CN106755377B - 一种胃癌血清学检测鉴定试剂盒及方法 - Google Patents

一种胃癌血清学检测鉴定试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胃癌血清学检测鉴定试剂盒及方法，所述试剂盒包括cel‑miR‑39‑5p片段、引物、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂；所述引物为：cel‑miR‑39‑5p内参引物、hsa‑miR‑375引物、hsa‑miR‑590‑5p引物、hsa‑miR‑19b‑3p引物、hsa‑miR‑100‑5p引物和hsa‑miR‑16引物。在对患者使用血清检测胃癌CA19‑9、CA24‑2和CEA的任一结果为阳性，再使用本发明提供的检测试剂盒进行辅助检测，可以有效去除血清学检测的假阳性结果，从而避免给患者带来巨大的精神压力和财产损失；同时针对血清检测胃癌CA19‑9、CA24‑2和CEA的结果为阴性，再使用本发明提供的检测试剂盒进行辅助检测，可以有效发现血清学检测的假阴性结果，从而及时挽救患者生命。

Description

一种胃癌血清学检测鉴定试剂盒及方法
(一)技术领域
本发明涉及一种胃癌血清检测鉴定试剂盒及检测方法。
(二)背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其长度约为20-25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录本pri-miRNA经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。近年来的研究表明miRNA参与了多种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和调亡、脂肪代谢等等。动物miRNAs基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺昔酸尾巴(AAAAA)的初级转录本(pri-miRNA)。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成长约70个核昔酸的pre-miRNA。然后由RNA-GTP和exportin5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一种核酸酶Dicer将其剪切产生长约22个核苷酸的miRNA:miRNA*双链复合体。这种双链复合体很快被引导进入沉默复合体(RISC)中，其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对进而调控基因表达。目前认为，10-30％的人类基因都受到miRNA的调控。癌症的早期诊断对其成功治愈有重要的作用。容易获得并且稳定的生物学标记能够提供一系列相关的有价值的肿瘤生物学信息。CA19-9、CA24-2和CEA是目前胃癌诊断的主要血清学指标，但是这些检测的敏感性和特异性仍不高，假阳性率较高，因为人们对癌症的恐惧心理，假阳性的检测结果容易给患者造成巨大的精神压力和财产损失。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种胃癌血清检测鉴定试剂盒及其应用，针对胃癌血清学检测中的非特异性问题，以及检测结果假阳性或者假阴性的问题，本发明提供的胃癌血清检测鉴定试剂盒，用于辅助胃癌血清学(如CA19-9、CA24-2、CEA)检测，可以有效去除假阳性和假阴性的检测结果，具有更高的灵敏度(图3)。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种胃癌血清检测鉴定试剂盒，所述试剂盒包括cel-miR-39-5p片段、引物、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂；所述引物为：cel-miR-39-5p内参引物、hsa-miR-375引物、hsa-miR-590-5p引物、hsa-miR-19b-3p引物、hsa-miR-100-5p引物和hsa-miR-16引物。
所述cel-miR-39-5p片段核苷酸序列为：AGCTGATTTCGTCTTGGTAATA，优选购自Qiagen公司miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control试剂Cat No./ID:219610；
引物如下：
cel-miR-39-5p内参引物：AGCTGATTTCGTCTTGGTAA，优选购自Qiagen公司的miRNeasy Serum/Plasma试剂盒(Cat No./ID:217184)；
hsa-miR-375引物(F端)：ACACTCCAGCTGGGTTTGTTCGTTC；
hsa-miR-590-5p引物(F端)：ACACTCCAGCTGGGGAGCTTATTC；
hsa-miR-19b-3p引物(F端)：ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCC；
hsa-miR-100-5p引物(F端)：ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATC；
hsa-miR-16引物(F端)：ACACTCCAGCTGGGUAGCAGCACG。
