CN115094148A - 一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物、试剂盒和应用 - Google Patents

一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签，所述microRNAs性别标签为dre‑miR‑223，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了用于扩增所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签的引物和试剂盒，以及上述高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物或试剂盒在高体鰤性别鉴定方面的应用。本发明运用血清外泌体microRNAs进行高体鰤雌鱼和雄鱼的判定，dre‑miR‑223在已经验证的样品中准确率为100％，且鉴定结果可靠，不会对鱼体造成创伤；本发明同时利用该鉴别标签设计了针对该标签的扩增引物，开发了检测的试剂盒，方便快捷，简单高效。

Description

一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物、试剂盒和应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物、试剂盒和应用。
背景技术
高体鰤(Seriola dumerili)是一种生长速度快，肉质好，营养价值高的世界性深远海经济鱼类。高体鰤是雌雄异体鱼类，其无表型性别二态性，因此难以从鱼体表面直接鉴定鱼的性别。而且在人工养殖条件下，高体鰤表现出严重的生殖功能障碍，性别鉴定困难这一问题也极大地阻碍了高体鰤的工厂化养殖。
鱼类性别鉴定有生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞观察、雌性特异分子标记等多种方法。外泌体内含物microRNAs，其在进化上高度保守，性质稳定，易于定量检测，具有生物标签的条件，对于鱼类性别鉴定的具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种指示性别的高体鰤外泌体microRNAs性别标签、用于扩增所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签的引物和试剂盒，以解决难以从鱼体表面直接鉴定高体鰤雌鱼和雄鱼的难题。
本发明的目的还在于提供上述高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物或试剂盒在高体鰤性别鉴定方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签，所述microRNAs性别标签为dre-miR-223，其碱基序列如SEQ ID NO：1所述。
本发明针对高体鰤雌鱼和雄鱼识别问题，提出一种高体鰤血清来源的外泌体microRNAs作为生物标记物，用于识别雌鱼和雄鱼。
将高体鰤血清外泌体microRNA性别标签在高体鰤性别鉴定中的应用时，microRNA性别标签为dre-miR-223，其序列为TGTCAGTTTGTCAAATACCCC。
所述miRNAs性别标签具有在雌鱼和雄鱼中显著差异表达的特点，是特异的分子识别标记。
本发明中的高体鰤外泌体microRNAs性别标签，优选通过以下方法筛选获得：
1)血清外泌体分离鉴定后，对3尾雌鱼和3尾雄鱼血清外泌体small RNA进行测序分析，将raw reads进行过滤，得到clean reads，将clean reads依次与Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库和miRBase数据库进行比对注释；统计已知microRNA并预测新的microRNA；对microRNA进行差异表达分析，对差异表达miRNA的靶基因进行Gene Ontology(GO)富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析，最后与雌鱼和雄鱼样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对两种样品具有指示作用的microRNA作为候选microRNAs生物标记物。
2)将候选标签microRNAs按照以下五个标准进行过滤：(1)在雌鱼组(Femalegroup，3尾雌鱼)和雄鱼组(Malegroup，3尾雄鱼)两组样品中表达有显著差异，即P值小于0.05；(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；(3)两样品中至少有一个的TPM值大于0；(4)foldChange值大于2，所述foldChange值＝TPMSample_Male./TPMSample_Female；(5)从上述四个标准中筛选出来的microRNAs中随机挑选11个microRNAs。
3)提取两组验证样本：7尾雌鱼和7尾雄鱼血清来源外泌体总RNA，利用microRNA定量分析试剂盒定量检测步骤2)过滤后的microRNAs的差异表达情况，筛选出最具标签指示作用的miRNAs作为最终的标签microRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre-miR-223，其序列为TGTCAGTTTGTCAAATACCCC。此标签在雄鱼样本中的表达量较高，而在雌鱼样本中的表达量较低。依据microRNA定量分析结果，进行雌鱼和雄鱼的判定。
本发明还提供了一种用于扩增所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签的引物，所述引物为性别标签dre-miR-223定量检测引物，所述dre-miR-223定量检测引物包括正向引物dre-miR-223-F和反向引物dre-miR-223-R，其中所述正向引物dre-miR-223-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物dre-miR-223-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
具体的：
dre-miR-223定量检测引物碱基序列为：
dre-miR-223-F：CGCGTGTCAGTTTGTCAAA(SEQ ID NO：2)；
dre-miR-223-R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：3)。
