CN104830971A - 一种西洋参分子身份证及鉴定方法 - Google Patents

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宋经元
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陈士林
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Abstract

本发明涉及一种西洋参分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将西洋参与形态特征相似的伪品区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现西洋参原植物、药材、种子、种苗、粉末和混淆品的快速、准确鉴定。

Description

一种西洋参分子身份证及鉴定方法
技术领域
本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种西洋参分子身份证及鉴定方法。
背景技术
西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根，具有补气养阴，清热生津的功效，用于气虚阴亏、虚热烦倦、咳喘痰血、内热消渴、口燥咽干等症。而人参与西洋参同属于五加科人参属，二者性状相似，以传统鉴定方法很难将两者区别。两者在药性和功效上有很大差别，西洋参性凉，养阴降火，益气生津，镇静解热；而人参性微温，大补元气，复脉固脱，兴奋中枢神经。实证、热证忌用人参，而中阳衰微胃有寒湿者忌用西洋参。由于西洋参药材价格昂贵，市场上常出现其混伪品，如人参加工伪制品、桔梗科植物轮叶沙参Adenophora tetraphylla(Thunb.)Fisch.或沙参Adenophora stricta Miq.的干燥根、伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。由于西洋参与人参等近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别有较大困难。本研究在大样本量数据分析的基础上，开发了一个27bp的西洋参特异的分子身份证序列，BLAST结果表明，此段序列为西洋参所特有，可以用来鉴定西洋参原植物、药材、种子、种苗、粉末和混淆品。
发明内容
本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷，提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的西洋参鉴定方法。
为达到以上目的，本发明的发明人在对大量的样品的筛选过程中，寻找出能够将正品西洋参与混伪品进行精确区分的正品西洋参的特异分子身份证序列，并提供了对西洋参鉴别较为快速，简便，廉价的方法。
具体的，本发明提供了一种西洋参分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
可选的，在本发明中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列占所述西洋参分子身份证总核苷酸序列的比例为10％。
优选的，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种西洋参的鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身份证时，鉴定待测样品中存在西洋参成分或为西洋参。
可选的，所述方法包括如下步骤：
1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。
本发明对于PCR所使用的引物无特别的限制，只要能够对所述分子身份证进行扩增即可，为了获得最佳的鉴定效果，所述PCR扩增使用的引物为：
ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′(SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，
ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′(SEQ IDNo.3.5所示的核苷酸序列)。
可选的，所述PCR扩增的反应程序为：
可选的，所述PCR扩增的反应体系为：
PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
其中，所述待测样品包括西洋参及同属近缘种及伪混品。
所述待测样品的形式可以为植株、药材、种子、种苗，利用本发明所提供的方法可以对因加工而难以通过形态学鉴定进行区分的检测对象进行准确的鉴别，例如可以对粉末形式的样品进行鉴定。
本发明提供了所述方法或所述的分子身份证在鉴定西洋参中的应用。
利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将西洋参与形态特征相似的伪品区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的西洋参任何样品。因此，能够实现西洋参原植物、药材、种子、种苗、粉末和混淆品的快速、准确鉴定。
附图说明
图1西洋参种内align图
图2为西洋参(P.quinquefolium)特异分子身份证序列和同属其它物种不同单倍型的比对图；
包含5‘-ATCACTCCTTTGCGGGAGTCGAGGCGG-3’的比对图。
图3所示为西洋参与混伪品构建NJ树结果。
序列表中列出的为西洋参(P.quinquefolium)的分子身份证序列。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
实施例1用于说明西洋参药材原料的鉴定方法
1)从黑龙江穆棱市、宁安市，吉林集安市、通化市、靖宇县、抚松县，辽宁新宾县、清原县，北京怀柔区，山东文登市，河北安国药市，安徽亳州药市，加拿大和美国威斯康星州共收集到西洋参P.quinquefolium共计40份，混淆品人参P.ginseng、轮叶沙参A.tetraphylla或沙参A.astricta的干燥根、伞形科植物白芷A.dahurica或杭白芷A.dahurica var.formosana样品12份，分别取20mg药材，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
2)PCR扩增
引物序列为ITS2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。
25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
3)测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物为ITS2F和ITS3R。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1(CodonCodeCo.,Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30。最后进行序列拼接，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的西洋参ITS2基因间隔区序列，如图1所示。从GenBank中下载药典规定的五种人参属药用植物及西洋参混伪品的ITS/ITS2序列，同样根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。
5)同属近缘种序列比对
用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中西洋参ITS序列进行比对，如图2所示，所有西洋参样品的ITS2序列(SEQ ID No.1)包含ATCACTCCTTTGCGGGAGTCGAGGCGG，而其他人参属物种及混伪品序列不包含此段序列，表明此段序列可特异性地用于西洋参的鉴定。此段序列存在于所有实验数据及GenBank数据中，由于数据较多，图3仅显示了部分序列比对结果。西洋参ITS2序列无种内变异。
6)构建系统发育树(NJ树)
由于西洋参的伪品桔梗科植物轮叶沙参A.tetraphylla或沙参A.astricta的干燥根、伞形科植物白芷A.dahurica或杭白芷A.dahuricavar.formosana的ITS2序列与西洋参的相差较大，可直接构建NJ树将其区分。将完整的西洋参及上述混淆品的ITS2序列导入MEGA 5软件中进行比对，用比对结果构建以K2P为模型的NJ树，结果如图3所示。
实施例2西洋参饮片的鉴定
采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以西洋参饮片(西洋参根切片)为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到西洋参分子身份证。并且序列对比发现，西洋参饮片DNA的ITS2序列(SEQ ID No.1)包含ATCACTCCTTTGCGGGAGTCGAGGCGG。
实施例3西洋参粉末的鉴定
采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以西洋参粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到西洋参分子身份证，并且因西洋参ITS2无种内变异，可以实现对西洋参粉末的鉴定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.西洋参分子身份证，其特征在于，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分子身份证，其特征在于，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.一种西洋参的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1-2中任意一项所述的分子身份证。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测扩增片段中是否存在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
6.权利要求1-2所述的分子身份证序列或权利要求3-5中任意一项所述的鉴定方法在西洋参鉴定中的应用。
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