CN115109851A - 一种胃癌早期筛查miRNA定量PCR检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米检测技术领域，涉及一种胃癌早期筛查miRNA定量PCR检测试剂盒，包括检测胃癌高表达miRNA标志物的试剂，所述试剂中含有检测上述miRNA的引物或者探针。发明通过对胃癌患者血清与尿液样本中提取的外泌体进行基因测序，筛选出胃癌血清与尿液外泌体中共有的高表达miRNA。本发明还包括含有高表达miRNA的组合及应用。本发明还涉及利用荧光磁性纳米粒子定量检测miRNA的存在、数量或者表达量的方法，用于辅助早期胃癌的筛查和判断。

Description

一种胃癌早期筛查miRNA定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于纳米检测技术领域，涉及胃癌高表达miRNA标志物。本发明还涉及通过设计检测引物，利用荧光磁性纳米粒子作为标记物，定量检测miRNA的相关PCR反应产物的方法和试剂盒，用于辅助胃癌患者的早期筛查和判断。
背景技术
胃癌之所以死亡率高，其早期症状不明显是重要原因。胃癌早期部分患者无症状，或者症状轻微。80%患者的初发症状是上腹不适，与消化不良相似，如发生腹痛，一般都较轻，且无规律性，进食后不能缓解。这些症状往往不被患者所重视，就医时也易被误认为胃炎或溃疡病。将近50%的胃癌患者都有明显食欲减退或食欲不振的症状，部分患者是因进食过多会引起腹胀或腹痛而自行限制进食的。原因不明的厌食和消瘦，很可能就是早期胃癌的初步症状，但是多数情况下都未能够引起患者重视。早期胃癌患者一般无明显的阳性体征，大多数患者除全身情况较弱外，仅在上腹部出现深压痛。
当胃癌发展扩大，尤其在浸润穿透浆膜而侵犯胰腺时，可出现持续性剧烈疼痛，并向腰背部放射，部分患者日益消瘦、乏力、贫血，最后表现为恶病质。癌肿长大后，可出现梗阻症状，贲门或胃底癌可引起下咽困难，胃窦癌引起幽门梗阻症状，腹部还可扪及肿块。癌肿表面形成溃疡时，则出现呕血和黑便。晚期胃癌还会出现转移灶如直肠前触及肿块、脐部肿块、锁骨上淋巴结肿大和腹水。当临床症状明显时，病变已属晚期，治疗手段受限、效果往往不尽如人意。如何早期发现胃癌，具有巨大的临床需求。
目前临床上主要通过胃镜活检结合病理分析来发现早期胃癌，然而这种诊断方法存在技术要求高、成本高昂、患者耐受性差等问题，无法作为常规筛查手段。临床上常规的血液肿瘤标志物检测筛查早期胃癌，概率仍比较低。到目前为止，统计数据表明我国早期胃癌的发现率仍低于15%，急需新的简便、快速筛查早期胃癌的新技术方法。
近年来，循环系统miRNA作为肿瘤诊断标志物的研究越来越广泛。作为循环系统各类特征分子的重要载体之一，外泌体对于胃癌的发生和治疗，也具有独特的生物学意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种辅助早期筛查胃癌的标志物。
本发明要解决的另一个技术问题是提供上述辅助早期筛查标志物的相关的检测方法。
本发明要解决的又一个技术问题是提供上述辅助早期筛查标志物的相关的检测试剂盒。
本发明提供一种辅助早期筛查胃癌的标志物，涉及胃癌患者血清与尿液的外泌体中筛选出的高表达miRNA标志物，通过设计PCR检测引物或者探针，利用荧光磁性纳米粒子作为标记物，定量检测miRNA的PCR反应产物，用于辅助早期胃癌患者的筛查。
本发明提供了一种试剂，所述试剂中含有检测胃癌高表达miRNA的引物或者探针；所述的miRNA选自下列中的一个或者多个：
hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-6087或者hsa-miR-4532。
本发明中，检测miRNA的引物或者探针可以与磁性粒子连接，以方便检测的操作或者提高检测的效率。优选的，所述的磁性粒子是磁性纳米粒子或者荧光磁性纳米粒子。
发明中，所述的检测miRNA的引物或者探针选自序列如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO10的多核苷酸中的一条或者多条；所述的检测miRNA的引物或者探针可以是含有或者序列如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 10的多核苷酸，也可以是序列如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 10的多核苷酸与其他核苷酸、氨基酸残基、检测标志物连接形成的连接物；或者，
所述的检测miRNA的引物选自上述多核苷酸的两两组合，两两组合是指，所述的检测miRNA的引物含有序列如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 10的多核苷酸中的任意两条。每条引物也可以包括序列如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 10的多核苷酸与其他核苷酸、氨基酸残基、检测标志物连接形成的连接物；或者，
所述的检测miRNA的引物选自一对或者若干对引物对，每对引物对含有两条多核苷酸，可选的引物对选自：
(a)SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2；
(b)SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4；
(c)SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6；
