CN107400718B - 基于Real-timeARMS-qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 - Google Patents

基于Real-timeARMS-qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Real‑time ARMS‑qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组和方法，该引物组包括两对预扩增引物和两对ARMS特异性引物；该鉴定方法包括：待检样品DNA的提取；预扩增；Real‑time ARMS‑qPCR扩增。本发明基于Real‑time ARMS‑qPCR鉴定霍山石斛的引物组可有效地进行扩增，通过该引物组采用基于ARMS技术结合实时荧光定量PCR方法，可以快速且精准地对霍山石斛及其枫斗制品进行鉴定，建立了一种准确、灵敏、快速、稳定、可重复的霍山石斛及其枫斗制品的鉴定方法。

Description

基于Real-timeARMS-qPCR鉴定霍山石斛及枫斗制品的引物组 和方法
技术领域
本发明涉及霍山石斛及其枫斗制品鉴定，具体涉及一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组及其鉴定方法。
背景技术
霍山石斛又称米斛、霍石斛等，属兰科石斛属多年生草本植物，为我国特有濒危珍稀石斛品种，因其质量上乘而驰名中外。现代药理学研究表明：霍山石斛具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗白内障等极高药用价值。由于霍山石斛自然状态下萌芽率低、生长缓慢，加上长期过度采挖，其野生资源已濒临灭绝，导致市场上霍山石斛伪品很多。石斛原植株及枫斗产品形态相似。近年来霍山石斛及其枫斗制品的伪品很多，且多为其他枫斗类石斛，因此对霍山石斛及其枫斗制品的准确鉴定显得尤为重要。传统形态、理化鉴定方法准确性低，而传统的分子鉴定技术如RAPD、Ap-PCR等又具有可重复性差、稳定性差、用时较久、实验条件苛刻等缺点然而。亟需建立一种准确、灵敏、快速、稳定的鉴定方法。
实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,rt-qPCR)是在PCR基础上发展起来的具有高灵敏性的核酸定量技术。其原理是利用荧光信号实时监测整个PCR进程并对特异性产物的量进行分析。目前研究表明可以通过荧光阈值(threshold)和Ct值(样本域值循环数)对物种进行有效鉴定。突变扩增阻滞体系(Amplification RefractoryMutation System,ARMS)指在特异性引物的3’近末端引入一个或两个人为的错配碱基以增强鉴定反应的特异性。其原理是3’末端错配的引物以低于配对引物的速度延伸，待鉴别物种的片段被扩增出来而非目的物种的DNA不能扩增，从而达到鉴定的目的。Real-timeARMS-qPCR技术将ARMS与rt-qPCR技术相结合，可以对突变体或待测种进行定量、定性检测，具有准确性高、重复性好等优点。目前已广泛用于病毒突变体、线粒体DNA突变位点等方面的鉴别。作为一种珍稀中草药，霍山石斛及其枫斗制品的快速有效鉴定亟需展开。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组及其鉴定方法。通过该引物组采用ARMS技术结合rt-qPCR可以快速且精准地对霍山石斛及其枫斗制品进行鉴定。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组，包括两对预扩增引物和两对ARMS特异性引物，所述两对预扩增引物：第一对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.1和2所示，第二对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.3和4所示；所述两对ARMS特异性引物：第一对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.5和6所示，第二对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.7和8所示。
石斛属植物经过烘干等过程加工为枫斗类制品后，其多糖含量显著增加，使得DNA提取的得率十分低，同时加工过程也增加了DNA损伤，导致获得的DNA片段完整度较低，难以满足常规PCR反应。本发明通过对石斛属植物大量核基因组及绿体基因组序列片段的比对及序列变异度的计算分析，获得了一些具有高序列变异度的片段，并从中筛选出含有霍山石斛特有变异位点的片段。基于含有霍山石斛特有变异位点的片段两侧的保守序列进行引物设计，并进行PCR扩增验证，最终获得扩增效率最高的DNA片段，其扩增引物序列为Seq IDNO.1-4。该引物可以准确、有效的对损伤后的DNA进行扩增，提高目标片段DNA浓度，便于后续鉴定分析。
而基于霍山石斛特有变异位点设计的特异性引物，可以有效的在预扩增后的石斛属植物及枫斗类制品DNA中特异性扩增出霍山石斛。同时，本发明利用ARMS技术对引物对进行改进，在引物序列末端第2-4个碱基位置处随机引入错配碱基，经反复实验对比，获得效果最佳的ARMS特异性引物Seq ID NO.5-8。该引物可以更加快速、准确、稳定的鉴定霍山石斛及其枫斗制品。
Seq ID NO.1：
5’-GGGCAATCCTGAGCCAAATC-3’
Seq ID NO.2：
5’-AGAGGGACTTGAACCCTCACGA-3’
Seq ID NO.3：
5’-CCACAGGATCAGAAGTAGTGG-3’
Seq ID NO.4：
5’-TCCTAGATGTGAAAAGAGGC-3’
Seq ID NO.5：
5’-TGTTCTAACGAATGAAATTGCCTG-3’
Seq ID NO.6：
5’-AGATAGATTCTTAATCTAATGCTG-3’
