CN108642208B

CN108642208B - 一种樟属及其近缘属植物通用ssr分子标记及其开发方法和应用

Info

Publication number: CN108642208B
Application number: CN201810475199.1A
Authority: CN
Inventors: 伍艳芳; 徐海宁; 刘新亮; 郑永杰; 李江; 杨海宽; 汪信东; 章挺; 王建
Original assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Current assignee: Jiangxi Academy of Forestry
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2038-05-17
Also published as: CN108642208A

Abstract

本发明公开了一种樟属及其近缘属植物通用SSR分子标记及其开发方法和应用。所述的樟属及其近缘属植物通用的微卫星标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。本发明提供了一组在樟属及其近缘属中可以直接应用于种内和种间，具有很好的通用性、实用性和稳定高效的多态性微卫星分子标记及其扩增引物。樟属及其近缘属植物由于遗传背景不清晰，且受EST序列数量的限制，现阶段难以大规模开发EST‑SSR分子标记，本发明开发的通用型微卫星分子标记解决了的这一问题。

Description

一种樟属及其近缘属植物通用SSR分子标记及其开发方法和应用

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种樟属及其近缘属植物通用SSR分子标记及其开发方法和应用。

背景技术：

微卫星(microsatellite)，又称简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1～6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列。

与其它标记技术相比，SSR分子标记具有以下特点：(1)在每个微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的，而且在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定的相似性。(2)这些小的串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异。(3)微卫星的突变率高，因此造成了它们的多态性。微卫星寡聚核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。

由于SSR分子标记的诸多优点，已经被用于DNA指纹分析、功能基因定位以及QTL定位等，同时SSR标记也在诸多物种的种质资源鉴定中得到了很好的应用，在遗传多样性分析研究中也得到广泛的利用，是目前应用最为广泛的主要分子标记之一。在遗传图谱构建，物种的系统进化历程分析，亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种等领域，SSR分子标记都有着重要的应用价值，并且还在不断地被深入研究。

樟科植物种类繁多，多为乔木，是我国南方珍贵的经济、用材、观赏和生态树种，在林业、轻工业、医药上都占有重要地位。其中，以闽楠、浙江楠等为代表的楠属植物是我国珍贵的用材树种，以樟树、黄樟为典型代表的樟属植物不仅是优良的用材树种，也是轻工业和医药的重要原料树种，具有重要的开发利用价值。目前，有关樟科植物分子标记的研究相对较少，KameyamaY采用构建富集文库的方法开发了22对具有多态性的樟树SSR分子标记，沉水樟、闽楠、红楠等有少量的分子标记研究，但各有其缺点，难以满足樟属、楠属等樟科植物遗传多样性、功能基因鉴定以及分子鉴别等研究的需要。楠属和润楠属由于缺乏基因组序列信息，也受到EST序列数量的限制，尚未发现SSR标记开发相关研究的报道；因此目前楠属和润楠属还没有SSR分子标记被开发出来，也没有能够用于樟属、楠属和润楠属之间通用的SSR标记。因此，开发樟属、楠属和润楠属通用的微卫星分子标记，对于樟科植物野生资源的开发利用，开展属间远缘杂交育种以及分子水平研究具有重要意义，能够更好的为樟科植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群体间的基因流及交配系统等方面的研究服务。

发明内容：

本发明针对目前樟科植物基因组SSR标记开发难度大、SSR标记数量少的不足，提供樟属及其近缘属植物通用SSR分子标记及其开发方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种樟属及其近缘属植物通用的微卫星标记，其特征在于，所述的微卫星标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示，其来源于樟树全基因组TRF序列。

本发明的第二个目的是提供扩增上述樟属及其近缘属植物通用的微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物如下所示：

特异性引物Cc-32：F：CGTCGGCAAAATAAAAGGAA，R：GACGAAAATGAAAACGTCGG；(来源于SEQ ID NO.1的序列)

特异性引物Cc-41：F：TGGGACCATCAAAAGGGTTA，R：GATTGTGGGTGGCTGTTAGG；(来源于SEQ ID NO.2的序列)

