CN106591459B - 快速鉴定屏边三七及西洋参等人参属中药的snp标记、试剂盒及方法 - Google Patents

快速鉴定屏边三七及西洋参等人参属中药的snp标记、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于快速鉴定屏边三七及其混伪品的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该序列的5’端起第88位为A和/或第117位为C。本发明还涉及一种用于快速鉴定屏边三七及其混伪品的试剂盒，包含用于扩增得到SEQ ID NO.1所示序列的引物。本发明进一步涉及一种快速鉴定屏边三七及其混伪品的方法，该方法以待鉴定样品的基因组DNA为模板，扩增SEQ ID NO.1所示序列，检测所得扩增片段中5’端起第88位碱基和第117位碱基，从而判断待鉴定样品为屏边三七或其混伪品。本发明提供的方法可以准确的将屏边三七与形态特征相似的混伪品区分开，该方法适应性广，能检测所有能提取出DNA的屏边三七任何样品，能够实现屏边三七的快速、准确鉴定。

Description

快速鉴定屏边三七及西洋参等人参属中药的SNP标记、试剂盒 及方法
技术领域
本发明涉及中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用一种特异性的快速鉴定屏边三七及其混伪品的SNP标记、试剂盒及方法。
背景技术
屏边三七是五加科植物屏边三七Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng的干燥根。根茎富含皂甙，主要用于治疗肝肾不足所致腰膝酸软无力、肢体麻木、筋骨拘挛等症。屏边三七又名野三七、香刺、土三七、竹节七、白三七，与人参属三七、人参、西洋参、竹节参、珠子参、姜状三七、羽叶三七、狭叶竹节参等性状相似，但与这些人参属植物化学成分有一定差异，功效不同，价格相差甚大。屏边三七经常在市场上被当做人参、西洋参、三七、竹节参、姜状三七等人参属药材使用。传统的形态学鉴定很难将其区分开来，尤其对于药材粉末、饮片、中成药等鉴定有很大困难。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是一种稳定、快速的物种鉴定方法，较RAPD、SCAR、PCR-RFLP等方法操作简便，对实验人员要求低。现有的关于人参属的SNP分子鉴定中未涉及屏边三七，本发明为首次运用SNP方法鉴定屏边三七。
发明内容
本发明第一个目的在于提供一种快速鉴定屏边三七及其混伪品的SNP标记。本发明提供的屏边三七鉴定用SNP标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。其中，SEQ ID No.1所示序列中只存在两个SNP。SEQ ID NO.1序列5’端起第88位屏边三七为A，其混伪品为G；第117位屏边三七为C，其混伪品为A。
本发明提供的SNP可用于快速鉴定屏边三七及其混伪品。具体而言，如果待鉴定样品SEQ ID NO.1序列的5’端起第88位为A，和/或第117位为C，则鉴定为屏边三七；如果待鉴定样品SEQ ID NO.1序列的5’端起第88位不为A且第117位不为C，则鉴定为屏边三七的混伪品。
本发明第二个目的在于提供一种快速鉴定屏边三七的试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增得到SEQ ID NO.1所示序列的引物。
在实际应用时，所述快速鉴定屏边三七的试剂盒中包含以下用于待鉴定样品基因组DNA扩增的引物：
正向PsbA1F：5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACAT-3’；
反向TrnH1R：5’-TGTTCTATCAAGAGGGCGGTATT-3’。
本发明提供的试剂盒及引物特异性高，扩增效率高，能检测所有能提取出DNA的屏边三七任何样品。
本发明提供的所述SNP标记或所述试剂盒均可应用于快速鉴定屏边三七及其混伪品。
本发明所述屏边三七具体为：屏边三七的原植物、原料药材、种子、粉末、饮片或中成药。
本发明所述混伪品主要是人参属中药，优选包括人参属三七、人参、西洋参、竹节参、珠子参、姜状三七、羽叶三七和/或狭叶竹节参。
本发明第三个目的在于提供一种快速鉴定屏边三七的方法，包括以下步骤：
(1)以待鉴定样品的基因组DNA为模板，扩增SEQ ID NO.1所示序列，得扩增产物；
(2)对所述扩增产物进行测序，对测序后所得序列进行处理，获得完整的扩增片段，检测所述扩增片段的5’端起第88位碱基和第117位碱基；
若所述扩增片段的5’端起第88位碱基为A和/或第117位碱基为C，则判断待鉴定样品为屏边三七；若所述扩增片段的5’端起第88位碱基不为A且第117位碱基不为C，则判断待鉴定样品为屏边三七混伪品。
在实际操作中，所述步骤(1)为可采用以下引物进行DNA扩增：
正向PsbA1F：5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACAT-3’；
反向TrnH1R：5’-TGTTCTATCAAGAGGGCGGTATT-3’。
为了将屏边三七与其混伪品准确区分开，提高检测结果的准确性，本发明步骤(2)所述对测序后所得序列进行处理的方法优选包括以下步骤：
(a)去掉测序后所得序列两端的低质量部分和引物区；
(b)对经步骤(a)处理后的序列进行剪切，具体为：以20bp为窗口从序列5’端向3’端滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除其中一个Q值小于20的碱基，窗口继续滑动；如果窗口内Q值小于20的碱基数目小于或等于2个，则窗口停止滑动；
以20bp为窗口从序列3’端向5’端滑动，按照与所述从序列5’端向3’端相同的方法进行操作；
(c)将经步骤(b)处理后的正向、反向序列进行拼接，使所述正向、反向序列有大于50％的重叠区,获得完整的扩增片段。
经步骤(b)处理后，正向序列和反向序列均大于100bp；和/或，正向序列和反向序列所含的低质量碱基数均小于1％；和/或，正向序列和反向序列均小于剪切前原始序列长度的50％；和/或，正向序列和反向序列的平均Q值均大于等于30。