进一步，所述引物还包括：
hsa-miR-122-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGAACGCCATTATC)、
hsa-miR-122-5p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGTGGAGTGTGAC)、
hsa-miR-125a-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGACAGGTGAGG)、
hsa-miR-125a-5p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGUCCCUGAGACC)、
hsa-miR-193b-5p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGCGGGGTTTTGAG)、
hsa-miR-205-5p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCC)、
hsa-miR-214-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGACAGCAGGCAC)、
hsa-miR-1307-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGACTCGGCGTG)、
hsa-miR-19a-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATC)、
hsa-miR-21-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGCAACACCAGTC)、
hsa-miR-215-5p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGATGACCTATG)、
hsa-miR-33a-5p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGGTGCATTGTAG)、
hsa-miR-494-3p引物(F端):(ACACTCCAGCTGGGTGAAACATAC)、
hsa-miR-501-3p引物(F端):(GCAGGGAATGCACCCGGG)
和hsa-miR-598-3p引物(F端):(GCAGGGTACGTCATCGTTGTC)。
进一步，所述实时荧光定量PCR试剂包括2x SYBR Green PCR混合液、1μL 10xmiScript反向通用引物。
进一步，优选所述试剂盒由cel-miR-39-5p片段、引物、真空采血管-分离胶/促凝剂管(购自Greiner Bio-One公司)和真空采血针组件、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂组成；所述引物为cel-miR-39-5p内参引物、hsa-miR-375引物、hsa-miR-590-5p引物、hsa-miR-19b-3p引物、hsa-miR-100-5p引物和hsa-miR-16引物。
进一步，优选所述试剂盒由cel-miR-39-5p片段、引物、真空采血管-分离胶/促凝剂管和真空采血针组件、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂组成；所述引物为cel-miR-39-5p内参引物、hsa-miR-375引物、hsa-miR-590-5p引物、hsa-miR-19b-3p引物、hsa-miR-100-5p引物、hsa-miR-16引物、hsa-miR-122-3p引物、hsa-miR-122-5p引物、hsa-miR-125a-3p引物、hsa-miR-125a-5p引物、hsa-miR-193b-5p引物、hsa-miR-205-5p引物、hsa-miR-214-3p引物、hsa-miR-1307-3p引物、hsa-miR-19a-3p引物、hsa-miR-21-3p引物、hsa-miR-215-5p引物、hsa-miR-33a-5p引物、hsa-miR-494-3p引物、hsa-miR-501-3p引物和hsa-miR-598-3p引物。
本发明还提供一种所述胃癌血清检测鉴定试剂盒的检测方法，所述方法为：(1)血清学检测：提取待测血液，利用血清学检测；(2)试剂盒检测：提取待测血液，利用外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂和反转录试剂制备待测血液外泌体cDNA作为实时荧光定量PCR模板，加入引物和实时荧光定量PCR试剂进行反应，95℃15分钟，94℃15秒，55℃30秒，70℃30秒，40个循环，获得miRNAs的表达量，与正常人血清外泌体中miRNAs的表达量相比；(3)结果判断：①当待测血液血清学检测为阳性时，若试剂盒检测hsa-miR-375和hsa-miR-590-5p中一个或两个的miRNAs表达量均上调，除去cel-miR-39-5p内参引物以外的其他3个引物中超过2个miRNAs表达量上调，则判断血清学检测为假阳性；若试剂盒检测hsa-miR-375和hsa-miR-590-5p中仅有一个miRNAs表达量上调，除去cel-miR-39-5p内参引物以外的其他3个引物中超过2个miRNAs表达量下调，则判断血清学检测阳性为正确；②当待测血液血清学检测阴性时，若试剂盒检测hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-16的miRNAs表达量均上调，则判断血清学检测阴性为正确，若试剂盒检测hsa-miR-375和hsa-miR-590-5p中仅有一个miRNAs表达量上调，除去cel-miR-39-5p内参引物以外其他3个引物中超过2个引物的miRNAs表达量上调，则判断血清学检测阴性为正确；其他情况则判断血清学检测假阴性；若出现其他结果，认为血清学判断一致，无需对检测结果进一步判断。