特异性引物Cc-72：F：GGCAGGTAATGAGTAATGACAGAA，R：AATAGGGGGAAAGGATTTGG；(来源于SEQ ID NO.3的序列)

特异性引物Cc-95：F：AGGGATGGTGCAAAGATGAC，R：AGCAGCTCACTCCACTTGGT；(来源于SEQ ID NO.4的序列)

特异性引物Cc-99：F：TGCCCATAAGAGAACCCACT，R：TTTTGCTTTCGTCCTGCTTT；(来源于SEQ ID NO.5的序列)

特异性引物Cc-126：F：ATTTGGATGGACCAAAGGTG，R：ATGGAGTCCTTGAAATCCCC；(来源于SEQ ID NO.6的序列)

特异性引物Cc-127：F：GCCCAACCCAAAATATTCTAA，R：CCCACAATGGTGTTGTGAAA；(来源于SEQ ID NO.7的序列)

特异性引物Cc-175：F：TCGGGTTAAAAAGGCTACGA，R：CTGGTTTGGGAGTCATTGGT。(来源于SEQ ID NO.8的序列)

所述的樟属及其近缘属植物通用微卫星标记，所述编号为Cc-32的微卫星分子标记的重复序列为(AAAAT)5，所述编号为Cc-41的微卫星分子标记的重复序列为(TAA)5，所述编号为Cc-72的微卫星分子标记的重复序列为(TTA)7，所述编号为Cc-95的微卫星分子标记的重复序列为(AAAT)6，所述编号为Cc-99的微卫星分子标记的重复序列为(TAACCC)5，所述编号为Cc-126的微卫星分子标记的重复序列为(TA)7，所述编号为Cc-127的微卫星分子标记的重复序列为(ATA)5，所述编号为Cc-175的微卫星分子标记的重复序列为(TTTA)8。编号分别为Cc-32、Cc-41、Cc-72、Cc-95、Cc-99、Cc-126、Cc-127、Cc-175的微卫星分子标记的特异性引物的核苷酸序列两端引物的退火温度分别为Cc-32：55℃；Cc-41：58℃；Cc-72：58℃；Cc-95：58℃；Cc-99：54℃；Cc-126：56℃；Cc-127：52℃；Cc-175：58℃。

所述的樟属的近缘属植物包括楠属(phoebe nees)和润楠属(Machilus Nees)。

本发明的第三个目的是提供一种樟属及其近缘属植物通用的微卫星标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、樟树全基因组TRF序列中多核苷酸微卫星分子标记位点筛选

a、采用TRF软件在默认搜索条件下获得樟树全基因组串联重复序列(TRF)；

b、采用MISA程序在默认搜索条件下搜索樟树基因组TRF获得樟树基因组微卫星序列；

c、基于重复核苷酸序列越长，多态性越高的原理，采用CD-HIT程序去除单核苷酸单元的微卫星位点；

d、筛选出适合设计引物的2-6碱基微卫星原始序列：筛选原则为：序列长度大于100bp且不大于800bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸单元的重复数则大于等于5，4种核苷酸重复的长度不少于12bp；选取侧翼序列完整的微卫星序列，重复序列两边的侧翼序列分别为200bp；鉴于碱基互补配对原则和统计拷贝数起始碱基顺序的排列差异，将同类重复兼并为一种串联重复拷贝类别代表。

e、利用软件Primer3对选定序列进行批量引物设计，引物设计原则为：引物碱基数控制在18-24个，最佳引物长度为20bp；退火温度范围50℃-60℃，两个引物退火温度差＜4℃；GC含量范围40％-60％之间，最佳GC含量为50％；扩增得到的DNA片段大小在500个碱基以内；

