CN104278021A - 一种铁皮石斛引物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，该方法为：铁皮石斛根的EST序列的获得、铁皮石斛含有SSR位点的EST序列筛选、引物设计和铁皮石斛EST-SSR位点的验证，最后获得117对铁皮石斛EST-SSR标记引物，探索出117对铁皮石斛EST-SSR引物的适宜的退火温度为45℃～63℃，铁皮石斛EST-SSR引物经DNA聚合酶链式反应应用于铁皮石斛基因组DNA，扩增并测序确认继而获得的117条含有微卫星位点的铁皮石斛DNA序列。本发明采用从EST序列开发铁皮石斛微卫星分子标记，具有简单、快速、稳定、高效和低成本的优点，本方法为石斛属植物的分子鉴定提供了有力的工具，有助于石斛属植物遗传学和分子生物学的进一步研究。
Description
技术领域
本发明属于植物DNA分子遗传标记技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法。
背景技术
石斛属(Dendrobium)是兰科(Orchidaceae)第二大属，多年生草本植物。是一类常用名贵中药，始载于《神农本草经》并被列入上品，全球有1000多种，我国约有76种，其中作为药用植物的近40种。
铁皮石斛(Dendrobium officinale)为石斛之极品，具有独特的药用价值，全草入药，有滋阴养胃，生津止渴的功效，在我国主要分布于华南及西南地区。
由于铁皮石斛生境独特，繁殖困难，再加上过度采收，一直是价格昂贵的紧缺药材。而铁皮石斛的市场需求量大，加上利益驱使，所以很多商家以次充好，利用其他石斛代替或充当铁皮石斛，导致目前市场上有大量的非纯正铁皮石斛。要保证科学与安全用药，铁皮石斛的品种和道地性鉴定是关键所在。
但是，石斛的生活环境复杂，多附生于树上和山石上，品种繁多，作为药材其来源及学名十分混乱，给石斛品种鉴别带来了很大的困难。
目前石斛的分类标准主要以形态鉴别为主，由于石斛属植物遗传背景复杂，其形态特征变化较大，某些形态非常相似，而在基因型上却表现出很大差异性。因此，从形态特征等表征分析，很难进行正确的物种鉴别。
分子标记鉴定是当今流行的比传统鉴定方法更科学和灵敏的重要方法之一。其中的微卫星标记(SSR，Simple Sequence Repeat)作为以DNA聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)技术和测序技术为基础的分子标记，是构建 高密度分子遗传图谱、分析物种分类与演化、染色体结构、遗传多样性、品种保护与纯度鉴定的有效工具，被认为是当前种内遗传变异研究中分辨率最高、揭示力最强的分子标记。
迄今，国内只有丁小余2009年利用构建和筛选微卫星富集文库的方法在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中开发12个SSR标记。国内外尚无通过铁皮石斛EST(Expressed Sequence Tag)序列开发大量微卫星分子标记相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，旨在解决目前国内外通过铁皮石斛EST序列开发微卫星分子标记的认识十分匮乏的问题。
本发明是这样实现的，一种铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，该铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法包括以下步骤：
步骤一、铁皮石斛EST序列的获得；
步骤二、含有微卫星EST序列的筛选；
步骤三、引物设计和微卫星位点验证。
进一步，含有微卫星EST序列的筛选方法为：
用计算机微卫星分析和在线微卫星位点分析，对所测序的EST序列进行筛选，获得含有微卫星位点的铁皮石斛EST序列。
进一步，引物设计和微卫星位点验证步骤如下：
引物设计方法为；在含有微卫星位点的EST序列上，设计DNA聚合酶链式反应扩增引物，设计引物的大小为20个碱基，扩增片段长度在100-300碱基，两条引物的退火温度相差不超过4℃；
微卫星位点验证的方法为：
1)DNA聚合酶链式反应扩增；
2)电泳分离和银染检测；
3)微卫星位点的再扩增和亚克隆。
进一步，DNA聚合酶链式反应的反应为：94℃预变性5分钟，32个循环中94℃变性40秒，引物退火温度下复性40秒，72℃延伸90秒，最后72℃延伸10分钟后4℃保存，从而获得扩增产物。
进一步，电泳分离和银染检测的方法为：
扩增产物中加变性缓冲液，用4％变性聚丙烯酰胺胶和1×TBE电泳缓冲液，在测序电泳槽中进行电泳，预电泳30分钟后上样100瓦恒功率电泳2小时后银染检测，银染方法过程主要如下：电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中；加入10％醋酸，在摇床上震荡30分钟进行固定，然后加入去离子水漂洗3次，每次5分钟；将凝胶置入0.1％硝酸银染色液的染色盘中，在摇床上震荡30分钟，然后用去离子水漂洗10秒钟；将凝胶置入0.32％碳酸钠的显色盘中，在摇床上震荡直至条带清晰以及条带数不再增加为止；加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗；去除凝胶和玻璃板上的水珠，放在乳白光灯箱上观察并用数码相机拍照。