本发明还提供了一种用于高体鰤性别鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括所述的dre-miR-223定量检测引物、dre-miR-223逆转录引物dre-miR-223-RT、内参基因oni-let-7a定量检测引物、oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT以及逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)常规试剂。
优选的，所述dre-miR-223逆转录引物dre-miR-223-RT的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述内参基因oni-let-7a的定量检测引物包括正向引物oni-let-7a-F和反向引物oni-let-7a-R，其中所述oni-let-7a正向引物oni-let-7a-F的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述oni-let-7a反向引物oni-let-7a-R的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。
具体的：
所述dre-miR-223逆转录引物为dre-miR-223-RT，其碱基如下：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGGTA(SEQ ID NO：4)。
所述内参基因oni-let-7a的定量检测引物为：
oni-let-7a-F：GCGCGTGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO：5)；
oni-let-7a-R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：6)；
所述oni-let-7a逆转录引物为oni-let-7a-RT，其碱基序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT(SEQ ID NO：7)。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述高体鰤外泌体microRNAs性别标签在高体鰤性别鉴定方面的应用。
本发明还进一步公开了上述引物或试剂盒在高体鰤性别鉴定方面的应用。
在高体鰤性别鉴定时，可以通过以下步骤：收集高体鰤的血清样品，提取其外泌体RNA，通过特异性的miRNA逆转录引物或所述试剂盒进行RT-PCR获得cDNA模板，采用所述特异性的miRNA正反向引物或所述试剂盒进行qPCR获得microRNA的表达情况(优选SYBRGreenⅠ嵌合荧光法进行miRNA定量反应)，根据性别标签dre-miR-223在雌、雄鱼中的表达量来鉴定高体鰤的性别，其中雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于120)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于120)。
优选的，利用RT-PCR时，采用两步法进行。第一步去除基因组DNA，反应体系为10μL体系，包括4μL ddH2O、2μL gDNA Wiper Mix和4μL RNA，反应程序为：42℃2min；第二步合成cDNA，反应体系为20μL体系，包括2μLddH2O，10μL第一步中的混合液、4μL逆转录引物、2μL10×RT Mix和2μLHiScriptⅡEnzyme Mix，反应程序为：25℃5min，50℃15min，85℃5min。
其中，逆转录引物为dre-miR-223逆转录引物dre-miR-223-RT或oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT。
优选的，利用qPCR(优选SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行miRNA定量反应)时，反应体系为10μL体系，包括0.5μL 10×miRNA-F引物、0.5μL 10×miRNA-R引物、5μL 2×miRNAUniversal SYBR qPCR Master Mix、3μL ddH2O、1μL cDNA模板。
其中，miRNA-F引物为dre-miR-223-F或oni-let-7a-F，miRNA-R引物为dre-miR-223-R或oni-let-7a-R。
优选的，利用qPCR(优选SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行miRNA定量反应)时，反应程序为：95℃5min；94℃30s，58℃20s，72℃20s，循环40次；95℃15s，65℃1min，97℃；37℃30s。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明运用血清外泌体microRNAs进行高体鰤雌鱼和雄鱼的判定，在已经验证的样品中准确率为100％，且鉴定结果可靠，不会对鱼体造成创伤；
(2)本发明同时利用该鉴别标签设计了针对该标签的扩增引物，开发了检测的试剂盒，方便快捷，简单高效。
附图说明
图1是本发明实施例1-2中提出的标志microRNA经14个验证样本验证后的qRT-PCR表达量；
图2是本发明实施例2中14个验证样本验证后在两组样本的qRT-PCR表达量均值。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1高体鰤外泌体microRNAs性别标签作为生物标记物的筛选确定
1)血清样本的收集
收集高体鰤性别分化的雌鱼和雄鱼血清0.5mL，于离心管中用于外泌体分离鉴定；
2)外泌体的提取
(1)血清样本取0.5mL转移1.5mLEP管，加入1mL总外泌体分离试剂(从细胞培养基)(4478359，Thermofisher Scientific)，充分混合，4℃放置过夜；
(2)在4℃、10000rpm/min的条件下离心1h，丢弃上清液，将离心管倒置在滤纸上2min；
(3)用50μL PBS重悬沉淀，于-20℃保存；
3)外泌体的鉴定：利用马尔文Nanosight NS300进行纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)；利用抗体CD63、CD9和HSP70进行蛋白免疫印迹(WB)分析；利用Tecnai G2 Spirit型透射电子显微镜(TEM)进行透射电镜分析，对外泌体进行分析鉴定后，剩余样品用于RNA提取和测序分析。