B、樟属多态性引物筛选

多态性引物的筛选包括e-PCR电子扩增检测，扩増稳定性的初步筛选和扩増多态性的复筛；所述e-PCR电子扩增检测是在NCBI网站上采用生物信息学方法进行电子模拟筛选，获得有扩增产物和多态性的引物；所述初步筛选是采用构建樟树混合样品池的方法，利用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对上述电子模拟筛选引物进行稳定性验证，筛选扩增良好的引物；所述扩増多态性的复筛是挑选樟属典型代表植物，分别构建多个混合样品池，利用PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳方法，挑选在樟属各代表植物中都具有扩增多态性的引物，即为樟属植物通用的多态性微卫星分子标记的特异性引物；

C、樟属、楠属及润楠属植物通用SSR分子标记筛选：

樟属、楠属及润楠属植物通用微卫星标记筛选包括初步筛选和复筛，所述初步筛选是从樟属植物通用的多态性微卫星分子标记的特异性引物中挑选通用率100％的引物，通过构建楠属和润楠属典型代表植物混合样品池，通过PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳方法，筛选扩增良好的引物，所述复筛是二次PCR扩增，挑选在樟属、楠属和润楠属植物中都具有扩增多态性的引物，即为樟属、楠属和润楠属植物通用的多态性微卫星分子标记的特异性引物。

D、通用SSR分子标记的验证

随机选取樟属、楠属和润楠属植物，采集群体样品，通过PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳方法，验证所获得的引物是否具有群体扩增多态性，是否可用于遗传多样性检测。

本发明的第四个目的是提供一种樟属及其近缘属植物通用的微卫星分子标记的特异性引物的应用，其特征在于，所述的应用是用于开展遗传多样性分析、指纹图谱构建及分子标记辅助育种研究。

本发明的第五个目的是提供一种樟属及其近缘属植物通用微卫星分子标记应用于遗传多样性检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、提取待测植物的基因组DNA；

b、以步骤(a)提取的基因组DNA为模板，利用上述的樟属及其近缘属植物通用SSR

分子标记特异性引物中的每个引物对分别进行PCR扩增；

c、利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型；

d、采用生物信息学软件对基因分型数据进行统计分析。

所述步骤(b)中的PCR扩增，其扩增体系优选为：10×buffer 1μl，25mmol/LMgCl₂0.6μl，10mmol/L dNTP 0.6μl，5U/μl DNA聚合酶0.1μl，DNA模板50ng，25mmol/L SSR分子标记的引物F和R各0.5μl，双蒸水定容至10μl。

所述步骤(b)中的PCR扩增，其扩增反应程序优选为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，各引物对退火温度下复性30sec，72℃延伸30sec，32个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

所述步骤(c)中的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳优选使用8％的凝胶浓度。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一组在樟属及其近缘属中可以直接应用于种内和种间，具有很好的通用性、实用性和稳定高效的多态性微卫星分子标记及其扩增引物。樟属及其近缘属植物由于遗传背景不清晰，且受EST序列数量的限制，现阶段难以大规模开发EST-SSR分子标记，本发明开发的通用型微卫星分子标记解决了的这一问题。

2.本发明建立了一种樟属及其近缘属植物通用微卫星分子标记开发方法，相对于其它微卫星的开发方法，本方法具有快速、实用性强、通用性强和稳定高效的优点，对樟科植物的分子标记开发具有重要的实用价值，不仅为樟属、楠属及润楠属植物开发了新一批的gSSR分子标记，同时也为其它樟科植物微卫星分子标记的开发提供参考。

3.本发明开发的樟属及其近缘属植物通用的微卫星分子标记，此通用型多态性引物来源于基因组序列，能够反映细胞质基因组的遗传信息，可直接应用于樟属及其近缘属植物的种间鉴定、亲缘关系分析、种质资源分类、群体遗传多样性检测、群体遗传分化与结构、群体间的基因流及交配系统等研究。

附图说明：

图1是引物Cc-32在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图2是引物Cc-41在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图3是引物Cc-72在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图4是引物Cc-95在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图5是引物Cc-199在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图6是引物Cc-126在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图7是引物Cc-127在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

图8是引物Cc-175在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果，其中1、2、3、4、5区域分别代表样本为樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物。其中区域1当中的最后两个条带是樟属樟组植物。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