Seq ID NO.7：
5’-CATAATAAATATGTCGAAATTCTTTGGTT-3’
Seq ID NO.8：
5’-ACTCATTCACTGAGTAAAGGATTGAAGTA-3’。
如本发明所述的一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)待检样品DNA的提取：液氮充分研磨待检样品，提取总DNA；
(2)预扩增：以上述DNA为模板，利用预扩增引物进行PCR扩增，获得预扩增DNA；
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增：以预扩增DNA为模板，利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增，得到荧光扩增曲线及相应Ct值，并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
其中，步骤(2)所述的PCR扩增反应体系为：总体积20μL，包括：10×PCR Buffer 2μL、dNTP 1.4μL，Mg2+1.4μL，预扩增上游引物和下游引物各2μL，模板DNA 3μL DNA，Taq DNA聚合酶0.2μL，余量为ddH2O。
所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃或47℃退火30s，72℃延伸5min，共35个循环后72℃延伸5min，最后4℃保存。
其中，步骤(3)所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为：总体积20μL，包括：预扩增DNA 3μL，ARMS特异性上游引物和下游引物各2μL，SYBR Green Mix TaqⅡ10μL，余量为ddH2O。
所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃或55℃退火30s，72℃延伸5min，共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。
进一步地，所述霍山石斛还包括霍山石斛的枫斗制品。
有益效果：与现有技术相比，本发明基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛的引物组可有效地进行扩增，通过该引物组采用基于ARMS技术结合实时荧光定量PCR方法，可以快速且精准地对霍山石斛及其枫斗制品进行鉴定，建立了一种准确、灵敏、快速、稳定、可重复的霍山石斛及其枫斗制品的鉴定方法。本发明通过扩增曲线及Ct值差异对霍山石斛进行鉴定，基于霍山石斛的特异性扩增：扩增曲线最早出现且Ct值较低，可达到快速、准确、稳定、鉴定霍山石斛及其枫斗制品的目的。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的预扩增胶图；
图2为本发明实施例1霍山石斛及其混伪品(包含枫斗制品)的荧光定量扩增曲线图；
图3为本发明实施例2得到的预扩增胶图；
图4为本发明实施例2霍山石斛及其混伪品(包含枫斗制品)的荧光定量扩增曲线图；
图5为基于ITS序列对霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛、粉花石斛及齿瓣石斛的聚类鉴别分析结果图；
图6为基于实施例1的方法对霍山石斛及细茎石斛、铁皮石斛、粉花石斛及齿瓣石斛的荧光定量扩增曲线图；
图7为基于实施例2的方法对霍山石斛及细茎石斛、铁皮石斛、粉花石斛及齿瓣石斛的荧光定量扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)选取霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛以及其它17种枫斗类石斛样品(如表1所示)，通过液氮充分研磨待检样品，分别提取总DNA。提取方法为开发的改良CTAB法提取法，改良CTAB法相比于传统CTAB法，增加了3倍的CTAB及PVP40用量；
(2)以上述各石斛样品DNA为模板，利用Seq ID NO.1和2进行预扩增，获得预扩增DNA，预扩增可提高待鉴定的模板DNA浓度；
预扩增反应在PCR仪：Veriti 96Well Thermal Cycler(Applied Biosystems)上进行；
PCR反应体系特征为：总体积20μL，其中包含了：10×PCR Buffer 2μL、dNTP(10mmol·L-1)1.4μL，Mg2+(25mmol·L-1)1.4μL，预扩增上游引物和下游引物(2μmol·L-1)各2μL，模板DNA 3μL10ng/μL DNA，Taq DNA聚合酶(5U·μL-1，TaKaRa)0.2μL，余量为ddH2O；
扩增程序条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃(Seq ID NO.1和2)退火30s，72℃延伸5min，共35个循环后72℃延伸5min，最后4℃保存。
预扩增产物DNA经1％琼脂糖凝胶，1×TBE缓冲液，180V稳压电源，电泳20min，通过凝胶成像系统Gel Image System(Tanon 3500)扫描成像，预扩增胶图如图1所示，图中1-20分别代表预扩增后的各材料的DNA条带图，其物种顺序与表1一致。
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增：以预扩增DNA为模板，利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增，
反应在
Figure BDA0001392067310000041
96(Roche)荧光定量PCR仪的96孔反应板上进行；
Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系特征为：总体积20μL，其中包含了：3μL 10ng/μL DNA(预扩增DNA)，4μLARMS特异性引物(上下游引物各2μL，浓度为2μM)，10μL SYBRGreen Mix TaqⅡ(Takara)，余量为ddH2O。