进一步，微卫星位点的再扩增和亚克隆的具体的步骤如下：
割下聚丙烯酰胺凝胶中的银染信号最强的微卫星位点上的条带置于管中，加TE溶液后在PCR仪上94℃加热30分钟，然后离心取上清液作为二次PCR模板，在与相同的PCR反应体系和反应程序下，用位点相对应的微卫星引物进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，对目的条带用胶回收试剂盒进行回收，回收产物用pMD18-T载体进行16℃过夜连接，转化Top10感受态细胞后进行亚克隆，最后挑取阳性克隆培养，用质粒提取用试剂盒提取质粒后进行测序。
进一步，编号分别为WDM-1、WDM-2、WDM-3、WDM-4、WDM-5、WDM-6、WDM-7、WDM-8、WDM-9、WDM-10、WDM-11、WDM-12、WDM-13、WDM-14、WDM-15、WDM-16、WDM-17、WDM-18、WDM-19、WDM-20、WDM-21、WDM-22、WDM-23、WDM-24、WDM-25、WDM-26、WDM-27、 WDM-28、WDM-29、WDM-30、WDM-31、WDM-32、WDM-33、WDM-34、WDM-35、WDM-36、WDM-37、WDM-38、WDM-39、WDM-40、WDM-41、WDM-42、WDM-43、WDM-44、WDM-45、WDM-46、WDM-47、WDM-48、WDM-49、WDM-50、WDM-51、WDM-52、WDM-53、WDM-54、WDM-55、WDM-56、WDM-57、WDM-58、WDM-59、WDM-60、WDM-61、WDM-62、WDM-63、WDM-64、WDM-65、WDM-66、WDM-67、WDM-68、WDM-69、WDM-70、WDM-71、WDM-72、WDM-73、WDM-74、WDM-75、WDM-76、WDM-77、WDM-78、WDM-79、WDM-80、WDM-81、WDM-82、WDM-83、WDM-84、WDM-85、WDM-86、WDM-87、WDM-88、WDM-89、WDM-90、WDM-91、WDM-92、WDM-93、WDM-94、WDM-95、WDM-96、WDM-97、WDM-98、WDM-99、WDM-100、WDM-101、WDM-102、WDM-103、WDM-104、WDM-105、WDM-106、WDM-107、WDM-108、WDM-109、WDM-110、WDM-111、WDM-112、WDM-113、WDM-114WDM-115、WDM-116、WDM-117的微卫星核苷酸序列两端的引物的退火温度分别为45℃、45℃、48℃、48℃、50℃、50℃、50℃、51℃、51℃、51℃、51℃、51℃、55℃、52℃、52℃、52℃、52℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、59℃、59℃、59℃、59℃、59℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、61℃、61℃、61℃、62℃、63℃、63℃、63℃。
进一步，获得石斛微卫星标记引物的退火温度为45℃-63℃。
本发明提供的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，针对现有技术尚未开发大量铁皮石斛微卫星标记的现状，利用铁皮石斛EST文库测序及应用生物信息学方法，从EST序列开发出117个微卫星分子标记。相对于其他微卫星的开发方法，具有简单、快速、稳定、高效和低成本等优点，为铁皮石斛等石斛属植物的分子鉴定提供了有力的工具，同时有助于石斛属植物遗传学和分子生物学的进一步研究。
附图说明
图1是本发明实施例提供的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明提供的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
一，铁皮石斛EST序列的获得
本发明实施例通过自己构建铁皮石斛根的EST文库，完成测序和拼接工作获得大量的铁皮石斛EST序列。
二，铁皮石斛EST序列的筛选
利用计算机微卫星位点分析和在线微卫星位点分析，对EST序列进行筛选，得到含有微卫星位点的铁皮石斛EST序列。
三，引物设计和铁皮石斛EST-SSR位点验证
1，引物设计