本发明樟属及其近缘属植物通用的微卫星分子标记的开发及其应用经过下列步骤：

1.樟树全基因组TRF序列中多核苷酸微卫星分子标记位点筛选

(1)首先采用TRF软件在默认搜索条件下获得樟树全基因组串联重复序列(TRF)；

(2)采用Perl语言编制的微卫星分析程序(MISA)和在线微卫星位点分析软件(Micr osatellite Repeats Finder)，在默认搜索条件下对樟树基因组TRF进行微卫星位点的筛选，获得樟树基因组微卫星序列；

(3)基于重复核苷酸序列越长，多态性越高的原理，采用去冗余程序CD-HIT去除单核苷酸单元的微卫星位点；

(4)筛选出适合设计引物的2-6碱基微卫星原始序列，筛选原则为：序列长度大于100bp且不大于800bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸单元的重复数则大于等于5，4种核苷酸重复的长度不少于12bp；选取侧翼序列完整的微卫星序列，重复序列两边的侧翼序列分别为200bp；鉴于碱基互补配对原则和统计拷贝数起始碱基顺序的排列差异，将同类重复兼并为一种串联重复拷贝类别代表。

(5)利用软件Primer3对上述选定序列进行批量引物设计，引物设计原则为：引物碱基数控制在18-24个，最佳引物长度为20bp；退火温度范围50℃-60℃，两个引物退火温度差＜4℃；GC含量范围40％-60％之间，最佳GC含量为50％；扩增得到的DNA片段大小在500个碱基以内。

2.樟属多态性引物筛选

多态性引物的筛选包括e-PCR电子扩增检测，扩増稳定性的初步筛选和扩増多态性的复筛。

(1)e-PCR电子扩增检测

将批量设计出来的特异引物在樟树基因组TRF序列中用e-PCR进行模拟扩增，输出理论上可以扩出预期扩增产物的引物，以检测所设计的引物能否扩增出产物及产物的多态性。可得到樟树基因组数据库中相匹配的引物序列、预期扩增的产物长度以及起始点的位置。同时，在NCBI Primer-BLAST进行模拟扩增，参数设置为默认值。根据得到的模拟扩增产物进行筛选，剔除重复的引物，最终得到TRF序列中具有多态性的微卫星分子标记位点。

(2)电子扩增验证及初步筛选

首先挑选异樟、芳樟、龙脑樟、油樟、脑樟5种化学类型的樟树，构建樟树混合样品池，使用优化好的反应条件和扩增程序，对以上经过e-PCR电子扩增挑选过的特异引物进行DNA聚合酶链式反应扩增，反应体系为：10μL反应体系中，含有10×buffer 1μl，25mmol/LMg Cl₂0.6μl，10mmol/L dNTP 0.6μl，5U/μl DNA聚合酶0.1μl，DNA模板50ng，25mmol/L SSR分子标记的引物F和R各0.5μl，双蒸水定容至10μl。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，最适退火温度退火30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。PCR反应完成后，进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，对上述e-PCR电子扩增获得的有扩增产物和多态性的引物进行验证，并对目标引物进行初步筛选，最后得到能够稳定扩增、多态性好的樟树全基因组TRF序列微卫星标记引物。

(3)多态性引物复筛

挑选樟属樟组代表植物樟树(Cinnamomum camphora)、牛樟(C.kanehirae)、黄樟(C.porrectum)、银木(C.septentrionale)、猴樟(C.bodinieri)、沉水樟(C.micranthum)和肉桂组代表植物香桂(C.subavenium)、天竺桂(C.japonicum)、山肉桂(C.osmophloeum)、野黄桂(C.jensenianum)，每个物种至少2个样品，采用上述PCR扩增体系和程序进行PCR扩增，完成后采用8％(质量含量)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，根据电泳结果对所得的图片进行判读，挑选在上述樟属各代表植物中都具有扩增多态性的引物，即为樟属植物通用的多态性微卫星分子标记。样品具体情况见表1。

