CN104611445A - 肉桂快速分子鉴定方法 - Google Patents

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杨培
韩建萍
陈士林
宋经元
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Abstract

本发明公开了一种肉桂快速鉴定方法，其包括如下步骤：1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示的序列；2)对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T，则鉴定为肉桂，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为C，则鉴定为不是肉桂。本发明能够实现肉桂原植物及其近缘种、药材、生饮片、粉未和混淆品的快速、准确鉴定。

Description

肉桂快速分子鉴定方法
技术领域
本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNP鉴定肉桂的方法。
背景技术
肉桂Cinnamomi Cortex为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮。肉桂的嫩枝(桂枝)亦供药用，为《中华人民共和国药典》2010年版收载品种。历代本草中肉桂均列为上品，认为其有补火助阳，引火归源，散寒止痛，活血通经等作用。2002年，中华人民共和国卫生部公布《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中，对药食同源物品做出了具体规定，其中肉桂被列入既是食品又是药品的物品名单。肉桂作为餐桌上常见的调味品，也是常见的食品添加剂和香料。在工业生产中，肉桂因其桂皮酸等物质含量丰富，常作为化妆品，香皂，杀虫剂等的添加剂和矫味剂的主要来源。樟科植物肉桂是药典中肉桂药材的唯一来源，近年来，市场上常出现以肉桂同科植物阴香C.burmanni Blume等冒充肉桂出售的情况，在外观形状颜色及气味等各方面特征与肉桂相似，容易造成混用现象。柴桂C.tamala Nees et Eberm，Gamble大叶桂C.iners Reinw.ex Bl，Miq.，天竺桂C.japonicum Sieb等常作为肉桂的替代品，一般不做正品使用。锡兰肉桂C.zeylanicum B1.Bijdr.，亦称斯里兰卡桂，原产斯里兰卡，是一种古老名贵的香料植物，在我国海南、广东、广西和云南等地有种植。美国市场上习惯以锡兰肉桂作为原料。国内部分饮料，及名贵香烟中也有加入锡兰肉桂的提取物如丁香酚等。因此，对肉桂及其近缘物种进行准确鉴定是规范用药，保障肉桂类食品安全规范的必要步骤。
发明内容
本发明第一个目的在于提供肉桂快速鉴定用SNP。
本发明第二个目的在于提供肉桂快速鉴定用SNP在肉桂鉴定用的应用。
本发明第三个目的在于提供肉桂快速鉴定方法
本发明提供的肉桂快速鉴定鉴定用SNP，自核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T或C。
本发明提供的SNP可用于鉴定肉桂，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T，则鉴定为肉桂；如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为C，则鉴定为不是肉桂。
本发明提供的肉桂快速鉴定方法，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端psbA和trnH基因区，获得psbA-trnH基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起80位的碱基情况。
其中，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T，278-279无缺失，则鉴定为肉桂；如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为C，则鉴定为不是肉桂。
本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的肉桂任何样品。因此，能够实现肉桂原植物与近缘种、药材、生饮片、粉末与混淆品的快速、准确鉴定。
附图说明
图1所示为psbA-trnH序列的扩增结果，其中1-21为肉桂，22-33为阴香，34-36为大叶桂，37-39为川桂，40-42为锡兰肉桂，43-45为天竺桂，46-48为香桂，49-51为柴桂，CK为阴性对照
图2所示为肉桂和其他物种psbA-trnH序列的比对结果。其中，从5’端起第80位，肉桂为T，其他物种为C。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1)从不同产地收集的27份肉桂和37份其他物种样品，分别取35mg药材，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA。
表1 肉桂和其近缘种及混伪品样品
2)PCR扩增
引物序列为psbA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′，trnH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。
25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(～30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
3)测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 4.2.7(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5，端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30(Chen et al.2010)。最后进行序列拼接，去除序列两端psbA和trnH基因区，获得肉桂和其近缘种及混伪品的psbA-trnH基因间隔区序列。
5)序列比对
用DNAman软件对测序并拼接后的各个样品的psbA-trnH基因间隔区序列进行比对，结果如图2所示。从图2中可以看出，共获得个SNP位点，所有肉桂样品的psbA-trnH基因间隔区序列(SEQ ID No.1)的第80位为T；而所有其他物种样品的psbA-trnH基因间隔区序列的第80位为C，表明这1个SNP位点可特异性地用于鉴定肉桂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例2肉桂饮片的鉴定
基本同实施例1，所不同的是以肉桂饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的1个SNP位点，并且序列对比发现，肉桂饮片DNA的psbA-trnH基因间隔区序列(SEQ ID No.1)的第80位为T。
实施例3肉桂粉末的鉴定
基本同实施例1，所不同的是以肉桂粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的1个SNP位点，并且序列对比发现，肉桂粉末DNA的psbA-trnH基因间隔区序列(SEQ ID No.1)的第80位为T。

Claims (4)

1.肉桂鉴定用SNP标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T或C。
2.权利要求1所述的SNP在鉴定肉桂中的应用，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T，则鉴定为肉桂；如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为C，则鉴定为不是肉桂。
3.肉桂快速鉴定方法，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端psbA和trnH基因区，获得psbA-trnH基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位的碱基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为T则鉴定为肉桂；如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第80位为C，则鉴定为不是肉桂。
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