CN103468709B - 霍山石斛的叶绿体基因组及种质鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及霍山石斛叶绿体基因组及利用其对霍山石斛近缘物种的种质鉴定方法。霍山石斛叶绿体基因组序列为：Seq ID NO.1。基于霍山石斛叶绿体基因组对其与近缘物种的鉴定方法主要步骤为：霍山石斛及其近缘物种的DNA提取，利用基于霍山石斛叶绿体基因组特异性片段设计的引物A，B进行PCR扩增，此PCR扩增可以特异性扩增出霍山石斛叶绿体基因序列，具有快速鉴别霍山石斛的特点。

Description

霍山石斛的叶绿体基因组及种质鉴定方法

技术领域

本发明涉及霍山石斛叶绿体基因组及利用其对霍山石斛近缘物种的种质鉴定方法。

背景技术

霍山石斛又称米斛，是兰科石斛属植物，主产于大别山区的安徽省霍山县，属于含有粘多糖为主的一种药用石斛，最早见载于清代赵学敏《本草钢目拾遗》，距今有200年以上历史。该书记载称：“霍石斛出江淮霍山，形似钗斛细小，色黄而形曲不直，有成球者，彼土人以代茶茗.，霍石斛嚼之微有浆、黏齿、味甘、微咸，形缩为真。”

霍山石斛以其嚼之无味，粘牙，无渣，有特殊疗效，而被誉为中华仙草之最，但其资源极度匮乏，是国家濒临灭绝的珍稀药材，国内市场长期以来有价无市。然而目前对它的理论研究还较少，同时市场上冠以“霍山石斛”类的枫斗产品大多并非霍山石斛，因此对于霍山石斛的理论研究及其与近缘物种的种植鉴定成为了当务之急。

叶绿体是植物进行光合作用特有的细胞器，为植物提供能量的主要来源，叶绿体拥有自己的基因组。完整的叶绿体基因组一般包含四个部分，大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSR)和两段反向重复区(IR)。叶绿体基因组的进化速率在核基因组和线粒体基因组的进化速率之间。早期的叶绿体基因组测序比较复杂，随着新一代测序技术的发展，为叶绿体基因组的研究提供了很大的便利。

叶绿体基因组是追溯叶绿体起源与演化历程的重要信息来源。通过比较进化基因组学分析，一方面，可以帮助确定叶绿体基因组与现在哪类蓝藻的亲缘关系最接近，从而推测历史上内共生发生的条件和可能的过程；另一方面可以确定在叶绿体演化过程中，哪些基因发生了丢失，哪些基因转移到了核基因组，推断基因丢失和转移的根源。

叶绿体基因组分析是解决植物系统发育难题的重要途径。叶绿体基因组可以提供基因组结构和DNA序列两个层次的数据用于系统发育分析，对某些疑难系统发育问题的解决提供了关键的证据。

叶绿体基因组还可以用来为物种鉴定提供重要理论依据。通过对相近物种的叶绿体基因组比较，寻找到变异较高的区域，设计相应的PCR引物，利用PCR扩增技术对不同物种进行快速鉴定。

因此，对霍山石斛叶绿体基因组的序列测定，不仅可以为其起源与演化、系统发育地位的研究提供帮助，还可以为霍山石斛与其近缘物种的种质鉴定提供重要的理论依据。

发明内容

珍稀中草药霍山石斛的理论研究及其与近缘物种有效快速的种质鉴定亟需展开，为了为其理论研究和种质鉴定提供有利的理论依据，本发明提供了霍山石斛的叶绿体基因组及利用其对霍山石斛近缘物种的种质鉴定方法。

本发明所涉及的有霍山石斛叶绿体基因组序列Seq ID NO.1和基于叶绿体基因组对霍山石斛近缘物种的种质鉴定方法。

霍山石斛叶绿体基因组,其序列如Seq ID NO.1所示。本发明还公开了基于上述叶绿体基因组对霍山石斛近缘物种的种质鉴定方法，具体操作，包括以下步骤：

(1)新鲜材料DNA提取：液氮充分研磨材料，利用CTAB法提取霍山石斛及其近缘物种DNA。

(2)以Seq ID NO.3和4的序列为引物，利用所提取的DNA为模板，进行扩增PCR扩增；得到如Seq ID NO.2所示扩增产物的，为霍山石斛。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应体系特征为：制备20ulPCR反应体系，在200ulPCR管中加入如下量的物质：Taq酶0.2ul，dNTP 1.4ul，Mg2+1.4ul，10×PCR Buffer2.0ul，引物2uM各2ul，已提取的DNA+水共11ul；