电泳分离和银染检测方法为：扩增产物中加变性缓冲液(包含98％甲酰胺，10mmol/L pH8.0的EDTA，0.25％溴酚蓝和0.2％二甲苯氰)，用8％(质量含量)变性聚丙烯酰胺凝胶(厚度1.0毫米左右)和1×TBE电泳缓冲液，上样20ng，恒压120V电泳90min后银染检测。银染方法主要过程如下：电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盆中；加入固定液(含10％无水乙醇和0.5％的乙酸)，在摇床上轻微震荡15min进行固定，然后去离子水漂洗2次，每次2min；放入0.1％硝酸银染色液中摇床上轻微震荡10min染色，然后用去离子水漂洗2次，每次5sec；将凝胶置入显色液中(含有1.5％氢氧化钠，0.014％的四硼酸钠)，在摇床上轻微震荡直至条带清晰且条带数不再增加为止；加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗几分钟；去除凝胶和玻璃板上的水珠。放在白光灯下观察并用数码相机拍照。

3.樟属、楠属及润楠属植物通用SSR分子标记筛选

挑选楠属代表植物闽楠(Phoebe bournei)、浙江楠(P.chekiangensis)、白楠(P.neurantha)、紫楠(P.sheareri)、桢楠(P.zhennan)和润楠属代表植物润楠(Machiluspingii)、龙眼润楠(M.oculodracontis)、刨花楠(M.pauhoi)、红楠(M thunbergii)、凤凰润楠(M.phoenicis)，每个物种至少2个样品，，通过PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳方法，筛选扩增良好的引物，即为樟属、楠属和润楠属植物通用的多态性微卫星分子标记的特异性引物。样品具体情况见表1。

最终得到8对樟属、楠属和润楠属植物通用的SSR分子标记的特异性引物，分别是：

Cc-32：5'-CGTCGGCAAAATAAAAGGAA-3'5'-GACGAAAATGAAAACGTCGG-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.1所示；

Cc-41：5'-TGGGACCATCAAAAGGGTTA-3'5'-GATTGTGGGTGGCTGTTAGG-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.2所示；

Cc-72：5'-GGCAGGTAATGAGTAATGACAGAA-3'5'-AATAGGGGGAAAGGATTTGG-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.3所示；

Cc-95：5'-AGGGATGGTGCAAAGATGAC-3'5'-AGCAGCTCACTCCACTTGGT-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.4所示；

Cc-99：5'-TGCCCATAAGAGAACCCACT-3'5'-TTTTGCTTTCGTCCTGCTTT-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.5所示；

Cc-126：5'-ATTTGGATGGACCAAAGGTG-3'5'-ATGGAGTCCTTGAAATCCCC-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.6所示；

Cc-127：5'-GCCCAACCCAAAATATTCTAA-3'5'-CCCACAATGGTGTTGTGAAA-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.7所示；

Cc-175：5'-TCGGGTTAAAAAGGCTACGA-3'5'-CTGGTTTGGGAGTCATTGGT-3'，其扩增得到的序列如SEQ ID NO.8所示；

编号分别为Cc-32、Cc-41、Cc-72、Cc-95、Cc-99、Cc-126、Cc-127、Cc-175的SSR分子标记的特异性引物的核苷酸序列两端引物的退火温度分别为Cc-32：55℃；Cc-41：58℃；Cc-72：58℃；Cc-95：58℃；Cc-99：54℃；Cc-126：56℃；Cc-127：52℃；Cc-175：58℃。重复序列分别为Cc-32：(AAAAT)5；Cc-41：(TAA)5；Cc-72：(TTA)7；Cc-95：(AAAT)6；Cc-99：(TAACCC)5；Cc-126：(TA)7；Cc-127：(ATA)5；Cc-175：(TTTA)8。

Cc-32、Cc-41、Cc-72、Cc-95、Cc-99、Cc-126、Cc-127、Cc-175特异性引物扩增的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。

