CN106086195A - 一个与石斑鱼生长速度相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SNP标记及其应用。其中，该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第501位碱基A或C。本发明的SNP标记与斜带石斑鱼的生长速度紧密相关，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种。

Description

一个与石斑鱼生长速度相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、试剂盒在斜带石斑鱼选育中的用途，以及检测斜带石斑鱼生长速度的方法。

背景技术

石斑鱼是名贵的海水经济鱼类。近十多年来，石斑鱼人工繁育技术已相对成熟，石斑鱼的养殖规模也逐渐扩大，石斑鱼产业的迅速发展，对于促进渔民增收，满足国民水产品需求，优化水产养殖业结构有重要意义。但是，种质退化，优良品种缺乏是石斑鱼产业可持续健康发展的主要瓶颈。因此，培育石斑鱼优良新品种已成为我国石斑鱼产业发展的关键。

传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种中的作用将日益突出。在石斑鱼的育种中，人们希望通过对于生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得更大的遗传进展。

然而，现阶段能够有效用于石斑鱼育种的生长性状相关的分子标记仍有待挖掘。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种与石斑鱼生长性状相关，能够有效用于石斑鱼选育的SNP标记。

其中，需要说明的是，SNP(single nucleotide polymorphism,SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记。根据本发明的实施例，该SNP标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列(全长1001bp)自5’端起第501位碱基以Y表示，Y代表A或C。根据本发明的实施例，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列如下：

TAGTGTTGAGGAGGAGGACACGTTCCCGTCAGTAATTCGATTATCCCAGTTGCATGTAAACTGGGACAAGGACCGAAGTCCGATTAGACGGCAAAATCGAATTTTGAGCATAGCTCGATTAAGCTGTGCATGTAAACGTACTGTATGTGTCAGCCCTGTGATGGTCTGGTGACCTGTCCAGGGACACGTTGCCAGCTGGGTAGGCTCCAACCATCCCACGACCCTGAACAAGATAGGTGATTAAGGAAAATTAATGAATGAAAGATTAATTAAAATCATTGTTTTTGTGAGCGGAATCTGAAGCTTTGGAATGGTAGTCCATAAACCAGAAGGTGACATCACTGTGGCTGTGTCCATGGTGACTAGCTTTGTCTGCCCCAAATATGGAACTTTTTTTTTTGGTACCCTAGCGTTCCCCCTGCTCTCAGTCTTTATGCTAAGCTAGCAGTCTCCTGGCTCCAGCTTTATATTTACAGAGTGGTTCTGACCTTTCCATTTCAYTCTCGACCAGAAAAAGAATAAGTGTGTTTTCTTTAAATGTCAACGAGGTTCCCACTAAAAATAATTTTACAACAAACAGCGGCCCTTTGTTCACGTCAGTGAAAGTTGCTTTAACAAGGATTTAAAAACCTGTGATATAAAAGACTTTTATATGCTACATATTTATCATTTGGCACCTCTTTTATCTGGCCTCACATTGAGTGGCCATATGTTTCCAACACCAGTGTCAGGCCACAGATGACCCCTATGGATTCTGCCGTTGCTGTGTAAGAAGCTTTGTGGCGCCCCACTTCTTCAGCCCTCGCTGACATACACACGCCCAGTCAACTGACAGGCCTGTGAATGTGTCCATGCTAGCTACATGTCCCAGTGGCACTGTGCTAAATATCACCTCCTCTTCCTCACTTACAATAGCTTCTAAATGAGGTCTGTCAAAGCCAACGAGACAATGTGGAGAATACTCACATCTCTGTGCGAGATTAATTACTTTCCCCCGCAAT(SEQ ID NO：1)。

发明人发现，该位点处基因型为杂合AC的斜带石斑鱼的体重显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼。进而，根据本发明的实施例，通过检测斜带石斑鱼的上述SNP，能够有效地确定其生长速度，具体地，如前所述，该SNP位点为杂合AC的斜带石斑鱼的体重显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼，例如该SNP位点的基因型为AC时，则能够确定待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此，发明人确定，本发明的SNP标记与斜带石斑鱼的生长速度紧密相关，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求选择生长速度对斜带石斑鱼育种材料进行早期选择，进一步能够有效提高育种的效率和准确性，提高斜带石斑鱼繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出斜带石斑鱼优良品种。此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的SNP标记进行斜带石斑鱼分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的SNP标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物对具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列。具体地，本发明的引物对的序列如下所示：