在含有微卫星位点的EST序列上，利用在线引物设计软件Primer Premier 3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计DNA聚合酶链式反应扩增引物，设计引物的大小在20个碱基左右，扩增片段长度在100-300碱基，两条引物的退火温度相差不超过4℃。
2，微卫星位点验证
①DNA聚合酶链式反应扩增
通过PCR方法用设计好的微卫星标记引物扩增铁皮石斛基因组DNA，扩增反应体系和程序如下：反应体系为20微升，其中包括：10×缓冲液2微升，MgCl2(25毫摩尔/升)1.2微升，脱氧核糖核苷酸(10毫摩尔/升)0.6微升，DNA聚合酶(5单位/微升)0.25微升，DNA模板50-100纳克，引物(25毫摩尔/升)0.5微升。聚合酶链式反应的反应程序为：94℃预变性5分钟，32个循环(94℃变性40秒，各引物退火温度下复性40秒、72℃延伸90秒)，最后72℃延伸10分钟后4℃保存。从而获得扩增产物。各引物的退火温度详见表1。
表1 铁皮石斛EST-SSR标记的引物及其退火温度
②电泳分离和银染检测
扩增产物中加变性缓冲液，用4％变性聚丙烯酰胺胶(厚度0.4毫米)和1×TBE电泳缓冲液，在美国Bio-Rad公司生产的Sequi-Gen GT测序电泳槽中进行电泳，预电泳30分钟后上样100瓦恒功率电泳的2小时后银染检测，银染方法过程主要如下：电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中；加入10％醋酸，在摇床上轻微震荡30分钟进行固定，然后加入去离子水漂洗3次，每次5分钟；将凝胶置入0.1％硝酸银染色液的染色盘中，在摇床上轻微震荡30分钟，然后用去离子水漂洗10秒钟；将凝胶置入0.32％碳酸钠的显色盘中，在摇床上轻微震荡直至条带清晰以及条带数不再增加为止；加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗几分钟；去除凝胶和玻璃板上的水珠， 放在乳白光灯箱上观察并用数码相机拍照。
③微卫星位点的再扩增和亚克隆
根据微卫星位点的特有电泳条带特征初步判定电泳图片，并通过割胶测序进一步确认。具体的步骤是：割下聚丙烯酰胺凝胶中的银染信号最强的微卫星位点上的条带置于管中，加10微升TE溶液(10毫摩尔/升Tris-HC1，1毫摩尔/升EDTA，pH8.0)后在PCR仪上94℃加热30分钟，然后离心取上清液作为二次PCR模板，在与上述相同的PCR反应体系和反应程序下，用各位点相对应的微卫星引物进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，对目的条带用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN)进行回收，回收产物用pMD18-T载体(TAKARA)进行16℃过夜连接，转化Top10感受态细胞(TAKARA)后进行亚克隆，最后挑取阳性克隆培养，用质粒提取用试剂盒(QIAGEN Plasmid Mini Kit，QIAGEN)提取质粒后进行测序。
④测序确认
将上述所得的质粒，通过生工生物工程(上海)有限公司测序，分析序列中的SSR位点，确认为铁皮石斛的EST-SSR标记。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，该铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法包括以下步骤：
步骤一、铁皮石斛EST序列的获得；
步骤二、含有微卫星EST序列的筛选；
步骤三、引物设计和微卫星位的验证。
2.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，含有微卫星EST序列的筛选方法为：
用计算机微卫星分析和在线微卫星位点分析，对所测序的EST序列进行筛选，获得含有微卫星位点的铁皮石斛EST序列。
3.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，引物设计和微卫星位点验证步骤如下：
引物设计方法为：在含有微卫星位点的EST序列上，设计DNA聚合酶链式反应扩增引物，设计引物的大小为20个碱基，扩增片段长度在100～300碱基，两条引物的退火温度相差不超过4℃；
微卫星验证方法为：1)DNA聚合酶链式反应扩增；
2)电泳分离和银染检测；
3)微卫星位点的再扩增和亚克隆。
4.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，DNA聚合酶链式反应的反应为：94℃预变性5分钟，32个循环中94℃变性40秒，引物退火温度下复性40秒，72℃延伸90秒，最后72℃延伸10分钟后4℃保存，从而获得扩增产物。
5.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，电泳分离和银染检测的方法为：
