CN101845487A - 一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，涉及一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法，利用仿刺参ESTs序列和微卫星检索软件进行微卫星位点查找，对二碱基大于7次、三碱基大于5次、四碱基大于5次、五碱基大于3次和六碱基大于3次重复的微卫星片段分离，得到含有微卫星重复序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，优化成为微卫星标记；再在扩增过程中重复性、稳定性和多态性信息含量值进行评价，得标准微卫星标记评价体系；其设计原理安全可靠，标记方法简单易行，对仿刺参筛选和进行微卫星标记效果好，应用前景广阔，社会经济效益明显。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，涉及一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法。
背景技术：
仿刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门(Echinodermata)、游移亚门(Eleutherzoa)、海参纲(Holothuroidea)、盾手目(Aspidochirota)、仿刺参科(Stichopodidae)、仿刺参属(Apostichopus)，俗称刺参。仿刺参产于我国北方沿海，在日本、韩国沿海以及俄罗斯南部沿海均有分布。仿刺参肉质细嫩，味道鲜美，具有很高的食用价值和独特的药用价值，是我国北方重要的海水养殖对象。在人类及动植物的基因组中，存在着由1-6个碱基对组成的简单重复序列(Simple Sequence Repeats)，简称SSRs，又称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)。随着分子标记技术的不断发展和完善，微卫星标记已经成为国际上主流的标记技术之一。由于微卫星标记具有随机分布在整个基因组中，多态性高、稳定性好、特异性高、共显性遗传、检测快捷，引物序列公开发表，易于在各个实验室之间共用等诸多优点，因此，广泛应用于遗传疾病的诊断、遗传连锁图谱的构建、基因的定位与克隆、亲权分析、群体遗传多样性研究、种质鉴定、进化生物学研究等领域。
遗传多样性是种质资源评价中最为重要的指标之一。遗传多样性，也称基因多样性，是指种内不同群体之间或一个群体内不同个体之间遗传变异的总和。遗传多样性不但是生物多样性的重要组成部分，而且是物种多样性和生态系统多样性的基础。一般认为，遗传多样性的大小及其群体遗传结构跟一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力密切相关，与生物多样性的形成、消失和发展息息相关。因此，研究生物的遗传多样性对保护、开发及持续利用生物种质资源十分重要。在人工放养、放流过程中，由于人为或自然原因造成的逃逸个体很容易进入自然群体从而对其遗传结构、遗传多样性及种质资源产生极大的影响。如何采取措施，在进行养殖的过程中充分保护遗传多样性的稳定是目前海水养殖业需要解决的问题。因此，构建一种仿刺参标准微卫星标记的方法，建立一个适用的分子标记种质资源评价体系，应用于随时监测和评价种质资源，利用DNA分子标记技术进行种质分析，对仿刺参资源保护、持续利用和品牌战略具有重要的现实意义和应用前景。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法，应用于仿刺参的筛选和标记并进行综合评价。
本发明利用GenBank公布的仿刺参ESTs序列，应用微卫星检索软件RepeatReporter 1.5进行微卫星位点的查找，对二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于5次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星片段进行快速分离，从而得到含有微卫星重复的序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，进一步优化引物成为微卫星标记；对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，得到11个标准微卫星标记评价体系(表1)，用于仿刺参种质及群体遗传学分析；然后进一步选取不同养殖条件下的仿刺参对筛选成功的微卫星标记进行综合评价。
本发明的标记步骤包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和标准微卫星位点的确定四个具体步骤：
(1)微卫星位点来源：
利用微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5对GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行微卫星DNA的查找，对二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于5次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星片段进行快速分离，从而得到含有微卫星重复的序列，采用软件BioEdit对含有微卫星位点的ESTs序列进行聚类分析，选取不重复的序列进一步设计引物；
(2)引物设计：
在微卫星重复的侧翼序列利用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44设计引物，引物设计采用以下严谨度：(1)引物长度为19-25mer，(2)GC含量40％-60％，(3)退火温度45-65度，(4)预期PCR产物长度为100-400bp；
(3)引物优化：
不同引物根据不同Tm值，在温度梯度PCR仪上进行温度梯度优化(在Tm值上下各做10度)，扩增反应采用Biometra T-Gradient PCR系统，PCR程序为：95℃变性45s，退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min，反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，80ng的模板DNA，该模板是从48个个体中任取5个个体的DNA等量混合得到，扩增得到的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta；
(4)标准微卫星位点的确立：