本发明还提供一种所述胃癌血清检测鉴定试剂盒的检测方法，所述方法为：(1)血清学检测：提取待测血液，利用血清学检测；(2)试剂盒检测：提取待测血液，利用外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂和反转录试剂制备待测血液外泌体cDNA作为实时荧光定量PCR模板，加入引物和实时荧光定量PCR试剂进行反应，95℃15分钟，94℃15秒，55℃30秒，70℃30秒，40个循环，获得miRNAs的表达量，与正常人血清外泌体中miRNAs的表达量相比；(3)结果判断：①当待测血液血清学检测为阳性时，若试剂盒检测hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-16中miRNAs的表达量均未下调的，则血清学检测为假阳性；试剂盒检测hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-214-3p中超过3/7的miRNAs表达量上调，同时满足hsa-miR-100-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-598-3p中超过6/13的miRNAs表达量下调，则认为血清学检测结果判断正确，如果不能同时满足上述条件，但是其中hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p的miRNAs表达量均下调，则认为血清学检测结果判断正确，为阳性；否则认为血清学检测结果为假阳性；②当血清学检测结果为阴性时，若试剂盒检测hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-214-3p中超过3/7的miRNAs表达量上调，同时满足hsa-miR-100-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-598-3p中超过6/13的miRNAs表达量下调，则认为血清学检测结果为假阴性；如果不满足上述条件，但出现hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p的miRNAs表达量均下调，则认为血清学检测结果判断错误，为假阴性，否则认为血清学检测结果判断正确，为阴性。
外泌体分离试剂购自Invitrogen公司的Total Exosome Isolation(from serum)试剂盒(Cat No./ID:4478360)。外泌体miRNA提取试剂购自Ambion公司的mirVanaTMPARISTM试剂盒(Cat No./ID:AM1556)或者Qiagen公司的miRNeasy Serum/Plasma试剂盒(Cat No./ID:217184)。RNA逆转录试剂购自Qiagen公司的miScript II RT试剂盒(CatNo./ID:218160或者218161)实时定量PCR试剂购自Qiagen公司的miScript SYBR GreenPCR Kit(Cat No./ID:218073或者218075或者218076)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
在对患者使用血清检测胃癌CA19-9、CA24-2和CEA的任一结果为阳性，再使用本发明提供的检测试剂盒进行辅助检测，可以有效去除血清学检测的假阳性结果，从而避免给患者带来巨大的精神压力和财产损失；同时针对血清检测胃癌CA19-9、CA24-2和CEA的结果为阴性，再使用本发明提供的检测试剂盒进行辅助检测，可以有效发现血清学检测的假阴性结果，从而及时挽救患者生命。
本发明所提供试剂盒，采用的miRNA均为现有报道已经发现的miRNA，其测序所用接头和扩增引物(部分引物也可以采用优化的引物序列(见表1和表2))均有成熟的市售商品，可以方便的从市场上获得，试剂盒易于制备。
(四)附图说明
图1为胃癌患者术前血清外泌体样本和手术切除后胃癌患者血清外泌体样本miRNAs表达差异结果。
图2正常人群与胃癌人群外泌体中hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-16miRNAs的表达差异比较。
图3以胃镜检查为标准，对比血清学检测和外泌体miRNAs检测的准确性；miRNAs(5)：hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-16的检测组合；miRNAs(20)：hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-598-3p的检测组合。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述室温均指25℃。