扩增程序条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性45秒，60℃退火1分钟，68℃延伸4分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后再72℃充分延伸7分钟。

具体的PCR过程为：利用所提取的DNA为模板，在96‐Well Thermal Cycler型PCR仪上进行扩增PCR扩增；

反应体系特征为：制备20ulPCR反应体系，在200ulPCR管中加入如下量的物质：Taq酶0.2ul，dNTP 1.4ul，Mg2+1.4ul，10×PCR Buffer 2.0ul，引物A，B(2uM)各2ul，已提取的DNA+水共11ul。

引物A ACTAAGTGCTCTGACCATGCATCGG(Seq_ID NO.3)

引物B CATCAACGATCATTGACTGATTTATCAA(Seq_ID NO.4)

扩增程序条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性45秒，60℃退火1分钟，68℃延伸4分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后再72℃充分延伸7分钟。

此PCR扩增可以特异性扩增出霍山石斛叶绿体基因序列，具有快速鉴别霍山石斛的特点。扩增出的序列如序列表Seq_ID NO.2所示。

本发明的优势：

霍山石斛为我国特有濒危珍稀中药材，霍山石斛因其质量上乘而驰名中外，多年来市场上霍山石斛有名无实，有价无市，资源接近枯竭。然而目前对于霍山石斛的理论研究及保护研究仍然较少，本发明对霍山石斛叶绿体基因组的测序，可以为其起源与演化、系统发育地位的研究提供帮助。

现在国内外市场上，凡冠以“霍山石斛”、“霍斗”或“野生金霍斛”等名称的一些枫斗产品，均非用真正的霍山石斛加工而成，多数是铜皮石斛、铁皮石斛、扁黄草石斛和钩状石斛的仿冒品，因此对霍山石斛的种质鉴定显得尤为重要。然而目前对于霍山石斛的鉴定主要停留在使用一些分子标记或是构建一些指纹图谱的鉴定方法，这类方法鉴定起来速度较为缓慢。而本发明基于叶绿体基因组序列，寻找到霍山石斛叶绿体基因组中特异性片段，基于此片段设计特异性引物，可以特异性的扩增出霍山石斛叶绿体基因组序列，从而达到快速鉴别的目的。

附图说明

图1是霍山石斛鉴定PCR后经琼脂糖凝胶电泳检测后结果

注：Marker为Takara公司生产的DL 2,000DNA Marker，从上至下片段大小依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp其中扩增出条带的4种石斛分别为：金钗石斛(13‐15)、霍山石斛(19‐21)、细茎石斛(22‐24)以及铁皮石斛(25‐26)。

具体实施方式

以下通过实验例来进一步说明本发明中对霍山石斛的鉴定。

实施例一

目前市场上霍山石斛的混伪品主要为霍山当地产的细茎石斛、铁皮石斛为主，因此本实验主要选取霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛以及其它6种石斛品种(金钗石斛、齿瓣石斛、粉花石斛、球花石斛、细叶石斛和曲茎石斛)提取DNA，并利用本发明所设计的特异性引物A、B和PCR扩增方法对9种石斛进行PCR扩增。

扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测后，结果如图1所示，霍山石斛通过扩增后跑胶其大小约为2200bp左右(测序结果为Seq_ID NO.2)，金钗石斛片段大小为750bp左右，细茎石斛片段大小为1000bp左右，铁皮石斛片段大小为2000bp左右。因此可以通过片段大小来鉴定是否为霍山石斛。

Claims (2)

1.一种霍山石斛近缘物种的种质鉴定方法，其特征在于：

（1）提取待检样品的DNA：液氮充分研磨待检的新鲜样品，用CTAB法提取物种DNA；

（2）以Seq ID NO.3和4的序列为引物，利用所提取的DNA为模板，进行扩增PCR扩增；得到如Seq ID NO.2所示扩增产物的，为霍山石斛。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应体系特征为：制备20μl PCR反应体系，在200μl PCR管中加入如下量的物质：Taq酶0.2μl，dNTP 1.4μl，Mg²⁺ 1.4μl，10×PCR Buffer 2.0μl，引物2μM各2μl，已提取的DNA+水共11μl；

扩增程序条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性45秒，60℃退火1分钟，68℃延伸4分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环25次，最后再72℃充分延伸7分钟。