CN105567814B - 快速区分仿刺参来源地的随机扩增多态性dna方法及实现所述方法的引物 - Google Patents

快速区分仿刺参来源地的随机扩增多态性dna方法及实现所述方法的引物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过随机扩增多态性DNA技术对三种不同来源地的仿刺参进行快速鉴定、区分的方法。本发明提供实现上述方法的对仿刺参进行RAPD扩增的引物、含有所述引物的试剂盒，还涉及一种快速检测仿刺参来源地的随机扩增多态性DNA方法，通过提取待测样品的DNA模板，通过如SEQ No.1所示的引物D20为随机引物进行PCR反应，然后对PCR反应产物进行电泳检测。本发明通过RAPD技术实现仿刺参来源地的快速检测，克服了现有技术鉴定仿刺参时存在的成本高、费时长等缺点。本发明只需进行一次PCR反应和一次琼脂糖凝胶电泳即能分辨大连、威海、烟台的仿刺参，具有低成本、灵敏度高的优点。

Description

快速区分仿刺参来源地的随机扩增多态性DNA方法及实现所 述方法的引物
【技术领域】
本发明属于分子生物学领域，涉及海参的分子生物学鉴定，特别是通过随机扩增多态性DNA对三种不同来源地的仿刺参进行快速鉴定的方法。
【背景技术】
海参是棘皮动物门海参纲动物的统称，是名贵海味并具有重要的药用价值。其中，仿刺参(Apostichopus japonicus)俗称辽参，属于楯手目、刺参科、仿刺参属，是我国经济价值最高的海参品种。种群主要分布于辽、冀、鲁、苏等北方沿岸浅海区，在日本北海道、俄属海参崴、朝鲜半岛也有生长。然而，商业利益也催生了如掺假、造假等不法行为，特别是譬如伪造产地、以次充好等，所以对市面上所销售种类繁多的海参进行物种分类和来源地鉴定势在必行。
目前，鉴定海参种类及产地的方式主要有形态学鉴定、物理学方法鉴定、化学方法鉴定以及分子生物学方法鉴定。其中传统鉴定方法过程繁琐复杂、耗时耗力、准确性低，难以适应现代工业的鉴定要求。
分子生物学方法以核酸为研究对象，具有特异性好、灵敏度高、耐热性强等优点，利用DNA条形码技术对海参物种进行鉴定，例如线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(Mitochondrial cytochrome coxidase subunitⅠ，COⅠ)由于存在显著的序列变异而被认为是一种合适的DNA分子标记。
例如中国专利申请CN 201410010808.8公开了一种刺参科17种经济海参基于COI基因的PCR-RFLP鉴别方法，其通过分子生物学方法基于COI基因对样品基因片段进行PCR-RFLP反应，结合电泳检测和谱带判断海参样品的品种。然而，该方法只能检测海参的品种，而对于同品种的海参却无法分辨其来源地。
至于海参产地的鉴别研究，现代技术利用近红外光谱法、ICP-MS进行研究，但上述方法的特点是操作复杂，成本较高，且一般实验室难以开展，故亟需发明一种简单易行且准确的鉴定方法。
随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)技术是由美国科学家Williams、Welsh等于1990年提出的一项DNA多态性分析技术。其原理是采用短的单一引物，一般约为10个碱基，通过PCR反应对目标生物的基因组DNA进行扩增，然后用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，产物的电泳条带在数量、大小位置、明暗等方面表现出很强的特异性，反映出目标生物基因组DNA的多态性。
【发明内容】
本发明的目的是对来自大连、威海和烟台的仿刺参进行快速来源地检测。
为了实现上述目的，本发明提供对仿刺参进行RAPD扩增的引物，所述引物序列如SEQ No.1所示。
本发明还提供含有上述引物的快速检测仿刺参来源地的试剂盒。
本发明还涉及采用随机扩增多态性DNA的快速区分仿刺参来源地的检测方法，包括以下步骤：
(1)对每一份仿刺参分别取待测样品，提取DNA模板；
(2)分别以待测样品DNA为模板，如SEQ No.1所示的引物D20为随机引物进行PCR反应；
(3)对PCR反应产物进行电泳凝胶检测；
(4)采用Ntsys软件对电泳凝胶检测所得扩增图谱进行数据统计，将图谱中的无条带位点负值为0，有条带位点赋值为1，通过Ntsys软件计算各个样品之间的遗传相似系数矩阵并进行聚类分析，得到各样品的遗传距离聚类图；
(5)通过遗传距离聚类图区分仿刺参样品的来源地。
其中，步骤(1)包括待测样品置于超纯水中浸泡4-10小时，然后称取80mg海参肌肉柱，冲洗干净后置液氮中研碎，取30mg的肌 肉柱利用Mollusc DNAkit提取海参基因组DNA，置4℃备用。
步骤(2)的PCR反应条件为：
反应体系：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5U/μL Taq酶0.5μL，10μmol/L引物2μL，DNA模板2μL，ddH2O补足至50μL；
PCR反应参数：95℃预变性5min，然后经过40个循环，每个循环包括：95℃1min，45℃1min，72℃2min；最后72℃延伸10min，4℃保存。
步骤(3)包括以0.5×TBE缓冲液配置1.5％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至60℃左右时加入10％(v/v)核酸染料，混匀后倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入含0.5×TBE缓冲液的电泳槽中；再将8μL步骤(2)的PCR产物与1μL加样缓冲液混匀，依次加入加样孔内；控制电压保持在100v电泳，当溴酚蓝条带泳动到2/3胶长时，停止电泳，取出置于紫外凝胶成像系统中观察。
步骤(4)中采用非加权组平均法(unweighted pair group method witharithmetic mean，UPGMA)进行聚类分析，构建各样品的遗传距离聚类图。
与现有技术相比，本发明通过RAPD技术实现多种、多份仿刺参样品来源地的快速区分，克服了现有技术鉴定仿刺参时存在的成本高、费时长等缺点。本发明可快速分辨大连、威海、烟台的仿刺参，具有低成本、灵敏度高的优点。
【附图说明】
图1为随机序列C11扩增产物凝胶电泳结果；
图2为随机序列C15扩增产物凝胶电泳结果；
图3为随机序列C16扩增产物凝胶电泳结果；
图4为随机序列D16扩增产物凝胶电泳结果；
图5为随机序列D20扩增产物凝胶电泳结果；