实验例1与胃癌相关度较高外泌体miRNA的筛选
1.血清外泌体分离及其RNA提取
1)采取经常规血液检测法检测胃癌阳性的新鲜血液2ml放入真空采血管-分离胶/促凝剂管(购自Greiner Bio-One公司)中，室温静置15分钟。
2)Thermo ST16R冷冻离心机1000×g，4度离心10分钟。
3)将血清小心转移至15ml离心管，2000×g离心30分钟。将上清转移至新15ml离心管中。
4)Thermo ST16R冷冻离心机10,000×g，4度离心40分钟。将上清转移至新超速离心管(Beckman公司，Cat No./ID:355654)中。Beckman Optima L-100XP超速离心机超速离心100,000×g，4度离心70分钟。
5)完全弃去上清，沉淀即为血清外泌体。
6)加入1ml Trizol(Ambion公司，Cat No./ID:15596-018)至离心管中，将沉淀重悬裂解完全。
7)再加入0.2ml氯仿(上海沪试化工)，盖紧离心管盖。剧烈震荡30秒。将溶液转移至1.5ml离心管中，室温静置2分钟。
8)Termo micro21R冷冻离心机4度12,000×g离心15分钟。
9)小心将离心管中上层水相，转移至新离心管中。加入5μg无核酸酶的糖原(阿拉丁试剂公司，Cat No./ID:G111730)，混合均匀。
10)在上述离心管中加入0.5ml的异丙醇(上海沪试化工)，混合均匀。
11)室温静置10分钟或者-20度静置过夜(16小时)。
12)Termo micro21R冷冻离心机4度12,000×g离心15分钟。
13)小心倒弃上清，沉淀即为RNA。
14)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻柔颠倒混匀，清洗RNA沉淀。
15)Termo micro21R冷冻离心机4度12,000×g离心15分钟。
16)小心倒弃全部上清，沉淀置于超净台中干燥5分钟，沉淀透明，表面无明显液体即可。
17)加入无核酸酶去离子水20μL轻柔振荡溶解沉淀。
18)用微量核酸检测仪Thermo Nano-drop 1000测得RNA总量为5μg。
2.建库、二代测序及数据分析
1)取1μg总RNA溶于总体积5μL无核酸酶去离子水中。
2)后续实验流程按照Illumina公司提供的标准步骤执行，包括制备文库和测序实验。小RNA测序文库制备采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒。样本提取总RNA后，利用miRNA的属性，即5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。首先使用T4RNA连接酶2将一个腺苷化单链DNA 3’接头和5’接头相继连接到small RNA上，其中3’端接头的5端为rAPP，3端有氨基保护，所以能够减少miRNA的自连，T4RNA连接酶2(Truncated)在连接反应时不需要ATP，只需要预腺苷化的接头，所以能够减少miRNA以及接头序列的自连。5’端接头被设计成可以捕获带有5’磷酸基团的small RNA。带有5’与3’链接接头的small RNA序列，通过与3端互补的RT引物进行反转录反应，最后对反转录产生的cDNA序列进行PCR扩增。对140-160bp长度范围的PCR产物进行6％polyacrylamide Tris-borate-EDTA胶回收，从而完成整个文库的制备工作，对构建好的文库使用Illumina Hise-q2000/2500进行测序，测序读长为单端1×50bp。
3)miRNA数据分析
采用miRNA数据分析软件ACGT101-miR(LC Sciences,Houston,Texas,USA)，即原始序列通过Illumina FastQC进行数据质量评估，获取Q30数据后，通过一系列数据处理，将由于样本制备、测序接头、非典型miRNA特征序列(在此我们称为垃圾序列)以及测序仪器光学数码处理而产生的非纯序列(N特征序列)进行清理，随后，进行长度筛选，保留碱基长度在18-26nt(动物)，再将剩余序列比对各种RNA数据库序列(不包含miRNA)，如mRNA、RFam(包含rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等)和重复序列数据库(Repbase)，并进行过滤。将上述清理、去除过后所剩余的测序序列，通过Bowtie比对到miRBase21.0中特定物种人的前体上，鉴定己知的miRNA，同时发现新的5p或者3p miRNA序列。在比对分析中，5’和3’末端长度变化以及序列内部有一个错配的情况，在比对中被允许。其中，比对到人的成熟体序列部分miRNA即为己知报道的miRNA，而如果检测到的序列能够比对到己知miRNA的对应臂部位则可以被确定为新的5p或者3p miRNA候选序列。未比对上的序列，再一次通过Bowtie比对到miRBase21.0中其它选定物种的前体上，并且比对上的miRNA前体序列通过进一步比对上测序物种的基因组序列从而鉴定出该类己报道miRNA。由于以上两类鉴定出的miRNA都来自miRBase数据库己报道的序列，因而我们定义为己知的miRNA。除此以外的其它仍未鉴定出的测序序列则进一步通过与基因组比对，对于比对上的序列，则在基因组上相应比对位点，通过碱基数目延伸(动物80nt)，并采用RNAfold软件(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)进行RNA二级结构预测。
