CN102876790A

CN102876790A - 一种菊属及其近缘种属通用的ssr标记pcr反应方法

Info

Publication number: CN102876790A
Application number: CN2012103483175A
Authority: CN
Inventors: 张启翔; 刘华; 孙明; 程堂仁; 王佳; 潘会堂
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-18
Also published as: CN102876790B

Abstract

本发明公开了一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其PCR反应体系中，引物浓度为0.32μM/μl，Taq酶浓度为0.2U/μl，dNTP浓度为0.4μM/μl，Mg²⁺的浓度为0.65μM/μl，DNA的浓度为2~4ng/μl。应用本发明所用的方法进行SSR分子标记PCR反应，所得到的条带清晰、多态性好、重复性高，而且操作简单，在菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种间通用，应用前景十分广阔。

Description

一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法。

背景技术

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。

PCR五因素：引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA模板和Mg²⁺。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

SSR标记是一类重要的分子标记，应用于植物的育种、品种鉴定等领域，SSR标记的开发与利用需要一个灵敏度高，准确性好的PCR反应方法。而目前在菊属及其近缘种属（菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属）尚未研究出高效、通用性强的SSR标记的PCR反应方法。

发明内容

为填补在菊属、亚菊属，太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种之间没有通用的SSR标记PCR反应方法的空白，本发明的目的是提供一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法。

本发明提供的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其PCR反应体系如下：

其中，所述引物可选自以下2对引物中的任意一对：

SSR标记LHJ-1引物序列：

上游引物：5'-ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3'（如SEQ ID NO.1所示）

下游引物：5'-GAGATCGGAGGGTGCGTG-3'（如SEQ ID NO.2所示）

SSR标记YH-2引物序列：

上游引物：5'-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3'（如SEQ ID NO.3所示）

下游引物：5'-GACACCACAACGCTACCGC-3'（如SEQ ID NO.4所示）

其中，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，50-62℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

本发明还提供所述菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法在菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种中的应用。

本发明所提供的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法具有如下优点：

1、本发明填补了在菊属，亚菊属，太行菊属，芙蓉菊属的野生种和品种之间缺少通用的SSR标记PCR反应方法的空白。

2、本发明的SSR标记PCR反应方法灵敏度高，重复性好，易于操作，而且通用性好。

3、有利于菊属，亚菊属，太行菊属，芙蓉菊属SSR标记的开发和利用，推动菊属及近缘种属的新品种培育和商品花卉生产。

附图说明

图1为本发明方法所做菊属品种和野生种的SSR标记PCR产物的琼脂糖电泳图。

图2为本发明方法所做亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属及菊属野生种的SSR标记PCR产物的琼脂糖电泳图。

其中，图1中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的种类依次是：1野菊、2甘菊、3甘野菊、4毛华菊、5小红菊、6菊花脑、7紫花野菊、8神农香菊、9阳光小菊、10繁白露、11四季黄、12香玉、13上海小菊、14夏菊、15国庆红、16玉人面、17神马、18帅旗、19粉玉卷帘、20金葵台、21精兴将军。图2中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的种类依次是：1亚菊、2矶菊、3灌木亚菊、4细裂亚菊、5异色亚菊、6柳叶亚菊、7太行菊、8长裂太行菊、9芙蓉菊、10甘野菊、11毛华菊。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，菊属及近缘种属植物材料均取自北京林业大学种质资源圃，DNA样品的提取采用天根生化科技（北京）有限公司DNA提取试剂盒完成，所用的Tag酶、dNTP和MgCl₂是由Promega公司生产的，SSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例1本发明菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法的建立

（1）提取了菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属内常用的野生种及其栽培品种的DNA样品。

菊属野生种类有：野菊，甘菊，甘野菊，毛华菊，小红菊，菊花脑，紫花野菊，神农香菊。

菊属栽培种类中小菊品种有：阳光小菊（盆栽小菊），繁白露（北方地被小菊），四季黄（北方地被小菊），香玉（切花小菊），上海小菊（南方地被小菊），夏菊（夏季开花种类），国庆红（南方地被小菊），玉人面（茶用菊品种）；