扩增产物中加变性缓冲液，用4％变性聚丙烯酰胺胶和1×TBE电泳缓冲液，在测序电泳槽中进行电泳，预电泳30分钟后上样100瓦恒功率电泳2小时后银染检测，银染方法过程主要如下：电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中；加入10％醋酸，在摇床上震荡30分钟进行固定，然后加入去离子水漂洗3次，每次5分钟；将凝胶置入0.1％硝酸银染色液的染色盘中，在摇床上震荡30分钟，然后用去离子水漂洗10秒钟；将凝胶置入0.32％碳酸钠的显色盘中，在摇床上震荡直至条带清晰以及条带数不再增加为止；加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗；去除凝胶和玻璃板上的水珠，放在乳白光灯箱上观察并用数码相机拍照。
6.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，微卫星位点的再扩增和亚克隆的具体的步骤如下：
割下聚丙烯酰胺凝胶中的银染信号最强的微卫星位点上的条带置于管中，加TE溶液后在PCR仪上94℃加热30分钟，然后离心取上清液作为二次PCR模板，在与相同的PCR反应体系和反应程序下，用位点相对应的微卫星引物进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，对目的条带用胶回收试剂盒进行回收，回收产物用pMD18-T载体进行16℃过夜连接，转化Top10感受态细胞后进行亚克隆，最后挑取阳性克隆培养，用质粒提取用试剂盒提取质粒后进行测序。
7.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，编号分别为WDM-1、WDM-2、WDM-3、WDM-4、WDM-5、WDM-6、WDM-7、WDM-8、WDM-9、WDM-10、WDM-11、WDM-12、WDM-13、WDM-14、WDM-15、WDM-16、WDM-17、WDM-18、WDM-19、WDM-20、WDM-21、WDM-22、WDM-23、WDM-24、WDM-25、WDM-26、WDM-27、WDM-28、WDM-29、WDM-30、WDM-31、WDM-32、WDM-33、WDM-34、WDM-35、WDM-36、WDM-37、WDM-38、WDM-39、WDM-40、WDM-41、WDM-42、WDM-43、WDM-44、WDM-45、WDM-46、WDM-47、WDM-48、WDM-49、WDM-50、WDM-51、WDM-52、WDM-53、WDM-54、WDM-55、WDM-56、WDM-57、WDM-58、WDM-59、WDM-60、WDM-61、WDM-62、WDM-63、WDM-64、WDM-65、WDM-66、WDM-67、WDM-68、WDM-69、WDM-70、WDM-71、WDM-72、WDM-73、WDM-74、WDM-75、WDM-76、WDM-77、WDM-78、WDM-79、WDM-80、WDM-81、WDM-82、WDM-83、WDM-84、WDM-85、WDM-86、WDM-87、WDM-88、WDM-89、WDM-90、WDM-91、WDM-92、WDM-93、WDM-94、WDM-95、WDM-96、WDM-97、WDM-98、WDM-99、WDM-100、WDM-101、WDM-102、WDM-103、WDM-104、WDM-105、WDM-106、WDM-107、WDM-108、WDM-109、WDM-110、WDM-111、WDM-112、WDM-113、WDM-114、WDM-115、WDM-116、WDM-117的微卫星核苷酸序列两端的引物的退火温度分别为45℃、45℃、48℃、48℃、50℃、50℃、50℃、51℃、51℃、51℃、51℃、51℃、55℃、52℃、52℃、52℃、52℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、53℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、54℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、55℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、56℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、57℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、58℃、59℃、59℃、59℃、59℃、59℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、60℃、61℃、61℃、61℃、62℃、63℃、63℃、63℃。
8.如权利要求1所述的铁皮石斛EST-SSR引物的制备方法，其特征在于，获得石斛微卫星标记引物的退火温度为45℃-63℃。
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