4)外泌体的microRNA测序分析
Trizol法提取3尾雌鱼和3尾雄鱼外泌体的RNA，质检后构建小RNA文库并基于illumina平台测序，完成测序后将raw reads进行过滤，得到clean reads，将clean reads依次与Rfam数据库、cDNA序列、物种重复序列库和miRBase数据库进行比对注释；统计已知microRNA并预测新的microRNA；对microRNA进行差异表达分析，对差异表达miRNA的靶基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，最后与雌鱼和雄鱼样品进行相关性匹配，筛选出一种或者多种，对雌鱼和雄鱼样品具有指示作用的microRNA作为候选标签microRNAs。
5)将候选标签micro RNAs按照以下五个标准进行过滤：(1)在雌鱼组(Femalegroup，3尾雌鱼)和雄鱼组(Male group，3尾雄鱼)两组样品中表达有显著差异，即P值小于0.05；(2)与已知数据库进行比对确认存在的microRNAs；(3)两样品中至少有一个的TPM值大于0；(4)foldChange值大于2，所述foldChange值＝TPM Sample_Male./TPM Sample_Female；(5)从上述四个标准中筛选出来的18个microRNAs中随机挑选11个microRNAs。
6)提取随机两组验证样本：7尾雌鱼和7尾雄鱼血清来源外泌体总RNA，利用microRNA逆转录试剂盒进行RT-PCR获得cDNA模板，利用microRNA定量分析试剂盒定量检测步骤5)过滤后的microRNAs差异表达情况，选取2-ΔΔCt进行计算分析，筛选出最具标签指示作用的microRNAs作为最终的标签microRNAs；根据统计学分析原理，P值小于0.05为显著差异，最终筛选到dre-miR-223，其序列为TGTCAGTTTGTCAAATACCCC。此标签在雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于120)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于120)，如图1所示。
实施例2
随机利用高体鰤血清外泌体microRNA标志物鉴定7尾雌鱼和7尾雄鱼
基于血清外泌体microRNA标志物dre-miR-223设计特异性引物，引物为性别标签dre-miR-223定量检测引物，dre-miR-223定量检测引物包括正向引物dre-miR-223-F和反向引物dre-miR-223-R，其中正向引物dre-miR-223-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物dre-miR-223-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
具体的：
dre-miR-223定量检测引物碱基序列为：
dre-miR-223-F：CGCGTGTCAGTTTGTCAAA(SEQ ID NO：2)；
dre-miR-223-R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：3)。
本实施例还提供了一种用于高体鰤性别鉴定的试剂盒，试剂盒包括dre-miR-223定量检测引物、dre-miR-223逆转录引物dre-miR-223-RT、内参基因oni-let-7a定量检测引物、oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT以及RT-PCR和qPCR常规试剂。
dre-miR-223定量检测引物逆转录引物dre-miR-223-RT的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
内参基因oni-let-7a的定量检测引物包括正向引物oni-let-7a-F和反向引物oni-let-7a-R，其中正向引物oni-let-7a-F的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，反向引物oni-let-7a-R的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。
内参基因oni-let-7a定量检测引物逆转录引物oni-let-7a-RT的碱基序列如SEQID NO：7所示。
具体的：
dre-miR-223定量检测引物碱基序列为：
dre-miR-223-F：CGCGTGTCAGTTTGTCAAA(SEQ ID NO：2)；
dre-miR-223-R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：3)。
dre-miR-223定量检测引物逆转录引物为dre-miR-223-RT，其碱基如下：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGG TA(SEQ ID NO：4)。
内参基因oni-let-7a的引物为：
oni-let-7a-F：GCGCGTGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO：5)；
oni-let-7a-R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：6)；
内参基因oni-let-7a逆转录引物为oni-let-7a-RT，其碱基序列为：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT(SEQ ID NO：7)。
内参基因oni-let-7a的序列为TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT(SEQ ID NO：8)。
因此，基于血清外泌体microRNA标志物dre-miR-223的鉴定试剂盒包括dre-miR-223定量检测引物及其逆转录引物，内参基因oni-let-7a的定量检测引物及其逆转录引物，以及RT-PCR和qPCR的其它常规试剂：RNase-free ddH2O、gDNA Wiper Mix、RT Mix、HiScriptⅡEnzyme Mix、dNTP、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、RNaseinhibitor、Ace Taq DNA polymerase、Mg2+、SYBR GreenⅠ及Specific ROX Reference。
