CN110295238A - 一种马氏珠母贝生长性状相关的osr1基因snp分子标记及其应用 - Google Patents
一种马氏珠母贝生长性状相关的osr1基因snp分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记及应用,属于分子标记辅助育种技术领域;该位点对应于马氏珠母贝锌脂蛋白OSR1基因位点,此处碱基为A或G。本发明SNP标记与马氏珠母贝生长性状(壳高、壳宽与壳重)显著关联,是一个新的分子标记,通过确定待测马氏珠母贝SNP位点基因型,从而对马氏珠母贝生长性状进行早期选育,缩短育种周期,提高遗传进展,节省生产成本,具有明显的经济效益与社会效益。
Description
技术领域
本发明公开了一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记及其应用,属于分子标记辅助育种技术领域。
背景技术
马氏珠母贝Pinctadafucata martensii是我国生产海水有核珍珠的主要贝类。近年来,养殖群体性状退化、海区环境污染与自然灾害等导致了马氏珠母贝海水珍珠质量与产量明显下降。尽管海水珍珠产业链中的品种培育、苗种培育与养殖技术等多个生产环节均存在问题,培育适合当地海区养殖新品种,改良养殖群体的生长与育珠性状,这是解决产业困境的首要任务。目前各科研单位利用传统育种技术已经培育了马氏珠母贝“海优1号”、“南科1号”、“南珍1号”与“海选1号”养殖新品种。尽管马氏珠母贝传统育种取得了较大进展,但这些大都基于对表型性状的选择。表型性状由基因与环境共同决定,环境干扰常常影响选择效果,降低选择的准确性。借鉴作物与畜禽育种技术,发展分子标记辅助育种技术。马氏珠母贝生长性状属于数量性状,由多基因控制,寻找对生长性状具有较大遗传贡献率的基因或分子标记,这是开展分子标记辅助育种的前提条件。
锌指蛋白基因OSR是间介中胚层最早发现的标记基因,并通过多种调控机制参与胚胎的发育。在哺乳动物中,存在两种OSR基因(OSR1和OSR2),在小鼠胚胎发育过程中,均被检测到,并且在间介中胚层,肾脏和四肢发育过程中广泛存在,说明其在这些发育事件中发挥重要作用。目前,关于OSR1的研究多在胚胎发育以及肿瘤研究领域,其研究在无脊椎动物尤其是在软体动物方面鲜有报道;全组织荧光定量结果显示OSR1在所有组织中均有表达,表明其可在多种组织中起调节作用。
发明内容
本发明提供了一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记及其应用,可通过确定待测马氏珠母贝SNP位点的基因型,从而对马氏珠母贝生长性状(壳高、壳长、壳宽与壳重)进行早期选育,不会受到马氏珠母贝贝龄限制,可有效用于马氏珠母贝的早期选育,缩短选育进程。
本发明所采取的技术方案是:
一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记,所述的SNP标记位于马氏珠母贝OSR1基因A9172G位点,此处碱基为A或G;
所述SNP分子标记在马氏珠母贝早期选育中的应用;
一种马氏珠母贝壳型性状早期选育的方法,根据马氏珠母贝OSR1基因A9172G位点基因型对马氏珠母贝生长性状进行早期选育,包括如下步骤:
(1)提取待测马氏珠母贝的基因组DNA;
(2)设计特异性扩增含有马氏珠母贝OSR1基因A9172G位点的基因片段的引物对;
(3)以步骤(2)设计的引物对马氏珠母贝基因组DNA进行PCR扩增,检测扩增所得基因片段的SNP位点的基因型;
(4)基于SNP位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育;
所述的PCR扩增引物序列为:
步骤(1)所述的提取待测马氏珠母贝的基因组DNA的步骤如下:使用试剂盒提取基因组DNA,具体步骤包括:
(1)取0.05g闭壳肌,放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管;
(2)剪碎肌肉组织,加入4μL100mg/mL核糖核酸酶A溶液,振荡15sec,室温放置5min;
(3)加入20μL 20mg/mL蛋白酶K溶液,涡旋混匀,简短离心,56℃放置3h,每小时振荡混合样品2-3次,每次振荡混匀15sec;
(4)加入200μL缓冲液,充分颠倒混匀,70℃放置10min,离心;
(5)加人200μL无水乙醇,充分颠倒混匀,简短离心;
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中;
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中;
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中;
(9)重复操作步骤7;
(10)将吸附柱放回收集管中,12,000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置10分钟;
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液,室温放置5min,12,000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
本发明的优点:本发明提供了一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记及其应用,所述SNP分子标记位于马氏珠母贝OSR1基因A9172G位点,此处碱基为A或G。所述的马氏珠母贝OSR1基因核苷酸序列自启动子9172位碱基AG与马氏珠母贝的生长性状显著相关,即马氏珠母贝OSR1基因A9172G位点的SNP标记与马氏珠母贝生长性状(壳长、壳高、壳宽与体重)相关,通过确定待测个体SNP位点基因型,筛选目标基因型,从而可以对马氏珠母贝生长性状进行早期选育。这样可以增加选择的准确性,缩短育种周期,减少生产成本。
附图说明
图1马氏珠母贝OSR1基因部分片段的PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述,这些实施例仅用于说明本发明,并不限制发明的保护范围。试验用的马氏珠母贝来源于利用涠洲岛野生繁育的基础群体。
实施例1
一、基因组DNA提取
使用TIANGEN的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,具体步骤包括:
(1)取0.05g闭壳肌,放入装有200μL GA缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管;
(2)剪碎肌肉组织,加入4μL核糖核酸酶A(100mg/mL)溶液,振荡15sec,室温放置5min;
