CN113718055B - 一种鉴定马达加斯加龙树的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及濒危物种的保护领域，特别是涉及濒危物种的鉴定方法，更为具体的说是涉及一种鉴定马达加斯加龙树的方法，本发明根据马达加斯加龙树序列特有的保守突变位点，设计得到用于实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探针，该探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团BHQ1。从而获得了马达加斯加龙树的分子鉴定方法，为濒危物种的鉴定提供了新的方法和思路，解决了目前海关口岸在濒危物种马达加斯加龙树鉴定中存在的问题。

Description

一种鉴定马达加斯加龙树的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及濒危物种的保护领域，特别是涉及濒危物种的鉴定方法，更为具体的说是涉及一种鉴定马达加斯加龙树的方法。
背景技术
龙树科植物具有树型怪异，变化多端，刺奇叶美等特点，因此受到国内爱好者的喜爱和追捧。国内部分植物园有引进栽种该科植物。我国口岸每年都会截获龙树科植物，其中就包括马达加斯加龙树。马达加斯加龙树株型奇特，茎干较粗，直立，肉质茎上布满“星形”刺座，有刺6-7枚，其中4枚长，2-3枚短；叶片细长，犹如松针，3-6片聚生。
目前海关口岸对马达加斯加龙树的鉴定以形态学为主。形态学鉴定需要有经验的专业鉴定人员，各海关口岸普遍缺乏形态鉴定专家。因此寻找方便快捷，无需依赖专业形态鉴定专家的马达加斯加龙树的鉴定方法称为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的不依赖专业形态鉴定专家的马达加斯加龙树的鉴定方法，从而可以满足海关口岸对濒危物种马达加斯加龙树的鉴定需要。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴定马达加斯加龙树的方法，所述方法为实时荧光检测方法，其用于检测马达加斯加龙树特异性基因的探针的序列为：5′-FAM-AGGCGAAACCACAGACAGAAAGACAG-BHQ-3′(被修饰的SEQ ID：1)。该探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团BHQ1。
进一步地，在本发明中还公开了用于所述实时荧光检测方法的上游引物序列为：5′-TATTTTGAACTGCGTGAATCGTA-3′(SEQ ID：2)，下游引物序列为：5′-CTTGGTTTTCTCTTTGCTGGA-3′(SEQ ID：3)。
同时，在本发明中还进一步公开了鉴定马达加斯加龙树的方法包括以下步骤：
首先，提取待检测样品核酸；
然后，参照SN/T 1204-2016对待测样品中提取的DNA模板进行针对通用植物内源基因18SrRNA的实时荧光PCR检测，待测样品应该有典型的扩增曲线；如未出现实时荧光PCR扩增曲线，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出PCR产物；
最后，采用本发明所设计的针对马达加斯加龙树的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测，如果出现典型的扩增曲线，表明待检测样品为马达加斯加龙树，如果未出现典型的扩增曲线，则表明待检测样品不为马达加斯加龙树。
进一步地，在本发明中还公开了实时荧光PCR反应体系为：
Figure BDA0003316271440000021
本发明中采用核酸提取试剂盒DNeasy Plant Mini kit提取待检测样品的基因组DNA，即DNA模板。
待检测样品为待检测植物的叶片，检测时，首先将供试样品表面进行消毒，然后将植物叶片研磨成粉，并参照核酸提取试剂盒DNeasy Plant Mini kit说明书的方法提取基因组DNA，作为DNA模板用于后续检测。
同时，在本发明中还公开了用于马达加斯加龙树鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于检测通用植物内源基因18SrRNA的探针，
序列为5′-FAM-AGGCGAAACCACAGACAGAAAGACAG-BHQ-3′的用于检测马达加斯加龙树特异性基因的探针，
以及包括序列为5′-TATTTTGAACTGCGTGAATCGTA-3′的上游引物和序列为5′-CTTGGTTTTCTCTTTGCTGGA-3′的下游引物在内的用于PCR扩增的反应体系。
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、重复性好及高通量等特点。
本发明根据马达加斯加龙树序列特有的保守突变位点，设计得到用于实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探针，该探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团BHQ1。从而获得了马达加斯加龙树的分子鉴定方法，为濒危物种的鉴定提供了新的方法和思路，解决了目前海关口岸在濒危物种马达加斯加龙树鉴定中存在的问题。
附图说明
图1为26种待测样品针对通用植物内源基因18SrRNA的实时荧光PCR扩增结果示意图。
图2为26种待测样品针对马达加斯加龙树特异性探针的实时荧光PCR扩增结果示意图。
图3为实施例2中实时荧光PCR扩增标准曲线结果示意图。
图4为实施例2中实时荧光PCR检测灵敏度结果示意图。
图5为实施例2中常规PCR扩增结果结果示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
本发明所用的26个实验材料样品编号及来源详见表1，采集样品均为活体植株，随机取其叶片进行实验；
表1植物材料及来源
Figure BDA0003316271440000041
TaKaRa Premix Ex TapTM(Probe qPCR)购自南京易特派仪器仪表有限公司，核酸提取试剂盒DNeasy Plant Mini kit购自凯杰公司。实时荧光PCR仪为ABI 7500FAST荧光定量PCR仪。
实施例1
先将供试样品进行表面消毒，将植物叶片研磨成粉，参照DNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书上的步骤方法，提取实验样品基因组DNA。提取基因组DNA放4℃保存备用。
用通用植物内源基因18SrRNA(参照SN/T 1204-2016中18SrRNA序列)对提取DNA模板进行实时荧光PCR测试，待测样品应该有典型的扩增曲线。如未出现实时荧光PCR扩增曲线，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出PCR产物。
在本实施例中用通用植物内源基因18SrRNA对26份提取DNA模板进行实时荧光PCR测试，全部待测样品均有典型的扩增曲线，其Ct值在12-20之间。说明所有样品DNA提取质量没有问题，可以进行灵敏度试验和特异性试验，检测结果如图1所示。
然后按照表2和表3中公开的实时荧光PCR反应体系及实时荧光RT-PCR检测马达加斯加龙树的引物与探针对26份提取DNA模板进行实时荧光PCR扩增及测试，检测结果见图2。
表2：实时荧光RT-PCR检测马达加斯加龙树的引物与探针
Figure BDA0003316271440000051
表3：实时荧光PCR反应体系
Figure BDA0003316271440000052
在本实施例中实时荧光定量PCR的反应参数为：94℃15s，64℃1min，40个循环。需要说明的是，不同仪器可根据仪器要求和反应试剂的要求将反应参数作适当调整。
结果如图2中所示，根据图2可以看出只有3份马达加斯加龙树样品(D17、D14、D01)出现典型的扩增曲线。这表明发明所设计的引物和荧光探针具有对马达加斯加龙树良好的特异性。
实施例2
提取马达加斯加龙树样品D17基因组DNA后，以超微量分光光度计测定核酸浓度，经测定，该样品核酸浓度为52.3ng/μL。
对该样品DNA进行10倍梯度系列稀释，取各浓度DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，每个浓度做3个重复，以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。
扩增结果显示核酸原液与10-1～10-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线，根据阴性对照设置阈值线，得到其Ct值分别为23.564、26.522、29.668、33.857、36.646。10-5、10-6和10-7DNA稀释液样本未得到典型的扩增曲线，判定为阴性(见图3)。该灵敏度试验的标准曲线的相关系数为0.995(见图4),检测限量为5.2×10-3ng/μL。常规PCR只有原液和10-1稀释液样本扩增出目的条带(见图5)，实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度比常规PCR高1000倍。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京海关动植物与食品检测中心
<120> 一种鉴定马达加斯加龙树的方法及试剂盒
<130> 202110059
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcgaaacc acagacagaa agacag 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattttgaac tgcgtgaatc gta 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttggttttc tctttgctgg a 21