上述对测序后所得序列进行处理可采用CodonCode Aligner3.7.1(CodonCodeCo.,Germany)进行。
本发明所提供的SNP标记、试剂盒及方法可以准确的将屏边三七与形态特征相似的人参属三七、人参、西洋参、竹节参、珠子参、姜状三七、狭叶竹节参区分开，且适应性广，能够实现屏边三七原植物、药材、种子、粉末、饮片、中成药与屏边三七混伪品的快速鉴定。
附图说明
图1为引物psbA1F-trnH1R扩增胶图。
图2为屏边三七及混伪品的种间变异图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：屏边三七药材原料的鉴定方法
从不同产地收集人参属样品，各样品代表的具体药材和采药地点如表1所示。分别取25mg的样品在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
表1：人参属样品
序号 样品编号 药材 采样地点
1 RS1-6 人参 吉林省抚松县
2 BB1-6 竹节参 湖北恩施
3 R1-3 竹节参 日本
4 ZZ1-6 珠子参 甘肃
5 XZ1-6 珠子参 西藏林芝
6 JZ1-5 姜状三七 缅甸
7 XY1-2 狭叶竹节参 四川峨眉山
8 PB1-13 屏边三七 云南
PCR扩增
引物序列为PsbA1F：5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACAT-3’；TrnH1R：5’-TGTTCTATCAAGAGGGCGGTATT-3’，由上海美吉生物医药科技有限公司(北京)合成。
PCR扩增程序为：
Figure BDA0001192302480000051
上述PCR反应体系为：
PCR Buffer(10×)2.5u L，Mg2+2u L(25mmol/L),dNTPs混合物2u L(2.5mmol/L),引物各1u L(2.5umol/L),模板DNA 2u L(约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25u L,进行PCR扩增。
琼脂糖凝胶电泳
分别取3u L的PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果，扩增产物均为350bp左右。(如图1所示)
测序
PCR产物直接送到上海美吉生物医药科技有限公司(北京)测序。测序引物同PCR引物。为确保序列可靠性，进行正方双向测序。
序列拼接
本实施例应用软件CodonCode Aligner 3.7.1(CodonCode Co.,Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行序列质量评估及预处理，即去掉测序结果两端地址两部分，并对剩余部分进行质量评估。以20bp的窗口分别从序列5’端向3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。由3’端重复此操作。剪切后的正向和反向序列应大于100bp，正反向序列低质量碱基数小于1％，剪切后的序列小于原始序列长度50％，平均Q值大于等于30。对正反测序结果进行拼接，使正反向序列有大于50％重叠区。
序列比对
用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品进行比对，共获得2个SNP位点，所有的屏边三七SEQ ID NO.1序列5’端起第88位为A，其他物种(人参、西洋参、竹节参、珠子参、姜状三七、狭叶竹节参)为G；屏边三七第117位为C，其他物种(人参、西洋参、竹节参、珠子参、姜状三七、狭叶竹节参)为A。(如图2所示)
实施例2：屏边三七饮片的鉴定方法
与实施例1相比，区别仅在于：以屏边三七饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性的检测到上述的2个SNP位点。序列比对时发现，屏边三七饮片SEQ ID NO.1序列5’端起第88位碱基为A，第117位碱基为C。
实施例3：屏边三七粉末的鉴定
与实施例1相比，区别仅在于：以屏边三七粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性的检测到上述的2个SNP位点。序列比对时发现，屏边三七饮片SEQ ID NO.1序列5’端起第88位碱基为A，第117位碱基为C。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 快速鉴定屏边三七及西洋参等人参属中药的SNP标记、试剂盒及方法
<130> KHP161118481.4Q
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213> 屏边三七PsbA-TrnH间隔区序列
<400> 1
ccgcccccct actattcttt tccttacgtt tcaaaagatt aaatttttac cattcatcat 60
tatttctttc ttatctttct tattttcgag ataaaaatat taagtattaa ctaagtaaaa 120
agtccaacat ttttatcttt tcttttaaaa aaatacttcc caaaagataa agattgggaa 180
gaagtagcta aattatagat taatgattaa tacagaacga aagcatgata ctcactcatg 240
aaccaaccga taaaaataaa acgacgtttc tttaaataaa ttaaataaat ttaaagaaac 300
taggtaagta aaatactact aaatataaaa aggagc 336
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgccttgatc cacttggcta cat 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgttctatca agagggcggt att 23