微卫星位点的多态性水平可用多态信息含量值(Polymorphism InformationContent，PIC)衡量；一般情况下，多态信息含量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC＞0.5时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能够较为合理的提供遗传信息；而当PIC＜0.25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差；根据上述优化获得的Ta值，选取48个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算；PCR程序为95℃变性45s，Ta(各引物优化的最佳退火温度)退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min；反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，20ng的模板DNA；PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳完毕后经EB(浓度为0.15μg/ml)染色，紫外观察成像并对电泳带谱利用公式PIC＝1-∑Pi2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件POPGENE32计算得出；根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.25的标记，最终筛选得到重复性、稳定性好，PIC值大于0.25的位点11个，作为仿刺参标准微卫星评价体系，用于仿刺参的种质资源评价。
本发明与现有技术相比，其设计原理安全可靠，标记方法简单易行，对仿刺参筛选和进行微卫星标记效果好，应用前景广阔，社会经济效益明显。
附图说明：
图1为本发明实施例的位点1-cDNA-007_67_C09.T7扩增两个养殖群体的电泳图(每个群体示5个个体)。
图2为本发明实施例的位点1-cDNA-016_84.T7_D11扩增两个养殖群体的电泳图(每个群体示5个个体)。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进行详细叙述。
本实施例按下列步骤进行：
(1)微卫星位点来源：
利用微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5对GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行微卫星DNA的查找，对二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于5次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星片段进行快速分离，从而得到含有微卫星重复的序列，采用软件BioEdit对含有微卫星位点的ESTs序列进行聚类分析，选取不重复的序列进一步设计引物；
(2)引物设计：
在微卫星重复的侧翼序列利用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44设计引物，引物设计采用以下严谨度：(1)引物长度为19-25mer，(2)GC含量40％-60％，(3)退火温度45-65度，(4)预期PCR产物长度为100-400bp；
(3)引物优化：
不同引物根据不同Tm值，在温度梯度PCR仪上进行温度梯度优化(在Tm值上下各做10度)，扩增反应采用Biometra T-Gradient PCR系统，PCR程序为：95℃变性45s，退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min，反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，80ng的模板DNA，该模板是从48个个体中任取5个个体的DNA等量混合得到，扩增得到的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta；
(4)标准微卫星位点的确立：
微卫星位点的多态性水平可用多态信息含量值(Polymorphism InformationContent，PIC)衡量；一般情况下，多态信息含量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC＞0.5时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能够较为合理的提供遗传信息；而当PIC＜0.25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差；根据上述优化获得的Ta值，选取48个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算；PCR程序为95℃变性45s，Ta(各引物优化的最佳退火温度)退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min；反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，20ng的模板DNA；PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳完毕后经EB(浓度为0.15μg/ml)染色，紫外观察成像并对电泳带谱利用公式PIC＝1-∑Pi2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件POPGENE32计算得出；根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.25的标记，最终筛选得到重复性、稳定性好，PIC值大于0.25的位点11个，作为仿刺参标准微卫星评价体系，用于仿刺参的种质资源评价。
实施例：
本实施例利用得到的评价体系进行仿刺参不同地理群体评价的步骤：
(1)提取仿刺参DNA：
本实施例选用的仿刺参采自荣成和大连两个养殖场，每个养殖场随机选取48只健康的仿刺参作为实验材料，仿刺参活体解剖后取肌肉组织约200mg，加入500μl CTAB裂解液【EDTA：200mM；Tris-Cl：100mM，PH＝8.0；NaCl：1.4M；CTAB：2％(W/V)；使用前加入1.5％β-巯基乙醇】，剪碎，60℃处理，直到裂解液澄清；加入等体积饱和酚(250μl)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次；取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次，取上清液，加入50μlNaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12,000转离心10分钟，将核酸沉淀于管底，70％乙醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发，加入100μl的无菌水和少量RNase A，4℃直到DNA全部溶解；
(2)PCR扩增：
PCR反应体系为20μl，含有40ng仿刺参基因组DNA，0.2mmol/l的引物，200mmol/l的dNTPs，200mmol/l的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶；PCR程序参数为：95℃变性45s，Ta退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min，4℃保存；