在高体鰤性别鉴定时，通过以下步骤：收集高体鰤的血清样品，提取其外泌体RNA，通过特异性的miRNA逆转录引物或试剂盒进行RT-PCR获得cDNA模板，采用特异性的miRNA正反向引物或试剂盒进行qPCR获得microRNA的表达情况(SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行miRNA定量反应)。
具体包括以下步骤：
miRNA的RT-PCR通过VeritiTM 96孔快速热循环仪采用两步法进行。
利用RT-PCR时，采用两步法进行。第一步去除基因组DNA，反应体系为10μL体系，包括4μL ddH2O、2μL gDNA Wiper Mix和4μL RNA，反应程序为：42℃2min；第二步合成cDNA，反应体系为20μL体系，包括2μL ddH2O，10μL第一步中的混合液、4μL逆转录引物、2μL10×RTMix和2μLHiScriptⅡEnzyme Mix，反应程序为：25℃5min，50℃15min，85℃5min。其中逆转录引物为dre-miR-223逆转录引物dre-miR-223-RT或oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT。
利用qPCR(SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行miRNA定量反应)时，反应体系为10μL体系，包括0.5μL 10×miRNA-F引物、0.5μL 10×miRNA-R引物、5μL 2×miRNA UniversalSYBR qPCR Master Mix、3μL ddH2O、1μL cDNA模板。其中，miRNA-F引物为dre-miR-223-F或oni-let-7a-F，miRNA-R引物为dre-miR-223-R或oni-let-7a-R。
使用Roche Applied Science LightCycler 480进行miRNA的qPCR检测，反应的程序为：95℃5min；94℃30s，58℃20s，72℃20s，循环40次；95℃15s，65℃1min，97℃；37℃30s。
样品检测设3个平行。利用特异引物检测7尾高体鰤雌鱼和7尾高体鰤雄鱼的标签microRNA，即dre-miR-223的表达情况，结果如表1、图1、图2所示，此标签dre-miR-223在雄鱼样本中的表达量较高(表达量高于或等于120)，而在雌鱼样本中的表达量较低(表达量低于120)，而且该标签在组样本中的表达具有显著差异(P<0.05)。故将以120的表达量作为一个标准，表达量低于120的为雌鱼，而表达量大于或等于120的为雄鱼。根据此标准，利用高体鰤血清外泌体microRNA标志物鉴定高体鰤雌鱼和雄鱼，dre-miR-223在已经验证的样品中准确率为100％。
表1 14个验证样本qRT-PCR表达数据
Figure BDA0003672987040000081
Figure BDA0003672987040000091
对于本领域的技术人员，对本发明针对的构思及技术要点进行变形，相应的改变应属于本发明所请求的权利要求。本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签、引物、试剂盒和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 高体鰤(Seriola dumerili)
<400> 1
tgtcagtttg tcaaataccc c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcgtgtcag tttgtcaaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacggggta 50
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgcgtgagg tagtaggttg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaactat 50
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 内参基因(oni-let-7a)
<400> 8
tgaggtagta ggttgtatag tt 22

Claims (6)

1.一种高体鰤外泌体microRNAs性别标签，其特征是：所述性别标签为dre-miR-223，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签的引物，其特征是：所述引物为性别标签dre-miR-223定量检测引物，所述dre-miR-223定量检测引物包括正向引物dre-miR-223-F和反向引物dre-miR-223-R，其中所述正向引物dre-miR-223-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物dre-miR-223-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种用于高体鰤性别鉴定的试剂盒，其特征是：所述试剂盒包括权利要求2中的dre-miR-223定量检测引物、dre-miR-223逆转录引物dre-miR-223-RT、内参基因oni-let-7a定量检测引物、oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT以及RT-PCR和qPCR常规试剂。
4.根据权利要求3所述的用于高体鰤性别鉴定试剂盒，其特征是：所述逆转录引物dre-miR-223-RT的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述内参基因oni-let-7a定量检测引物包括正向引物oni-let-7a-F和反向引物oni-let-7a-R，其中所述正向引物oni-let-7a-F的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物oni-let-7a-R的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述oni-let-7a逆转录引物oni-let-7a-RT的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。
5.权利要求1所述高体鰤外泌体microRNAs性别标签在高体鰤性别鉴定方面的应用。
6.权利要求2所述引物或权利要求3-4任一项所述试剂盒在高体鰤性别鉴定方面的应用。
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