反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃(Seq ID NO.5和6)退火30s，72℃延伸5min；共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。观察每对引物扩增得到的霍山石斛与其混伪品的荧光扩增曲线及相应Ct值，并比较Ct值；并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
扩增片段大小大约为270bp，扩增曲线如图2所示，霍山石斛最先得到扩增，其他石斛扩增效率极低或未得到扩增。Ct值如表2，霍山石斛的平均Ct值为17.58±0.03，比其混伪品的Ct值低。且霍山石斛的Ct值与其他混淆种的Ct值经SPSS统计分析比较得出P值小于0.001，即说明霍山石斛可用该方法与其他枫斗类石斛显著区分(P<0.001)。
表1本实验采用的20种石斛名称及采样情况
Figure BDA0001392067310000051
Note:—represents no specific“Fengdou”name
表2荧光定量PCR扩增Ct值结果(以Seq ID NO.5和6为引物)
Figure BDA0001392067310000061
霍山石斛的枫斗制品检测方法与实施例1相同，结果类似。
实施例2
(1)选取霍山石斛、细茎石斛、铁皮石斛以及其它17种石斛样品(同实施例1)，通过液氮充分研磨待检样品，使用改良的CTAB法提取法分别提取总DNA；
(2)以上述各石斛样品DNA为模板，利用Seq ID NO.3和4进行预扩增，获得预扩增DNA，预扩增可提高待鉴定的模板DNA浓度；
预扩增反应在PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler(Applied Biosystems)上进行；
PCR反应体系特征为：总体积20μL，其中包含了：10×PCR Buffer 2μL、dNTP(10mmol·L-1)1.4μL，Mg2+(25mmol·L-1)1.4μL，预扩增上游引物和下游引物(2μmol·L-1)各2μL，模板DNA 3μL10ng/μL DNA，Taq DNA聚合酶(5U·μL-1，TaKaRa)0.2μL，余量为ddH2O；
扩增程序条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，47℃(Seq ID NO.3和4)退火30s，72℃延伸5min，共35个循环后72℃延伸5min，最后4℃保存。
预扩增产物DNA经1％琼脂糖凝胶，1×TBE缓冲液，180V稳压电源，电泳20min，通过凝胶成像系统Gel Image System(Tanon 3500)扫描成像，预扩增胶图如图3所示，图中1-20分别代表预扩增后的各材料的DNA条带图，其物种顺序与表1一致。
(3)Real-time ARMS-qPCR扩增：以预扩增DNA为模板，利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增，
反应在
Figure BDA0001392067310000072
96(Roche)荧光定量PCR仪的96孔反应板上进行；
Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系特征为：总体积20μL，其中包含了：3μL 10ng/μL DNA(预扩增DNA)，4μLARMS特异性引物(上下游引物各2μL，浓度为2μM)，10μL SYBRGreen Mix TaqⅡ(Takara)，余量为ddH2O。
反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃(Seq ID NO.7和8)退火30s，72℃延伸5min；共35个循环后72℃延伸5min,最后4℃保存。观察每对引物扩增得到的霍山石斛与其混伪品的荧光扩增曲线及相应Ct值，并比较Ct值；并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
扩增片段大小大约为160bp，扩增曲线如图4所示，霍山石斛最先得到扩增，其他石斛扩增效率极低或未得到扩增。Ct值如表3，霍山石斛的平均Ct值23.42±0.46，比其混伪品的平均Ct值低。且霍山石斛的Ct值与其他混淆种的Ct值经SPSS统计分析比较得出P值小于0.001，即说明霍山石斛可用该方法与其他石斛显著区分(P<0.001)。
表3荧光定量PCR扩增Ct值结果(以Seq ID NO.7和8为引物)
Figure BDA0001392067310000071
Figure BDA0001392067310000081
霍山石斛的枫斗制品检测方法与实施例1相同，结果类似。
对比例1
(1)随机选取霍山石斛、细茎石斛、齿瓣石斛、铁皮石斛以及美花石斛这5种枫斗类石斛各6份材料。通过液氮充分研磨待检样品，使用改良的CTAB法提取法分别提取总DNA；
(2)以上述各石斛样品DNA为模板，利用ITS序列通用引物进行扩增及测序；
扩增反应在PCR仪：Veriti 96Well Thermal Cycler(Applied Biosystems)上进行；
PCR反应体系特征为：总体积10μL，其中包含了：10×PCR Buffer 1μL、dNTP(10mmol·L-1)0.7μL，Mg2+(25mmol·L-1)0.7μL，ITS通用引物上游引物和下游引物(2μmol·L-1)各1μL，模板DNA 5.5μL 10ng/μL DNA，Taq DNA聚合酶(5U·μL-1，TaKaRa)0.1μL；
扩增程序条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃(ITS通用引物)退火30s，72℃延伸3min，共35个循环后72℃延伸5min，最后4℃保存。
扩增产物送交华大基因公司测序进行测序；