4)差异性表达分析：根据实验设计不同，采用适合的差异检验方法筛选差异显著性基因，例如Fisher精确检验、卡方(2*2)、卡方(N*N)、T检验以及ANOVA等算法。
5)测序结果
6)将胃癌患者术前血清外泌体样本和手术切除后胃癌患者血清外泌体样本建库测序分析结果--miRNAs表达差异结果(图1)。
由于miRNA预测具有一定的假阳性，因此我们选择拷贝数目大于10的序列作为新预测的候选miRNA。通过采用适合的差异检验方法筛选差异显著性miRNAs。通过分析获得P≤0.001，log 2(fold-change)改变大于2的miRNA共20个。它们分别是hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-214-3p在胃癌患者血清外泌体中上调，hsa-miR-100-5p、hsa-miR-16、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-501-3p、hsa-miR-598-3p在胃癌血清外泌体中下调。
采用实时定量PCR可以对临床检测快速诊断，因此采用实时定量PCR的方法对血清外泌体miRNA进行定量分析，可以提高检测效率。考虑到胃癌检测中稳定性因素，我们从上述20个miRNAs中进一步选取表达量上调的，并且扩增效率更高的5个miRNAs进行组合，即hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-16，联合判断认为可以将正常人与胃癌患者区分开(图2)，相对于胃镜内镜的侵入性和有创性检测手段，非侵入式和微创的传统血清学检测和血清外泌体miRNAs检测方法更容易运用于常规检测。其中胃镜检查方法参考2014年4月发表在胃肠病学杂志上的《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见》，血清学检测方法如下：患者均在空腹状态下抽取静脉血2ml，分离血清后，进行CA19-9、CA24-2、CEA肿瘤标志物检测，CA19-9采用罗氏公司Cobas E601型电化学发光仪配套试剂盒检测、CA24-2和CEA采用Beckman coulter公司DXI800化学发光仪配套试剂盒检测。三个不同检测方法的结果见图3，因此说明血清外泌体miRNAs辅助判断传统血清学检测将有助于提高检测灵敏度。
实验例2胃癌血清检测鉴定试剂盒的制备和使用
1、试剂盒
本实施例所提供的试剂盒，由cel-miR-39-5p片段、引物、真空采血管-分离胶/促凝剂管和真空采血针组件、外泌体分离试剂盒、外泌体miRNA提取试剂盒、反转录试剂和实时荧光定量PCR试剂组成。
引物(见表1、表2)如下：cel-miR-39-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-100-5p和hsa-miR-16。
hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-501-3p和hsa-miR-598-3p。实时定量PCR的引物由上海生工公司或者苏州金唯智生物公司合成。
外泌体分离试剂盒购自Invitrogen公司的Total Exosome Isolation(fromserum)试剂盒(Cat No./ID:4478360)。
外泌体miRNA提取试剂盒购自Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒(Cat No./ID:AM1556)或者Qiagen公司的miRNeasy Serum/Plasma试剂盒(Cat No./ID:217184)。
实时定量PCR试剂购自Qiagen公司的miScript SYBR Green PCR Kit(Cat No./ID:218073或者218075或者218076)。
表1：引物序列
Figure BDA0001177430470000091
Figure BDA0001177430470000101
表2：引物
hsa-miR-205-5p F端引物 GCAGGGTCCTTCATTCCACCG
hsa-miR-214-3p F端引物 GCAGGGACAGCAGGCACAGAC
hsa-miR-375F端引物 GCAGGGTTTGTTCGTTCGGC
hsa-miR-19a-3p F端引物 GCAGGGTGTGCAAATCTATGC
hsa-miR-193b-5p F端引物 GCAGGGCGGGGTTTTGAGGG
hsa-miR-122-5p F端引物 GCAGGGTGGAGTGTGACAATG
hsa-miR-125a-3p F端引物 GCAGGGGAGCTTATACAGGTGAGG
hsa-miR-125a-5p F端引物 GCAGGGGAGCTTATUCCCUGAGACC
hsa-miR-122-3p F端引物 GCAGGGAACGCCATTATCACAC
hsa-miR-598-3p F端引物 GCAGGGTACGTCATCGTTGTC
hsa-miR-590-5p F端引物 GCAGGGGAGCTTATTCATAAAAGTGC
hsa-miR-494-3p F端引物 GCAGGGTGAAACATACACGGG
hsa-miR-33a-5p F端引物 GCAGGGGTGCATTGTAGTTGC