其中：1：Marker(2000bp)；2-10大连仿刺参；11-20烟台仿刺参；21-28威海仿刺参；29：Marker(2000bp)。
图6为根据图5的数据统计得到的不同来源地仿刺参的遗传相似系数矩阵得到的图谱。
【具体实施方式】
以下通过较优实施例非限制性地解释本发明的技术方案。
实施例1
(1)海参样品的预处理及品种确认
分别购买来源地为大连的仿刺参9个、烟台的仿刺参9个和威海的仿刺参8个共计26个，顺序编号，分别在Milli-Q超纯水中浸泡5小时，备用。
分别取肌肉柱30mg，在如下反应条件和反应体系下以海参种特异性引物进行PCR反应：
95℃预变性30S；95℃变性30s；36℃退火30s；72℃延伸1min；72℃延伸4min。进行40次循环。
将得到的序列经过NCBI Blast比对后鉴定确认为仿刺参。
海参种特异性引物：
V3F：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’
V3R：5’-CTCCGGTTTGAACTCAGATCA-3’
(2)提取DNA模板
各样品分别称取80mg海参肌肉柱，冲洗干净后置液氮研碎。取30mg的肌肉柱利用Mollusc DNA kit D3373-01(购买自美国OMEGA 公司)提取海参基因组DNA，置4℃备用。具体操作步骤如下：
1.取肌肉柱30mg组织，用液氮研磨，研磨好转入1.5mL的离心管中；
2.加入350μL bufferML1，然后加入25μL蛋白酶K。votex混合，37℃过夜溶解组织；
3.加350μL氯仿异戊醇，并且votex混匀。室温下10000×g离心2min然后取上清置1.5mL离心管中(如果析出上清太少，再加200μL ML1buffer，混匀离心，然后再取上清)；
4.选作：加5μL RNA酶，室温孵育10-30min；
5.添加等体积的buffer MBL然后和votex混匀，70℃孵育10分钟；
6.加0.5体积的酒精，votex混匀；
7.将HiBind DNA column安装在2ml收集管上，把以上获得的750μL混合液(包括沉淀物)转移到该柱子上，室温下10000×g离心1分钟，弃掉液体，重新利用收集管；
8.将柱子放回同样的收集管，在把剩余的液体加入，同上离心放弃液体；
9.放柱子在2ml的新收集管用500μL HB buffer洗，10000×g离心30s，放弃液体，取柱子；
10.放置柱子到2ml的离心管加700μL DNA Wash buffer(提前用酒精稀释)，10000×g离心1min，弃液体；
11.重复第九步，再用700μL DNAWash buffer洗。然后将柱子放到空收集管中15000g离心2min；
12.将柱子放在1.5mL离心管上，加50-100μL Elution buffer(提前70℃预热)，在室温放置2min，10000×g离心1min至DNA溶出；
13.重复12的步骤。
(3)RAPD反应
利用Primer 5.0设计了共80条随机引物序列(由上海桑尼生物工程技术服务有限公司合成)，分别取上述引物与仿刺参样品进行 PCR反应，具体反应如下：
反应体系：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5U/μL Taq酶0.5μL，10μmol/L引物2μL，DNA模板2μL，ddH2O补足至50μL。
PCR反应参数：95℃预变性5min，然后经过40个循环，每个循环包括：95℃1min，45℃1min，72℃2min；最后72℃延伸10min，4℃保存。
(4)电泳凝胶检测
分别对各PCR反应产物进行电泳检测，具体反应为：以0.5×TBE缓冲液配置1.5％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至60℃左右时加入10％(v/v)核酸染料，混匀后倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入含0.5×TBE缓冲液的电泳槽(DYY-12型电泳仪)中；再将8μL PCR产物与1μL加样缓冲液混匀，依次加入加样孔内；控制电压保持在100v电泳，当溴酚蓝条带泳动到2/3胶长时，停止电泳，取出置于紫外凝胶成像系统(ND-1000型微量紫外分光光度计)中观察。
据观察，80份电泳结果中，大部分成像模糊，或明显存在多样性差、规律性差的缺陷而被排除，初步筛选后根据如图1-5的电泳结果分别选出其中5条随机引物，如表1。
(5)构建遗传距离聚类图
将上述结果分别通过Ntsys 2.10e型软件对各个电泳凝胶所得结果进行数据统计处理，分析各样品的扩增图谱，将无条带位点负值为 0，有条带位点的赋值为1，用Ntsys2.10e制作为“0，1”文件，得出不同来源地的仿刺参之间的遗传相似系数矩阵，采用非加权组平均(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)法进行聚类分析，构建各样品的遗传距离聚类图。
由于图1较模糊，系统难以区分各条带而无法作为数据输入而不能得到有效结果；图2和图3存在多样性差的缺陷，图4存在规律性差的缺陷因此均无法作为Ntsys 2.10e型软件生成聚类图的有效输入。
而对应引物D20的图5，肉眼观察其成像清晰、规律性好，其中大连组9个样品电泳条带分布相似，特别是在250bp处的条带是大连地区特有的条带，烟台组的9个样品也是具有相似的条带，威海组8个样品条带分布相似。将该电泳图作为Ntsys 2.10e型软件生成聚类图的输入数据后，经过聚类分析能够得到如图6所示的结果。
综合图5和图6可以看出，该RAPD引物能够可以很好地扩增出不同大小片段的DNA，有效区分来自三个不同地区海参样品，并具有良好的多样性，区分力显著优于其他随机引物。
图6可以看出，所有样品清晰的分成了两个聚类。第一个聚类包括了全部大连的样品，同时这个类群可以分成一个亚群和两个分支，说明处于分支处的DL3和DL8距离其他大连的确的样品较远；第二个类群包括了两个亚群，第一个亚群的全部样品来自烟台，第二个亚群是来自威海的全部样品。但是两个亚群可以看出来烟台的样品间的遗传多样性更大些。RAPD结果和地区有着密切的关系，大连的海参的进化距离远于威海和烟台的，威海和烟台的海参有较近的距离。
综上所述，采用D20对不同地区的仿刺参进行RAPD能获得较为明显的聚类信息，该聚类信息能够将样品区分为多个亚群或多个分支，对应于不同的产地，实现对样品群的区分。因此RAPD引物D20可以用于快速对仿刺参样品的来源地进行分类，或用于进一步鉴定地理距离较远的海参样品。