上游引物：5’-TTGTGAGCGGAATCTGAAGC-3’(SEQ ID NO：2)；

下游引物：5’-TTTAGTGGGAACCTCGTTGAC-3’(SEQ ID NO：3)。

根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测斜带石斑鱼的上述与生长速度相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对该SNP标记的检测，确定待测斜带石斑鱼该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测斜带石斑鱼的生长速度。具体地，该SNP标记位点处基因型为杂合AC的斜带石斑鱼的生长速度显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼，例如该SNP位点的基因型为AC时，则能够确定待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此，用于检测前面所述的本发明的SNP标记的引物对，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的SNP标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的SNP标记的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测斜带石斑鱼的上述与生长速度相关的SNP标记的多态性检测，确定待测斜带石斑鱼该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测斜带石斑鱼的生长速度。具体地，该SNP标记位点处基因型为杂合AC的斜带石斑鱼的生长速度显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼，例如该SNP位点的基因型为AC时，则能够确定待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的SNP标记的试剂盒，能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的SNP标记、引物对或试剂盒，在斜带石斑鱼选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待测斜带石斑鱼的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测斜带石斑鱼的生长速度，从而能够有效辅助斜带石斑鱼选育。

进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测斜带石斑鱼生长速度的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测斜带石斑鱼进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的生长速度。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记的试剂例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测斜带石斑鱼进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测斜带石斑鱼的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测斜带石斑鱼的生长速度。其中，如前所述，该SNP标记位点处基因型为杂合AC的斜带石斑鱼的生长速度显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼，例如当该SNP位点的基因型为AC时，则待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。由此，本发明的检测斜带石斑鱼生长速度的方法，能够快速、高效、准确地检测斜带石斑鱼生长速度，进而能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。

另外，根据本发明上述实施例的检测斜带石斑鱼生长速度的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，对待测斜带石斑鱼进行SNP标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformationpolymorphism，PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriTCionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增200-1000bp的产物，再通过测序即可直接检测SNP位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行SNP标记检测。根据本发明的一些具体示例，通过对待测斜带石斑鱼进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的生长速度，进一步包括：提取待测斜带石斑鱼的基因组DNA；利用前面所述的引物对，将所述待测斜带石斑鱼的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型；以及基于所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型，确定所述待测斜带石斑鱼的生长速度。由此，能够有效提高检测斜带石斑鱼生长速度的效率。

根据本发明的实施例，提取待测斜带石斑鱼的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用常规酚氯仿方法抽提待测斜带石斑鱼的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。

根据本发明的实施例，将所述待测斜带石斑鱼的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，该PCR扩增的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl的模板DNA 1μl，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3所示的上下游引物各1μl，10mmol/L的dNTPmix 2.0μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的SNP标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。

根据本发明的实施例，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序方法的至少一种对所述PCR扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。

根据本发明的实施例，基于测序结果，通过比对石斑鱼参考基因组序列，能够有效确定待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型为AC还是CC。

根据本发明的实施例，所述SNP标记的AC基因型个体的生长速度显著高于CC基因型个体。即本发明前面所述的SNP标记与斜带石斑鱼的生长速度紧密相关。由此，基于确定的待测斜带石斑鱼的该SNP标记的基因型，能够准确有效地确定待测斜带石斑鱼的生长速度即生长速度性状，例如该SNP位点的基因型为AC时，则待测斜带石斑鱼的属于生长速度快的个体。进而本发明的方法能够有效用于斜带石斑鱼的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育斜带石斑鱼优良品种。

需要说明的是，本发明的与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的SNP标记不受斜带石斑鱼的年龄、性别等限制，可用于斜带石斑鱼的早期选育，可显著促进斜带石斑鱼的育种进程；

(2)检测斜带石斑鱼如SEQ ID NO.1所示自5’端起第501位SNP位点的方法，准确可靠，操作方便；

(3)斜带石斑鱼如SEQ ID NO.1所示自5’端起第501位的SNP位点的检出，为斜带石斑鱼生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记的获得

1.1斜带石斑鱼群体的获得

所采用的群体为海南某石斑鱼养殖场2010年11月10日孵化的斜带石斑鱼，亲本为29条野生雄鱼和12条野生雌鱼(捕获于于海南三亚的南海海域)，2010年12月10日，15,000尾鱼苗被转移至一个网箱继续饲养。2011年8月8日，从该网箱随机选出198个个体，剪取鱼体背鳍鳍条于95％乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取。