其中引物Cc-32、Cc-41、Cc-72、Cc-95、Cc-99、Cc-126、Cc-127、Cc-175在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中的DNA聚合酶链式反应扩增结果如图1-8所示。从图1-8可以看出，引物Cc-32、Cc-41、Cc-72、Cc-95、Cc-99、Cc-126、Cc-127、Cc-175在樟树、樟属樟组、樟属肉桂组、楠属和润楠属植物中都能扩增出清晰的条带，说明获得的引物能够通用于樟属及其近缘属。

表1樟属及其近缘属代表植物列表

4.通用SSR分子标记在红楠群体遗传多样性中的应用

随机选取上述通用物种中的一种——红楠，利用上述通用性引物进行群体遗传多样性检测，同时，也是对上述通用性引物通用性的验证。

(1)采集红楠群体样本20个，样本来源详见表2。采用CTAB法提取待测植物的基因组DNA。

表2红楠M.thunbergii种群采样大小及地理位置

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，将引物对Cc-32(F和R)、Cc-41(F和R)、Cc-72(F和R)、Cc-95(F和R)、Cc-99(F和R)、Cc-126(F和R)、Cc-127(F和R)、Cc-175(F和R)分别进行DNA聚合酶链式反应扩增、电泳分离和银染检测的方法，所述的PCR，其反应体系为：10μL反应体系中，含有10×buffer 1μl，25mmol/L MgCl₂0.6μl，10mmol/L dNTP 0.6μl，5U/μlDNA聚合酶0.1μl，DNA模板50ng，25mmol/L SSR分子标记的引物F和R各0.5μl，双蒸水定容至10μl。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，最适退火温度退火30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸10min。

对20个红楠群体样本基因组DNA进行遗传多样性分析。各引物的序列，退火温度和重复序列详见表3。

表3樟属及其近缘属微卫星分子标记DNA聚合酶链式反应扩增引物、退火温度和重复序列

采用Popgene 1.32(Yeh and Boyle，1997)和NTSYS-pcversion2.11软件分析基因型数据及基因频率，计算红楠观测杂合度和期望杂合度，并进行哈代-温伯格(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)及连锁不平衡检验，以此来描述20个红楠DNA多态位点的特征。由表4可以看出，本发明的8对通用型SSR分子标记的引物在供试的20个红楠个体中表现出多态性，由此可见，本发明的20对通用型SSR分子标记的引物能用于分析红楠的遗传多样性和遗传结构，是一种有效可靠的分子标记。

表4红楠的遗传多样性

序列表

<110> 江西省林业科学院

<120> 一种樟属及其近缘属植物通用SSR分子标记及其开发方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 194

