SEQ ID NO ：3和SEQ ID NO ：4中所示；
引物对PM-92的核苷酸序列如SEQ ID NO ：5和SEQ ID NO ：6中所示；
引物对PM-84的核苷酸序列如SEQ ID NO ：7和SEQ ID NO ：8中所示；
引物对PM-102的核苷酸序列如SEQ ID NO ：9和SEQ ID NO ：10中所示；
引物对PM-114的核苷酸序列如SEQ ID NO ：11和SEQ ID NO ：12中所示。
2.一种斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，其特征是包括以下步骤：
（1）斑节对虾亲本及子代DNA提取：选取斑节对虾作为亲本进行全同胞家系繁殖，繁殖后选取亲本及子代肌肉组织，采用Magen动物DNA提取试剂盒提取，获得斑节对虾亲本及子代的DNA作为模板待用；
（2）微卫星标记引物荧光修饰：选取权利要求1中的6个引物对，分成2组，其中PM-38、PM-69和PM-92为一组，PM-84、PM-102和PM-114为一组，在每组引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX和TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；
（3）荧光PCR：采用荧光PCR反应利用步骤（2）中荧光基团修饰过的6个引物对分别对步骤（1）中的亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照步骤（2）中分组的方法进行混合，混合物作为上机待测样品；
（4）斑节对虾微卫星家系鉴定：将上机待测样品采用基因分析仪进行分析，读取每个样品的基因型，对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，获得斑节对虾的微卫星家系。
3.根据权利要求2所述的斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，其特征是：步骤（3）中荧光PCR反应时，20μL反应体系包括15.2 μL双蒸水，2 μL 10×PCR缓冲液，浓度为10 μm/L的正、反引物各0.6 μL，浓度为10 mm/L 的dNTP 0.3 μL，浓度为5 U/μL 的Taq酶0.3 μL ，1μLDNA模板。
4.根据权利要求2所述的斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，其特征是：步骤（3）中荧光PCR反应时，95℃预变性5 min，95 °C变性30 s，56°C退火30 s，72℃延伸30 s，反应进行30个循环，最后72℃再延伸10 min。
5.根据权利要求2所述的斑节对虾微卫星家系的鉴定方法，其特征是：步骤（4）中采用CERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
6.权利要求1所述的用于斑节对虾微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在斑节对虾家系鉴定中的应用。
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