Claims (8)

1.一种快速鉴定屏边三七及其混伪品的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记由如下所示引物对扩增得到：
正向PsbA1F：5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACAT-3’；
反向TrnH1R：5’-TGTTCTATCAAGAGGGCGGTATT-3’；
其中，扩增得到的核苷酸序列的5’端起第111位为A和/或第140位为C。
2.权利要求1所述SNP标记在快速鉴定屏边三七及其混伪品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述屏边三七具体为：屏边三七的原植物、原料药材、种子、粉末、饮片或中成药。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述混伪品为人参属中药。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述混伪品包括人参属三七、人参、西洋参、竹节参、珠子参、姜状三七、羽叶三七和/或狭叶竹节参。
6.一种快速鉴定屏边三七及其混伪品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以待鉴定样品的基因组DNA为模板，以以下引物对为引物进行扩增得扩增产物：
正向PsbA1F：5’-TGCCTTGATCCACTTGGCTACAT-3’
反向TrnH1R：5’-TGTTCTATCAAGAGGGCGGTATT-3’；
（2）对所述扩增产物进行测序，对测序后所得序列进行处理，获得完整的扩增片段，检测所述扩增片段的5’端起第111位碱基和第140位碱基；
若所述扩增片段的5’端起第111位碱基为A和/或第140位碱基为C，则判断待鉴定样品为屏边三七；若所述扩增片段的5’端起第111位碱基不为A且第140位碱基不为C，则判断待鉴定样品为屏边三七混伪品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述对测序后所得序列进行处理的方法具体为：
（a）去掉测序后所得序列两端的低质量部分和引物区；
（b）对经步骤（a）处理后的序列进行剪切，具体为：以20bp为窗口从序列 5’端向 3’端滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除其中一个Q值小于20的碱基，窗口继续滑动；如果窗口内Q值小于20的碱基数目小于或等于2个，则窗口停止滑动；
以20bp为窗口从序列 3’端向 5’端滑动，按照与所述从序列 5’端向 3’端相同的方法进行操作；
（c）将经步骤（b）处理后的正向、反向序列进行拼接，使所述正向、反向序列有大于50%的重叠区, 获得完整的扩增片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，经步骤（b）处理后，正向序列和反向序列均大于100 bp；
和/或，正向序列和反向序列所含的低质量碱基数均小于1%；
和/或，正向序列和反向序列均小于剪切前原始序列长度的 50%；
和/或，正向序列和反向序列的平均Q值均大于等于30。
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