hsa-miR-1307-3p F端引物 GCAGGGACTCGGCGTGGC
hsa-miR-21-3p F端引物 GCAGGGCAACACCAGTCGATG
hsa-miR-100-5p F端引物 GCAGGGAACCCGTAGATCCG
hsa-miR-501-3p F端引物 GCAGGGAATGCACCCGGG
hsa-miR-215-5p F端引物 GCAGGGATGACCTATGAATTGACAG
hsa-miR-19b-3p F端引物 GCAGGGTGTGCAAATCCATGC
hsa-miR-16F端引物 GCAGGGAATGCUAGCAGCACG
引物设计说明：
PCR引物设计中的一个重要参数即是熔解温度(Tm)。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。简单的计算方法为Tm值(解链温度)＝4(G+C)+2(A+T)，复性温度＝Tm值-(5-10℃)。由于miRNA的片段为20个核苷酸左右，为了使得退火温度较为一致，需要根据引物退火温度的计算方法，重新设计对应引物，因此设计引物时，我们认为增加一个固定序列ACACTCCAGCTGGG或者GCAGGG，后面连续序列为miRNAs原序列，通过控制miRNAs原序列的碱基数，可以有效控制Tm在60℃或者62℃。保证同一个样本能够在同一时间内进行定量PCR扩增。
2、本实施例所提供试剂盒用法如下：
医院对患者使用血清血检测胃癌CA19-9、CA24-2和CEA的任一结果为阳性或者检测结果为全阴性后，使用本试剂盒进一步进行检测，判断血清学检测的结果。
血清学判断结果为CA24-2阳性(样品1)、阴性(样品2)、CA19-9和CA24-2和CEA全部阳性(样品3)的患者，同时进行结果判定。方法如下：
表3临床血清学检测结果
Figure BDA0001177430470000111
上述患者血清按如下步骤操作：
(1)血清的收集和血清外泌体分离
1)用真空采血管-分离胶/促凝剂管和真空采血针组件收集新鲜血液样本2毫升，4度放置2小时内，或者常温15分钟内进行离心分离血清。
2)用Thermo ST16R冷冻离心机1000xg，4度离心10分钟，获得血清。
3)将血清小心转移至1.5ml离心管，用Termo micro21R冷冻离心机2000xg，4度离心30分钟。将上清转移至新1.5ml离心管中。
4)加入1/5上述血清体积的外泌体分离试剂(Invitrogen公司的Total ExosomeIsolation(from serum)试剂盒，Cat No./ID:4478360)。充分混匀。
5)2-8度静置30分钟。
6)将上述含血清离心管置于用Termo micro21R冷冻离心机中，10,000xg，4度离心10分钟。
7)完全吸弃上清，沉淀即为血清外泌体。
(2)血清外泌体miRNA的提取和纯化(试剂主要来自Ambion公司的mirVanaTMPARISTM试剂盒)
1)用300μL已经加入cel-miR-39-5p片段(终浓度为1x 108个)的细胞重悬液(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，Cat No./ID:AM1556)重悬沉淀(即步骤(1)中的血清外泌体)。
2)加入300μL 2X变性剂(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，Cat No./ID:AM1556)，充分裂解后，冰上静置5-10分钟。
3)加入600μL酸酚氯仿(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，Cat No./ID:AM1556)，涡旋振荡1分钟。
4)将上述离心管置于用Termo micro21R冷冻离心机中，12,000xg，离心5分钟。
5)将离心管中上层水相小心转移至新1.5ml离心管中。
6)加入1.25倍上述体积的无水乙醇(上海沪试化工)，充分混匀。
7)将上述溶液加入至已经装入新离心管的滤器(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，Cat No./ID:AM1556)中，将含滤器的离心管置于Termo micro21R冷冻离心机中，12,000xg，离心30秒。
8)倒弃滤液，将滤器放回离心管中。
9)重复上述步骤7-8，直至溶液全部通过滤器。
10)在滤器中加入700μL miRNA清洗液1(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，Cat No./ID:AM1556)，将含滤器的离心管置于Termo micro21R冷冻离心机中，12,000xg，离心30秒。
11)倒弃滤液，将滤器放回离心管中。
12)在滤器中加入500μL清洗液2/3(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，CatNo./ID:AM1556)，将含滤器的离心管置于Termo micro21R冷冻离心机中，12,000xg，离心30秒。
13)倒弃滤液，将滤器放回离心管中。
14)重复步骤12-13。
15)将含滤器的离心管重新置于Termo micro21R冷冻离心机中，12,000xg，离心1分钟。
16)将滤器置于一新离心管中。加入100μL 95度预热的洗脱液(Ambion公司的mirVanaTM PARISTM试剂盒，Cat No./ID:AM1556)或者无核酸酶去离子水。