Claims (5)

1.对仿刺参进行RAPD扩增的引物，所述引物序列如SEQ No.5所示。
2.一种快速检测仿刺参来源地的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有如权利要求1所述的引物。
3.采用随机扩增多态性DNA的快速区分仿刺参来源地的检测方法，包括以下步骤：
(1)对每一份仿刺参分别取待测样品，提取DNA模板；
(2)分别以待测样品DNA为模板，如SEQ No.5所示的引物D20为随机引物进行PCR反应；
PCR反应条件为：
反应体系：10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5U/μL Taq酶0.5μL，10μmol/L引物2μL，DNA模板2μL，ddH2O补足至50μL；
PCR反应参数：95℃预变性5min，然后经过40个循环，每个循环包括：95℃1min，45℃1min，72℃2min；最后72℃延伸10min，4℃保存；
(3)对PCR反应产物进行电泳凝胶检测；
(4)采用Ntsys软件对电泳凝胶检测所得扩增图谱进行数据统计，将图谱中的无条带位点负值为0，有条带位点赋值为1，通过Ntsys软件计算各个样品之间的遗传相似系数矩阵并采用非加权组平均法进行聚类分析，得到各样品的遗传距离聚类图；
(5)通过遗传距离聚类图区分仿刺参样品的来源地。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)包括取待测样品置于超纯水中浸泡4-10小时，然后称取80mg海参肌肉柱，冲洗干净后置液氮中研碎，取30mg的肌肉柱利用Mollusc DNAkit提取海参基因组DNA，置4℃备用。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)包括以0.5×TBE缓冲液配置1.5％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至60℃左右时加入10％(v/v)核酸染料，混匀后倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入含0.5×TBE缓冲液的电泳槽中；再将8μL步骤(2)的PCR产物与1μL加样缓冲液混匀，依次加入加样孔内；控制电压保持在100v电泳，当溴酚蓝条带泳动到2/3胶长时，停止电泳，取出置于紫外凝胶成像系统中观察。
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