Claims (5)

1.一种鉴定马达加斯加龙树的方法，其特征在于：所述方法为实时荧光检测方法，其用于检测马达加斯加龙树特异性基因的探针的序列为：5′-FAM-AGGCGAAACCACAGACAGAAAGACAG-BHQ-3′；
上游引物序列为：5′-TATTTTGAACTGCGTGAATCGTA-3′，
下游引物序列为：5′-CTTGGTTTTCTCTTTGCTGGA-3′。
2.根据权利要求1所述的鉴定马达加斯加龙树的方法，其特征在于：包括以下步骤：
首先，提取待检测样品核酸；
然后，参照SN/T 1204-2016对待测样品中提取的DNA模板进行针对通用植物内源基因18SrRNA的实时荧光PCR检测，待测样品应该有典型的扩增曲线；如未出现实时荧光PCR扩增曲线，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出PCR产物；
最后，采用权利要求1所述的针对马达加斯加龙树的引物和探针进行实时荧光PCR检测，如果出现典型的扩增曲线，表明待检测样品为马达加斯加龙树，如果未出现典型的扩增曲线，则表明待检测样品不为马达加斯加龙树。
3.根据权利要求2所述的鉴定马达加斯加龙树的方法，其特征在于，实时荧光PCR反应体系为：
Figure QLYQS_1
。
4.根据权利要求2所述的鉴定马达加斯加龙树的方法，其特征在于：待检测样品为待检测植物的叶片。
5.用于马达加斯加龙树鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
用于检测通用植物内源基因18SrRNA的探针，
序列为5′-FAM-AGGCGAAACCACAGACAGAAAGACAG-BHQ-3′的用于检测马达加斯加龙树特异性基因的探针，
以及序列为5′-TATTTTGAACTGCGTGAATCGTA-3′的上游引物和序列为5′-CTTGGTTTTCTCTTTGCTGGA-3′的下游引物。
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