1.2斜带石斑鱼基因组DNA提取

本试验采用常规酚氯仿方法抽提斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取0.3～0.5g鳍条于1.5ml Eppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥20min；

(2)待乙醇基本挥发后，TE缓冲液(10mmol/ml Tris、1mmol/ml EDTA、SDS 5％，pH＝8.0)洗涤1～2次，再加入600μl DNA抽提液(0.001mol/L Tris-Cl、0.1mol/L EDTA、SDS5％，pH＝8.0)和3μl蛋白酶k(200mg/ml)，55℃水浴消化3h左右，前30min每10min轻摇离心管1次，消化至管内液体澄清；

(3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)600μl，轻轻来回颠倒离心管10min，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相之间没有白色沉淀；

(4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，4℃静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70％乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μl无菌水溶解。4℃保存备用或-20℃长期保存。

1.3构建简化基因组测序(Restriction site Associated DNA sequencing，RAD-seq)文库并测序获得斜带石斑鱼体重相关的SNP标记

基于Hiseq2000高通量测序平台，采用RAD简化基因组测序方法对198个个体的DNA样本进行测序，产生0.4G左右的数据量，平均覆盖0.4X的斜带石斑鱼基因组。同时还对这198个个体进行体重等生长性状表型鉴定。采用PLINK软件对数据进行处理筛选处理，然后使用基于混合线性模型的EMMAX软件进行GWAS分析，从261,366个SNP中找到了一个与体重显著相关的SNP位点。该SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的501bp位点处，在SEQ ID NO.1序列中用Y表示该处位点，且此处位点的碱基为A或C。该位点处基因型为杂合AC的斜带石斑鱼的体重显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼。

实施例2与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记的测序验证与应用

2.1提取待测斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA

待测斜带石斑鱼来自实施例1中的斜带石斑鱼群体，随机选取198尾鱼，按照实施例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。

2.2扩增含SNP位点的核苷酸片段

以前述提取获得的各待测斜带石斑鱼的基因组DNA为模板，利用正向引物F：5’-TTGTGAGCGGAATCTGAAGC-3’(SEQ ID NO：2)和反向引物R：5’-TTTAGTGGGAACCTCGTTGAC-3’(SEQ ID NO：3)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。其中，PCR反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。

2.3测序识别SNP位点基因型

将上述步骤中获得的各PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQID NO：1序列中501bp处(即本发明的SNP标记)的基因型。其中，198个待测斜带石斑鱼个体该SNP位点的基因型及其体重如下表1所示。

表1 198个个体该SNP位点的基因型及其体重

2.4 SNP位点基因型与生长速度的关联分析

基于表1的结果，利用SAS9.0软件Mixed程序进行线性模拟分析SNP位点的基因型与生长速度的关联性，其中分析时以个体体重代表表型值，采用的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_i+a_j+e_ijk。

其中，Y_ijk为个体体重值，μ群体体重均值，G_i为基因型效应向量，a_j为微效多基因向量，e_ijk为随机残差效应向量。

SNP位点的基因型与生长速度的关联分析结果见下表2。

表2 SNP位点的基因型频率及与体重的关联分析

由表2可知，AC杂合型个体体重均值比CC纯合型个体体重均值大。

表2所示的关联分析结果表明，CC基因型个体体重均值与AC基因型个体体重均值的差异达极显著性水平(P<0.01)。进而，证明SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第501位碱基A或C，与斜带石斑鱼生长速度显著相关，为斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记，该SNP标记的AC基因型个体的生长速度显著高于CC基因型个体。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的序列如SEQID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第501位碱基是A或C。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的AC基因型个体的生长速度显著高于CC基因型个体。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列。

4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含：权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在斜带石斑鱼选育中的用途。

6.一种检测斜带石斑鱼生长速度的方法，其特征在于，通过对待测斜带石斑鱼进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的生长速度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过对待测斜带石斑鱼进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测斜带石斑鱼的生长速度，进一步包括：

提取待测斜带石斑鱼的基因组DNA；

利用权利要求3所述的引物对，将所述待测斜带石斑鱼的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

基于所述测序结果，确定所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型；以及

基于所述待测斜带石斑鱼的所述SNP标记的基因型，确定所述待测斜带石斑鱼的生长速度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP标记的AC基因型个体的生长速度显著高于CC基因型个体。