CN110484642B - 一种试剂盒、其应用以及银杏的实时荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种试剂盒、其应用以及银杏的实时荧光PCR检测方法，具体涉及银杏鉴定领域，包括特异引物对和引物探针，所述特异引物对包括上游引物和下游引物；上游引物的核苷酸序列为5′‑CTGCTTTCCTCCCTGTTGGA‑3′；下游引物的核苷酸序列为5′‑ACTATACCCGCTACGATTTGATTGT‑3′；引物探针的核苷酸序列为5′‑FAM‑AAAAGATCGATCCGTATGC‑MGB‑3′。在本发明中，采用特异性强和灵敏度高的引物对及探针对银杏实施荧光PCR检测和鉴别，可准确、简便地鉴定银杏植株。相较于传统的以形态学鉴定为主方式更适用于社会发展的需求。
Description
技术领域
本发明涉及银杏鉴定领域，具体为一种试剂盒、其应用以及银杏的实时荧光PCR检测方法。
背景技术
银杏树又名白果树、公孙树，曾是仅遗存于我国的珍稀树种之一，为国家一级重点保护野生植物、我国一级国家珍贵树种(原生种)，有“活化石”之称，在植物学上具有重要的科学价值，但目前野生种群极其濒危。
根据《中华人民共和国濒危野生动植物进出口管理条例》第二十一条：“进口或者出口濒危野生动植物及其产品的，应当凭允许进出口证明书向出入境检验检疫机构报检，并接受检验检疫”。
宁波口岸每年出口银杏盆景约5000盆，目前查验以形态学鉴定为主，而出口季节为冬季落叶阶段，以形态学鉴定为主的查验方式不仅操作较为复杂，且精准度不高，已不能适应快速精确检测银杏的需求。因此，经查阅相关文献，经序列比对，拟根据银杏的特异性核酸序列建立荧光PCR鉴定方法，从而制定形态学和分子生物学相结合的《银杏鉴定方法》，为进出境物种资源查验工作提供执法技术支持。
发明内容
本发明提供了一种试剂盒、其应用以及银杏的实时荧光PCR检测方法，该银杏的实时荧光PCR检测方法具有准确度高以及操作方便的优点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种试剂盒，包括特异引物对和引物探针，所述特异引物对包括上游引物和下游引物；上游引物的核苷酸序列为5′-CTGCTTTCCTCCCTGTTGGA-3′；下游引物的核苷酸序列为5′-ACTATACCCGCTACGATTTGATTGT-3′；引物探针的核苷酸序列为5′-FAM-AAAAGATCGATCCGTATGC-MGB-3′。
本发明化提供了上述试剂盒在鉴定银杏的荧光PCR检测中的应用。
本发明还提供了一种银杏的实时荧光PCR检测方法，该方法包括如下步骤：
S01、取100mg样本粉末置于1.5mL离心管中，加入600μL CTAB提取液，充分振荡混匀，得到混合液A。
S02、将混合液A进行离心处理，取上清液，上清液经与其等体积的氯仿抽提，得到上清液，记为混合液B。
S03、在得到的混合液B中加入与其体积比为2:1的CTAB沉淀液，沉淀，离心，弃去上清液，得到沉淀物C。
S03、在沉淀物C中加入350μL NaCl溶液，溶解，得到混合液D。在混合液D中加入等体积氯仿进行抽提，得到上清液，记为混合液E。
S04、在混合液E中加入与其等体积的异丙醇，低温沉淀10分钟，离心，弃去上清液，得到沉淀F。
S05、沉淀F经体积分数为70％乙醇溶液洗涤，晾干，并经100μL TE缓冲液溶解，得到样本DNA模板。
S06、取样本DNA模板4μL，加入检测试剂：10μL Probe qPCR Master Mix-(2×)、浓度为10mmol/L的上游引物0.4μL、浓度为10mmol/L的下游引物0.4μL、ROX0.4μL，且补水至20μL。
实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃PCR前去污染2min；预变性95℃10min；95℃15s，60℃30s，40个循环。
作为优选，在步骤S01中，振荡混匀的条件为65℃水浴，振荡时间为30min。
作为优选，在步骤S02中，混合液A的离心处理条件为：10000r/min，离心处理的时间为：5min。
作为优选，在步骤S03中，沉淀时间为1h，离心条件为：12000r/m，离心时间为10min。
作为优选，在步骤S04中，低温沉淀的温度为4℃，沉淀时间为10min。
作为优选，在步骤S04中，离心条件为：12000r/m，离心时间为10min。
作为优选，在步骤S05中，样本DNA模板的保存温度为4℃。
本发明的有益效果为：
在本发明中，采用特异性强和灵敏度高的引物对及探针对银杏实施荧光PCR检测和鉴别，可准确、简便地鉴定银杏植株。相较于传统的以形态学鉴定为主方式更适用于社会发展的需求。
附图说明
图1为本实施例中待测样品的内源基因实时荧光PCR扩增结果图；