(3)电泳检测PCR反应条件为：
PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准——pUC19/HaeIII；电泳2-3小时后用溴化乙锭(浓度0.15mg/mL)染色，凝胶成像系统上紫外成像并对电泳谱带进行分析(代表图谱见图1、图2)；利用软件Quantity One对每个个体的扩增产物进行准确的大小确定，从而进行快速准确的基因型确定；将谱带转换成软件POPGENE32能够识别的数据，对其遗传学数据进行计算；其结果可以反应出不同地理群体(种群)的Hardy-Weinberg平衡性、杂合度、等位基因频率等遗传学数据，从而应用于仿刺参不同地理群体(种群)的种质资源分析。
本实施例以11个微卫星标记作为标准评价体系的建立，为相关研究室之间数据的比对和交流提供了基础，也有望为保护和持续利用仿刺参种质资源，建立集约型、健康型养殖产业，坚持品牌战略提供技术支持。
| 1-CDNA_F08_M13F | F：CAGAAGGAATCTATGTGATGG R：TTCTACCTAAGGGGAACCTAC |
| 1-cDNA-014_64.T7_H09 | F：CTAGACATGGTAGGCGGTGC R：CCACAAATCGGCTACTTTTC |
| 1-cDNA-016_84.T7_D11 | F：GTTTTAGGTAGGGACTTGACTG R：TGGCTTGTGAATTTTGTATCACTG |
| 1-cDNA-020_56.T7_H07 | F：ATGCTCAGGAGACCAGTTAG R：CCACATCTGGCTCATCATTC |
| 1-cDNA-021_17.T7_A03 | F：GAAGAGAAGAAAGAGGAGGCT R：AAACAATCACCAGACCCGA |
| 1-cDNA-021_78.T7_F10 | F：CCAAGTGAGGAATGTGGTGC R：CCATCCATAGAGGAATTAAAC |
| 1-cDNA-022_59.T7_C08 | F：AAGGAGGAATTTGATAAGTGGC R：TTGGTGTTTTTGTGGCGTTC |
| 2-CDNA-015_63.T7_G08 | F：GAAGTAGTTTCTGTGACAGGAAG R：CGAGTCTGCTATTATTTGGG |
| 3-CDNA-012_20.T7_D03 | F：GCTGGGGAAAAATTTACAAGAC R：GCCTTCAATAAATAGCCTTCG |
| 3-cDNA-B04_M13F | F：CAATCGGGCATGGGAATC R：GAATGAGGCAAGTCTGTAG |
| 3-cDNA-H12_M13F | F：CAATCCACACTTGACCACTTTC R：AGGTGAGAGCAGGTCCTAGC |
Claims (1)
1.一种仿刺参标准微卫星标记的构建方法，包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和标准微卫星位点确定四个步骤，其特征在于：
(1)微卫星位点来源：
利用微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5对GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行微卫星DNA的查找，对二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于5次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星片段进行快速分离，从而得到含有微卫星重复的序列，采用软件BioEdit对含有微卫星位点的ESTs序列进行聚类分析，选取不重复的序列设计引物；
(2)引物设计：
在微卫星重复的侧翼序列利用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44设计引物，引物设计采用以下严谨度：①引物长度为19-25mer，②GC含量40％-60％，③退火温度45-65度，④预期PCR产物长度为100-400bp；
(3)引物优化：
不同引物根据不同Tm值，在温度梯度PCR仪上进行温度梯度优化，扩增反应采用Biometra T-Gradient PCR系统，PCR程序为：95℃变性45s，退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min，反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，80ng的模板DNA，该模板是从48个个体中任取5个个体的DNA等量混合得到，扩增得到的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta；
(4)标准微卫星位点确立：
微卫星位点的多态性水平用多态信息含量值衡量；多态信息含量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC＞0.5时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能够较为合理的提供遗传信息；而当PIC＜0.25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差；根据上述优化获得的Ta值，选取48个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算；PCR程序为95℃变性45s，各引物优化的最佳退火温度Ta退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；首次循环前95℃预变性5min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min；反应体系为20μl，含有1×PCR反应缓冲液，0.2mM的dNTPs，1.2mM的Mg2+，各0.2μM的正、反引物，1U的Taq DNA聚合酶，20ng的模板DNA；PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳完毕后经浓度为0.15μg/ml的EB染色，紫外观察成像并对电泳带谱利用公式PIC＝1-∑Pi2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件POPGENE32计算得出；根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.25的标记，最终筛选得到重复性、稳定性好，PIC值大于0.25的位点11个，作为仿刺参标准微卫星评价体系，用于仿刺参的种质资源评价。
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