菊属栽培种类中大菊有：神马（重要切花菊品种），帅旗（中国传统大菊品种），粉玉卷帘（中国传统大菊品种），金葵台（中国传统大菊品种），精兴将军（日本大菊品种）；

亚菊属种类：亚菊，矶菊（原产日本），灌木亚菊，细裂亚菊，异色亚菊，柳叶亚菊；

太行菊属：太行菊，长裂太行菊（此属为中国特有，仅此两种）；

芙蓉菊属：芙蓉菊（仅此一种，特产我国）。

（2）经过大量的预实验，设计了25μl体系PCR五因素4水平正交试验：

Taq酶（5U/μl）：0.25μl，0.5μl，0.75μl，1.0μl；

dNTP（20μM/μl）：0.25μl，0.5μl，0.75μl，1.0μl；

Mg²⁺（6.5μM/μl）：1.5μl，2.0μl，2.5μl，3.0μl；

引物（10μM/L）：0.2μl，0.4μl，0.6μl，0.8μl；

DNA样品（50ng/μl）：0.5μl，1.0μl，1.5μl，2.0μl

根据正交实验设计原理得到16个不同的反应体系，见表1。

表1PCR反应体系1-16

因素	Taq酶	dNTP	Mg²⁺	引物	DNA样品
						体系1	0.25μl	0.25μl	1.5μl	0.2μl	0.5μl
体系2	0.25μl	0.5μl	2.0μl	0.4μl	1.0μl
						体系3	0.25μl	0.75μl	2.5μl	0.6μl	1.5μl
体系4	0.25μl	1.0μl	3.0μl	0.8μl	2.0μl
						体系5	0.5μl	0.25μl	2.0μl	0.6μl	2.0μl
体系6	0.5μl	0.5μl	1.5μl	0.8μl	1.5μl
						体系7	0.5μl	0.75μl	3.0μl	0.2μl	1.0μl
体系8	0.5μl	1.0μl	2.5μl	0.4μl	0.5μl
						体系9	0.75μl	0.25μl	2.5μl	0.8μl	1.0μl
体系10	0.75μl	0.5μl	3.0μl	0.6μl	0.5μl
						体系11	0.75μl	0.75μl	1.5μl	0.4μl	2.0μl
体系12	0.75μl	1.0μl	2.0μl	0.2μl	1.5μl
						体系13	1.0μl	0.25μl	3.0μl	0.4μl	1.5μl
体系14	1.0μl	0.5μl	2.5μl	0.2μl	2.0μl
						体系15	1.0μl	0.75μl	2.0μl	0.8μl	0.5μl
体系16	1.0μl	1.0μl	1.5μl	0.6μl	1.0μl

选用SSR标记LHJ-1引物，与步骤（1）提取的DNA样品按照正交实验设计得出的16个体系进行PCR反应，每个体系重复3次；初步筛选出有PCR产物的体系：体系9，体系15，体系16。

SSR标记LHJ-1引物序列（退火温度60℃）：

上游引物：5'-ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3'（如SEQ ID NO.1所示）

下游引物：5'-GAGATCGGAGGGTGCGTG-3'（如SEQ ID NO.2所示）

PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，60℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

（3）利用能分别与菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属各个种的DNA模板产生PCR产物的不同的SSR引物筛选反应体系，最终选出PCR产物条带最亮，重复性最好的体系15：

（4）在体系15的基础上，以上述引物和（1）中的DNA样品对各因素进行单因素多水平实验，继续优化PCR反应体系。

单因素不同水平设计：

Taq酶（5U/μl）：0.15μl，0.25μl，0.5μl，0.75μl，1.0μl，1.25μl，1.5μl；

dNTP（20μM/μl）：0.15μl，0.25μl，0.5μl，0.75μl，1.0μl，1.25μl，1.5μl;

Mg²⁺（6.5μM/μl）：0.5μl，1.5μl，1.5μl，2.0μl，2.5μl，3.0μl；

引物（10μM/L）：0.2μl，0.4μl，0.6μl，0.8μl，1.0μl，1.2μl；

DNA样品（50ng/μl）：0.2μl，0.5μl，1.0μl，1.5μl，2.0μl。

经过其他因素保持同一水平的基础上单一因素多水平摸索，得到最佳的、能在菊属，亚菊属，太行菊属，芙蓉菊属的野生种和品种之间通用的SSR标记PCR反应体系：

以上述PCR反应体系进行菊属品种和野生种的SSR标记PCR产物的琼脂糖电泳，PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，50.5℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。电泳结果见图1，PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的种类依次是：1野菊、2甘菊、3甘野菊、4毛华菊、5小红菊、6菊花脑、7紫花野菊、8神农香菊、9阳光小菊、10繁白露、11四季黄、12香玉、13上海小菊、14夏菊、15国庆红、16玉人面、17神马、18帅旗、19粉玉卷帘、20金葵台、21精兴将军。