17)将含滤器的离心管重新置于Termo micro21R冷冻离心机中，12,000xg，离心1分钟。滤液即为外泌体RNA。
(3)将miRNA反转录成cDNA
取200μLPCR管，加入12μL上述外泌体RNA，加入4μL 5x缓冲液、2μL 10x核苷酸、2μL逆转录酶(Qiagen公司的miScript II RT试剂盒，Cat No./ID:218160或者218161)，轻柔混合均匀，置于PCR仪上。
在Bio-Rad S1000PCR仪上设置逆转录程序：
37℃60分钟；
95℃5分钟；
4℃维持。
即得到逆转的cDNA。
含cDNA的PCR管可以-20℃长期放置或者直接进行荧光定量PCR步骤。
(4)实时定量PCR检测(5μL2x SYBR Green PCR混合液、1μL 10x miScript反向通用引物来自Qiagen公司的miScript SYBR Green PCR Kit，Cat No./ID:218073或者218075或者218076)
将上述cDNA用去离子水稀释10倍。
取稀释后的1μL cDNA、5μL 2x SYBR Green PCR混合液、1μL 10x miScript反向通用引物、1μL需检测的miRNAs正向引物(即hsa-miR-375引物、hsa-miR-590-5p引物、hsa-miR-19b-3p引物、hsa-miR-100-5p引物和hsa-miR-16引物)和2μL无核酸酶去离子水加入384孔PCR板(购自Axygen公司)，封上4titude公司的定量PCR热封膜(175度，1.5秒加热)，振荡混匀后，800rpm离心15s。
将384孔板置于ABI 7900HT荧光定量PCR仪中。
在ABI 7900HT荧光定量PCR仪上设置荧光定量PCR程序：
预变性：95℃15分钟；
信号收集40个循环：
Figure BDA0001177430470000131
增加溶解曲线检测步骤。
(5)荧光定量检测结果分析
以cel-miR-39-5p片段的表达量为参照，计算miRNA表达量时，利用ΔCt＝Ct(miRNA)-Ct(cel-miR-39-5p)，ΔΔCt＝ΔCt(患者)-ΔCt(正常个体)，miRNA的相对表达量为2-ΔΔCt。结果如下：
表4miRNA qPCR结果，CT值
Figure BDA0001177430470000141
表5：各个miRNA的相对表达量结果
Figure BDA0001177430470000142
表6：根据表5的结果以及结果判定规则对血清学结果做出的判断
样品1 样品2 样品3
血清学结果判断 假阳性 假阴性 阳性
实验例3胃癌血清检测鉴定试剂盒的制备和使用
表7临床血清学检测结果：
Figure BDA0001177430470000143
步骤(1)-(4)同实施例2。
(5)荧光定量检测结果分析
以cel-miR-39-5p的表达量为参照，计算miRNA表达量时，利用ΔCt＝Ct(miRNA)-Ct(cel-miR-39-5p)，ΔΔCt＝ΔCt(患者)-ΔCt(正常个体)，miRNA的相对表达量为2-ΔΔCt。
对血清检测胃癌CA19-9、CA24-2和CEA的任一结果为阳性或者或者检测结果为全阴性的病人而言，通过分析患者血清外泌体与正常人血清外泌体中miRNA的表达量，还可以采用20个miRNAs组合的判断标准。
表8：20个miRNA qPCR结果，CT值
Figure BDA0001177430470000151
表9：20个miRNA相对表达量结果
Figure BDA0001177430470000152
Figure BDA0001177430470000161
表10：根据表9的结果以及结果判定规则对血清学结果做出的判断
样品4 样品5 样品6
血清学结果判断 假阴性 阳性 阳性
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省中医院
<120> 一种胃癌血清学检测鉴定试剂盒及方法
<130>
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
agctgatttc gtcttggtaa ta 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
agctgatttc gtcttggtaa 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
acactccagc tgggtttgtt cgttc 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
acactccagc tggggagctt attc 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
acactccagc tgggtgtgca aatcc 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
acactccagc tgggaacccg tagatc 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
acactccagc tggguagcag cacg 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