(3)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液,涡旋混匀,简短离心,56℃放置3h,每小时振荡混合样品2-3次,每次振荡混匀15sec;
(4)加入200μL缓冲液,充分颠倒混匀,70℃放置10min,简短离心;
(5)加人200μL无水乙醇,充分颠倒混匀,简短离心;
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中;
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中;
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中;
(9)重复操作步骤7;
(10)将吸附柱放回收集管中,12,000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱置于室温放置10分钟;
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液,室温放置5min,12,000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中;
二、SNP分子标记的检测
1.引物设计
设计特异性扩增含有马氏珠母贝OSR1基因A9172G位点的基因片段的引物对。基于OSR1基因序列,利用软件Primer5.0设计特异性扩增引物,所扩增引物序列为:
2.扩增与检测
以设计的引物序列对样品的DNA进行扩增,检测扩增所得到的基因片段的SNP位点的基因型;
反应扩增体系15μL:包括0.2μL DNA聚合酶(5U/μL)、1.5μL10×聚合酶链式反应(PCR)缓冲液、1.2μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合液(各2.5mM)、0.4μL氯化镁MgCl2(25mM)、上下游外引物各0.3μL、上下游内引物各1.5μL、双蒸水6.6μL,程序设定为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1:10min,共35个循环,72℃延伸10min,4℃恒温保存。
三、SNP位点基因型与性状关联分析
利用t检验比较各基因型生长性状平均值差异,显著性水平设为P<0.05。
其SNP位点的基因频率及生长性状的关联分析如下表1所示。
表1SNP位点基因频率及生长性状的关联分析
由表1可知,该SNP位点为GG基因型的个体的性状均值(壳高、壳宽与体重)显著大于AA和AG基因型。该核苷酸序列自启动子9172碱基A或G与马氏珠母贝生长性状显著相关。
上述实施例为本发明的优选实施例,凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化,均应属于本发明的保护范畴。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccacaaaat gacagtcgga ata 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtatgac ccctccccct gtt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggggaggg gtcatactct atg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtctgtgtg tgtcctctcg tg 22
Claims (6)
1.一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记,其特征在于:所述的SNP分子标记位于马氏珠母贝锌脂蛋白OSR1基因的A9172G位点,此处碱基为A或G。
2.一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记的应用,其特征在于:权利要求1所述的SNP分子标记应用于马氏珠母贝早期选育。
3.根据权利要求2所述的一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记的应用,其特征在于:SNP分子标记位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
4.根据权利要求3所述一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记的应用,其特征在于:包括如下步骤:
(1)提取待测马氏珠母贝的基因组DNA;
(2)设计特异性扩增含有马氏珠母贝OSR1基因9172位点的基因片段的引物对;
(3)以步骤(2)设计的引物对马氏珠母贝基因组DNA进行PCR扩增,检测扩增所得基因片段的SNP位点的基因型;
(4)基于SNP位点的基因型对马氏珠母贝壳型性状进行早期选育。
5.根据权利要求4所述一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记的应用,其特征在于:所述PCR扩增的引物对的序列如SEQ ID。
6.根据权利要求4所述一种马氏珠母贝生长性状相关的OSR1基因SNP分子标记的应用,其特征在于:步骤(1)所述的提取待测马氏珠母贝的基因组DNA的步骤如下:使用试剂盒提取基因组DNA,具体步骤包括:
(1)取0.05g闭壳肌,放入装有200μL缓冲液的高压灭菌过的1.5mL离心管;
(2)剪碎肌肉组织,加入4μL100mg/mL核糖核酸酶A溶液,振荡15sec,室温放置5min;
(3)加入20μL 20mg/mL蛋白酶K溶液,涡旋混匀,简短离心,56℃放置3h,每小时振荡混合样品2-3次,每次振荡混匀15sec;
(4)加入200μL缓冲液,充分颠倒混匀,70℃放置10min,离心;
(5)加人200μL无水乙醇,充分颠倒混匀,简短离心;
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中;
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中;
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液,12,000rpm离心30sec,倒掉废液,将吸附柱放入收集管中;
(9)重复操作步骤7;
(10)将吸附柱放回收集管中,12,000rpm离心2min,倒掉废液,将吸附柱CB3置于室温放置10分钟;
(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液,室温放置5min,12,000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中。
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