以上述PCR反应体系进行亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属及菊属野生种的SSR标记PCR产物的琼脂糖电泳，PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，62.5℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。电泳结果见图2，其中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的种类依次是：1亚菊、2矶菊、3灌木亚菊、4细裂亚菊、5异色亚菊、6柳叶亚菊、7太行菊、8长裂太行菊、9芙蓉菊、10甘野菊、11毛华菊。

上述结果表明，本发明的SSR标记PCR反应方法所得到的条带清晰、灵敏度高，重复性好，易于操作，而且通用性好。

实施例2利用本发明的方法进行菊花SSR标记的筛选

（1）根据SSR分子标记的设计原则，根据菊花已发表的EST序列，应用Primer5设计软件，设计3对SSR引物：

SSR标记YH-1引物序列：

上游引物：5'-TTCGCATGGGTGGTGGGTT-3'（如SEQ ID NO.5所示）

下游引物：5'-CAACAACACAACATGGGGG-3'（如SEQ ID NO.6所示）

SSR标记YH-2引物序列：

上游引物：5'-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3'（如SEQ ID NO.3所示）

下游引物：5'-GACACCACAACGCTACCGC-3'（如SEQ ID NO.4所示）

SSR标记YH-3引物序列：

上游引物：5'-GGGACCCAAGCAGTAGAATG-3′（如SEQ ID NO.7所示）

下游引物：5'-ACCAAACAACCCTCCAACC-3'（如SEQ ID NO.8所示）

（2）提取菊花品种玉龙，金鸡红翎，铺地粉黛，米白早，旌旗，黄金甲的DNA样品。

（3）按照发明的PCR反应体系进行PCR反应：

PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，50-62℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

（4）筛选出能产生PCR产物并且具有多态性的SSR引物组合为SSR标记YH-2引物：

上游引物：5'-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3'（如SEQ ID NO.5所示）

下游引物：5'-GACACCACAACGCTACCGC-3'（如SEQ ID NO.6所示）

该引物的退火温度为56℃。

（5）应用菊属野生种类：野菊，小红菊，毛华菊，菊花脑，甘菊，甘野菊，紫花野菊，神农香菊的DNA样品作为模板，利用本发明的PCR反应方法，测试YH-2引物在菊属的野生种类中的通用性。YH-2的多态性条带统计见表2，结果显示YH-2引物在菊属的野生种中具有通用性，并且具有较高的多态性。

（6）运用本发明的PCR反应方法，利用亚菊属矶菊，太行菊属太行菊，芙蓉菊属芙蓉菊的DNA样品作为模板测试YH-2引物在亚菊属，太行菊属，芙蓉菊属的可转移性，YH-2引物的多态性条带统计见表2。结果显示YH-2引物在亚菊属，太行菊属具有可转移性，不能转移到芙蓉菊属利用。

表2EST-SSR引物YH-2的多态性条带统计

		AL#1	AL#2	AL#3	AL#4
						野菊	PCR01.H04.fsa	329	353
小红菊	PCR02.H05.fsa	329	333	343
						毛华菊	PCR03.A06.fsa	340
菊花脑	PCR04.B06.fsa	334	344
						太行菊	PCR05.C06.fsa	327	331
芙蓉菊	PCR06.D06.fsa	345	347
						矶菊	PCR07.E06.fsa	329	339	343
玉龙	PCR08.F06.fsa	341
						晚粉	PCR09.G06.fsa	340
药红	PCR10.H06.fsa	329	333
						米白早	PCR11.A07.fsa	333	341
淡寒粉	PCR12.B07.fsa	340
						铺地粉黛	PCR13.C07.fsa	333	341
旌旗	PCR14.D07.fsa	333	341
						黄金甲	PCR15.E07.fsa	341
粉地毯	PCR16.F07.fsa	316	333	341	343
						金鸡红翎	PCR17.G07.fsa	333	337	341	343

甘野菊	PCR18.H07.fsa	329	333	341	343
						甘菊	PCR19.A08.fsa	333	343	349
神农香菊	PCR20.B08.fsa	341
						金光万丈	PCR21.C08.fsa	333	341	343

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，PCR反应体系如下：

2.如权利要求1所述的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，引物为SSR标记LHJ-1引物序列：

上游引物：5'-ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3'

下游引物：5'-GAGATCGGAGGGTGCGTG-3′。

3.如权利要求1所述的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，引物为SSR标记YH-2引物序列：

上游引物：5'-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3'

下游引物：5'-GACACCACAACGCTACCGC-3'。

4.如权利要求1所述的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，50-62℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

5.权利要求1-4任一项所述的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法在菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种中的应用。