acactccagc tgggaacgcc attatc 26
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
acactccagc tgggtggagt gtgac 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
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acactccagc tgggacaggt gagg 24
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<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
acactccagc tgggucccug agacc 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
acactccagc tgggcggggt tttgag 26
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
acactccagc tgggtccttc attcc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
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<400> 14
acactccagc tgggacagca ggcac 25
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<211> 24
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<213> unknown
<220>
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acactccagc tgggactcgg cgtg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> unknown
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<400> 16
acactccagc tgggtgtgca aatc 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 17
acactccagc tgggcaacac cagtc 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 18
acactccagc tgggatgacc tatg 24
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 19
acactccagc tggggtgcat tgtag 25
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 20
acactccagc tgggtgaaac atac 24
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<211> 18
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 21
gcagggaatg cacccggg 18
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 22
gcagggtacg tcatcgttgt c 21

Claims (1)

1.一种试剂组合在制备胃癌血清学检测鉴定试剂盒中的应用，其特征在于所述试剂组合包括cel-miR-39-5p 片段、引物、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂和实时荧光定量PCR 试剂；所述引物为：cel-miR-39-5p内参引物、hsa-miR-375引物、hsa-miR-590-5p引物、hsa-miR-19b-3p引物、hsa-miR-100-5p引物、hsa-miR-16引物；所述实时荧光定量PCR 试剂包括2x SYBR Green PCR混合液、1μL 10x miScript 反向通用引物；
所述cel-miR-39-5p 片段核苷酸序列为：AGCTGATTTCGTCTTGGTAATA；
cel-miR-39-5p内参引物：AGCTGATTTCGTCTTGGTAA；
hsa-miR-375引物：ACACTCCAGCTGGGTTTGTTCGTTC；
hsa-miR-590-5p引物：ACACTCCAGCTGGGGAGCTTATTC；
hsa-miR-19b-3p引物：ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCC；
hsa-miR-100-5p引物：ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATC；
hsa-miR-16引物：ACACTCCAGCTGGGUAGCAGCACG。
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