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 1

cgtcggcaaa ataaaaggaa gataaataga aaataaaatt agttttaccg acgtgctatt 60

tgcgtcggta aaagaaaagg aaaataaaat aaaataaaat aaaatcgttt accgacatta 120

tatttgcgtc ggtaaaataa aacataaaat aaattaaaga ataaaaatgt cttaccgacg 180

ttttcatttt cgtc 194

<210> 2

<211> 153

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 2

tgggaccatc aaaagggtta gtctgaattt taggagataa tcaaatacat aactaataat 60

aataataaat tacagcaaaa ggtgaaaaga aaacaattgt cacacgtatg aaattatatt 120

aaataaaata aaacctaaca gccacccaca atc 153

<210> 3

<211> 176

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 3

ggcaggtaat gagtaatgac agaaatgaca gtcttattat tattattatt attatttttt 60

ttttttgggt aaaagacagt cttattttct tttttccaaa atatagtatt atattccttt 120

accatatcaa atgtaactga gatacacttg ataacaccaa atctgttccc cctatt 176

<210> 4

<211> 174

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 4

agggatggtg caaagatgac gacctgtatg gttgagtaaa caaaggaatc atatgtcacc 60

aataataact tcaacaggaa atatatatta tacaaaataa ataaataaat aaataaattt 120

tctaactgca ttatacagga tgtgctctta acataccaag tggagtgagc tgct 174

<210> 5

<211> 247

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 5

tgcccataag agaacccact aaccaaagta ttccactgaa ttctattcct tcaatgattt 60

aaaaacaaaa ggaatgtgct acacaactct attaccatag ccttaaccct aaccctaacc 120

ctaaccctaa ccctattatt aactcagatg aaagaaagcc ctgaaaccac tccttttggt 180

ctgtgaacac tgcttctacc ttttctgccc cgctttgtga taaagcaaaa gcaggacgaa 240

agcaaaa 247

<210> 6

<211> 225

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 6

atttggatgg accaaaggtg ggccccataa acatgagctt ataagatttt atcataagct 60

tgagcttagg tgagccttgc tctatatata taggctagac atttggatta tatatatata 120

tatctcttaa gctcaagctt aggataaggt acgttcaagt gtgtggtggg gcccacatgg 180

ggacccacat ggggatgggg gttgggggga tttcaaggac tccat 225

<210> 7

<211> 127

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 7

gcccaaccca aaatattcta ataaaataga atcatatatt attattatat tataataata 60

ataatataat attaaaatat tatgatatat ctatctcata caaacttttt cacaacacca 120

ttgtggg 127

<210> 8

<211> 166

<212> DNA

<213> 樟树(Cinnamomum camphora)

<400> 8

tcgggttaaa aaggctacga acccaaacta gtcataaggc ccatttttat ttatttattt 60

atttatttat ttatttattt tgacatgtga ctgtgcaatg cctgagtccc ttaagctttc 120

taattaaccc atgtaacgag cattcaacca atgactccca aaccag 166

Claims

1.一种樟属、楠属及润楠属植物通用的微卫星分子标记的特异性引物组，其特征在于，所述的特异性引物组由如下特异性引物组成：

特异性引物Cc-32：F：CGTCGGCAAAATAAAAGGAA，R：GACGAAAATGAAAACGTCGG；

特异性引物Cc-41：F：TGGGACCATCAAAAGGGTTA，R：GATTGTGGGTGGCTGTTAGG；

特异性引物Cc-72：F：GGCAGGTAATGAGTAATGACAGAA，R：AATAGGGGGAAAGGATTTGG；

特异性引物Cc-95：F：AGGGATGGTGCAAAGATGAC，R：AGCAGCTCACTCCACTTGGT；

特异性引物Cc-99：F：TGCCCATAAGAGAACCCACT，R：TTTTGCTTTCGTCCTGCTTT；

特异性引物Cc-126：F：ATTTGGATGGACCAAAGGTG，R：ATGGAGTCCTTGAAATCCCC；

特异性引物Cc-127：F：GCCCAACCCAAAATATTCTAA，R：CCCACAATGGTGTTGTGAAA；

特异性引物Cc-175：F：TCGGGTTAAAAAGGCTACGA，R：CTGGTTTGGGAGTCATTGGT。

2.权利要求1所述的樟属、楠属及润楠属植物通用的微卫星分子标记的特异性引物组的应用，其特征在于，所述的应用是用于开展遗传多样性分析。

3.权利要求1所述的樟属、楠属及润楠属植物通用微卫星分子标记的特异性引物组应用于遗传多样性检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、提取待测植物的基因组DNA；

b、以步骤（a）提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物组中的每个引物对分别进行PCR扩增；

c、利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型；

d、采用生物信息学软件对基因分型数据进行统计分析。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（b）中的PCR扩增，其扩增体系为：10×buffer 1μl，25mmol/L MgCl₂ 0.6μl，10mmol/L dNTP 0.6μl，5U/μl DNA聚合酶0.1μl，DNA模板50ng，25mmol/L 微卫星分子标记的引物F和R各0.5μl，双蒸水定容至10μl。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（b）中的PCR扩增，其扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，各引物对退火温度下复性30sec，72℃延伸30sec，32个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；

引物的退火温度分别为Cc-32：55℃；Cc-41：58℃；Cc-72：58℃；Cc-95：58℃；Cc-99：54℃；Cc-126：56℃；Cc-127：52℃；Cc-175：58℃。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（c）中的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用8%的凝胶浓度。