(3)对测序后获得的DNA序列进行Maximum likelihood系统进化树的构建分析；
序列比对使用软件Mega 5.2，Maximum likelihood系统进化树的构建分析使用软件RAxML 8.0.2进行。
通过ITS序列构建的系统进化树结果如图5所示，由图5可见，霍山石斛和细茎石斛并不能很好的区分开，因此表明利用传统的鉴别方法，并不能将霍山石斛与细茎石斛完全区分。而利用本发明实施例1，2提供的方法可以更加准确、稳定的对霍山石斛进行鉴别(如图6，图7中霍山石斛均能与细茎石斛及其它石斛明显区分)，同时相较于对比例ITS序列的测序所花费的时间，本发明实施例1和2的重复性较好，可以更加快速、灵敏的对霍山石斛进行鉴别。因此，综上，本发明是一种准确、灵敏、快速、稳定、可重复的霍山石斛及其鉴定方法的试验。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京师范大学
<120> 一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛的引物组及其鉴定方法
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gggcaatcct gagccaaatc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agagggactt gaaccctcac ga 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccacaggatc agaagtagtg g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcctagatgt gaaaagaggc 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgttctaacg aatgaaattg cctg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agatagattc ttaatctaat gctg 24
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cataataaat atgtcgaaat tctttggtt 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
actcattcac tgagtaaagg attgaagta 29

Claims (7)

1.一种基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛及其枫斗制品的引物组，其特征在于，包括两对预扩增引物和两对ARMS特异性引物，所述两对预扩增引物：第一对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.1和2所示，第二对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.3和4所示；所述两对ARMS特异性引物：第一对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.5和6所示，第二对引物，其上下游引物序列如Seq ID NO.7和8所示。
2.一种利用权利要求1所述的引物组的基于Real-time ARMS-qPCR鉴定霍山石斛的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）待检样品DNA的提取：液氮充分研磨待检样品，提取总DNA；
（2）预扩增：以上述DNA为模板，利用预扩增引物进行PCR扩增，获得预扩增DNA；
（3）Real-time ARMS-qPCR扩增：以预扩增DNA为模板，利用ARMS特异性引物进行Real-time ARMS-qPCR扩增，得到荧光扩增曲线及相应Ct值，并基于霍山石斛的特异性扩增进行鉴定。
3.根据权利要2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）所述的PCR扩增反应体系为：总体积20 µL，包括：10 × PCR Buffer 2μL、dNTP 1.4 μL，Mg2+ 1.4 μL，预扩增上游引物和下游引物各2 μL，模板DNA 3 μL DNA，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，余量为ddH2O。
4.根据权利要2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性 4 min；94℃变性30s，55℃或47 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，共35个循环后72℃延伸5 min，最后4 ℃保存。
5.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为：总体积20 µL，包括：预扩增DNA 3 µL，ARMS特异性上游引物和下游引物各2 µL，SYBR Green Mix TaqⅡ10µL，余量为ddH2O。
6.根据权利要2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）所述的Real-time ARMS-qPCR扩增反应体系为：94 ℃预变性 4 min; 94 ℃变性 30 s，53 ℃或55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 5 min，共 35个循环后 72 ℃延伸 5 min, 最后4 ℃保存。
7.根据权利要2所述的鉴定方法，其特征在于，所述霍山石斛还包括霍山石斛的枫斗制品。
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