图2为银杏实时荧光PCR扩增标准曲线图；
图3为实时荧光PCR检测银杏的灵敏度图；
图4为银杏的实时荧光PCR特异性扩增结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种技术方案：
一种银杏的实时荧光PCR检测方法，该方法包括如下步骤：
S01、取100mg样本粉末置于1.5mL离心管中，加入600μL CTAB提取液，在65℃的水浴条件下充分振荡30min，直至混匀，得到混合液A。
S02、将混合液A进行10000r/min离心处理5min，取上清液，上清液经与其等体积的氯仿抽提，得到上清液，记为混合液B。
S03、在得到的混合液B中加入与其体积比为2:1的CTAB沉淀液，沉淀时间为1h，并经过12000r/m离心处理，弃去上清液，得到沉淀物C。
S03、在沉淀物C中加入350μL NaCl溶液，溶解，得到混合液D。
在混合液D中加入等体积氯仿进行抽提，得到上清液，记为混合液E。
S04、在混合液E中加入与其等体积的异丙醇，在4℃的低温条件下沉淀10分钟，并在12000r/m离心条件下离心处理10min，弃去上清液，得到沉淀F。
S05、沉淀F经体积分数为70％乙醇溶液洗涤，晾干，并经100μL TE缓冲液溶解，得到样本DNA模板；样本DNA模板可以在4℃的温度条件下备用。
S06、取样本DNA模板4μL，加入检测试剂：10μL Probe qPCR Master Mix-(2×)、浓度为10mmol/L的上游引物0.4μL、浓度为10mmol/L的下游引物0.4μL、ROX0.4μL，且补水至20μL。
实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃PCR前去污染2min；预变性95℃10min；95℃15s，60℃30s，40个循环。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上进行内源基因检测实验：
如图1所示，用通用植物内源基因18SrRNA对57份样本DNA模板进行实时荧光PCR测试，全部待测样品均有典型的扩增曲线，其Ct值在18-29之间。说明所有样品DNA提取质量没有问题，可以进行灵敏度试验和特异性试验。
实时荧光PCR检测灵敏度：
如图2所示，对银杏提取核酸后，测定核酸浓度为1.6ng/μL。将银杏DNA基因组10倍梯度稀释，以检测实时荧光PCR方法的灵敏度。
如图3所示，扩增结果显示核酸原液与10-1～10-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线，根据阴性对照设置阈值线，得到其Ct值分别为24.56、28.13、32.16、34.87、38.09。10-5和10-8DNA稀释液样本未得到典型的扩增曲线，判定为阴性。
实时荧光RT-PCR检测特异性
如图4所示银杏检测引物与荧光探针特异性研究显示，201808、201814的银杏样品出现典型的扩增曲线。而未能从其他样品中得到典型扩增曲线。结合在NCBI中的同源性与特异性比较结果，这一对引物与荧光探针检测银杏具有良好的特异性。
上述实施例所使用到的实验材料为：
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁波检验检疫科学技术研究院
<120> 一种试剂盒、其应用以及银杏的实时荧光PCR检测方法
<141> 2019-08-20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(unknow)
<400> 3
aaaagatcga tccgtatgc 19
Claims (1)
1.一种试剂盒在鉴定银杏的荧光PCR检测中的应用，其特征在于，包括特异引物对和引物探针，所述特异引物对包括上游引物和下游引物；
上游引物的核苷酸序列为5′-CTGCTTTCCTCCCTGTTGGA-3′；
下游引物的核苷酸序列为5′-ACTATACCCGCTACGATTTGATTGT-3′；
引物探针的核苷酸序列为5′-FAM-AAAAGATCGATCCGTATGC-MGB-3′。
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| 龚维.孑遗植物银杏的分子亲缘地理学研究.《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》.2008,A006-70. * |
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| CN110484642A (zh) | 2019-11-22 |
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