(d)SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8；或者
(e)SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10。
本发明还提供了上述试剂的应用，用于检测上述miRNA的存在、数量或者表达量,较好的，所述的应用包括以下步骤：
获取待检测的样本；
分离纯化，获得待检测的样本中的外泌体；
提取外泌体的RNA；
使用上述试剂检测提取的RNA。
所述的检测还可以包括使用PCR或者定量PCR确定上述组合物的存在、数量或者表达量。
本发明还提供了胃癌早期筛查miRNA定量PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述的试剂，包括检测目标miRNA的引物或者探针。较好的，所述的试剂盒中还含有用于PCR的反应溶液、阳性对照、阴性对照、说明书、微量反应容器，乃至移液设备。所述的试剂盒中还可以含有PCR的预制混合液等。
本发明也提供了一种组合物，该组合物含有一个或者多个miRNA，所述的miRNA选自：
hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-6087或者hsa-miR-4532。
在本发明的一个实施例中，分析胃癌血清外泌体miRNA样本，发现59个共性基因，分别为：
hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23a-3p。分析胃癌患者尿液样本，外泌体miRNA交集如下：共有7个共同miRNA：hsa-miR-143-3p、hsa-miR-1246、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-6087、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-23a-3p。
本发明提供了上述组合物的应用。上述组合物可以作为胃癌早期筛查的辅助诊断标志物。在本发明的一个优选实施例中，以5个共有的高表达miRNA标志物：hsa-miR-143-3p、hsa-miR-1246、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7c-5p、和hsa-miR-23a-3p作为早期胃癌的辅助诊断标志物，辅助医生判断，并且获取胃镜活检胃部组织标本，进行病理分析和判断。
本发明提供了一种检测上述组合物的方法，所述的检测包括但不限于确定组合物存在与否、其数量或者表达量。
本发明的试剂，可以用于检测上述miRNA的存在、数量或者数量。
在本发明的一个实施例中，设计合成了5个miRNA标志物检测的PCR引物，将RT-PCR扩增检测的定量检测结果输入公式，并计算p值：
p = hsa-miR-143-3p x 0.021 + hsa-miR-1246 x 0.025+ hsa-let-7g-5p x0.035 + hsa-let-7c-5p x 0.028 + hsa-miR-23a-3p x 0.026。
相应的结果判断标准是：当P >= 2, 结果是阳性，高度提示被检测的患者患有早期胃癌；当P < 2，结果是阴性，高度提示被检测的患者，患有早期胃癌的可能性小。
上述检测的结果可以提供给临床医生，结合临床症状进一步判断，包括进一步做胃镜与病理分析，从而作为早期胃癌患者的诊断依据。
本发明通过对胃癌患者血清与尿液样本中提取的外泌体进行基因测序，筛选出胃癌血清与尿液外泌体中共有的高表达miRNA，可以用于早期胃癌的筛查与诊断。本发明设计制备了miRNA的RT-PCR引物，并利用荧光磁性纳米粒子作为标记物，通过定量检测miRNA的PCR反应产物，用于胃癌患者的筛查与早期诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是胃癌样本共性外泌体分析结果，其中，A是胃癌血清样本，B是胃癌尿液样本。
图2是血浆外泌体的TEM图。
图3是荧光磁性纳米粒子编码微球TEM图，其中，右下角以50nm为标尺的小图是以200为标尺的透射电子显微镜视野的局部放大图。
具体实施方式
本发明通过收集临床胃癌患者血清与尿液样本，分离出外泌体，利用测序技术，筛选出高表达的miRNA标志物，通过数据分析，最终筛选出胃癌患者血液与尿液中存在的miRNA标志物，用于辅助早期胃癌的筛选与诊断。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
外泌体获取及纯化：
血清样本外泌体获取及纯化：经超高速离心并裂解，将250 µL无细胞血清样本在冰上融化，用3 mL PBS稀释，利用0.22 µm滤膜过滤，离心（15000 g，4℃离心过夜），弃上清，用1 mL PBS重悬沉淀离心（15000 g, 4℃, 2 h），除去上清，-80℃进行保存，备用。
尿液样本外泌体获取及纯化：
取新鲜获取的尿液20 ml，按3000 rpm进行离心5 min，除去沉淀，取得上清液；
将获取的上清液，利用0.22微米的无菌滤头过滤除去较大的杂质颗粒；
将上述步骤获得的过滤液10-20 mL加入到300 kDa的透析袋（Spectrum公司）中；
在PBS中透析6-10小时，每3小时更换一次PBS，每次PBS用量约为800 ml；
将杂蛋白和其他分子透析出，留下外泌体；
此时的外泌体由于PBS溶液较多，浓度较稀，将该稀外泌体加入100 kDa的超滤管中，以3000 rpm超滤5-8 min，浓缩外泌体体积，得到浓度较高的外泌体；
外泌体颗粒用二硫苏糖醇（Dithiothreito, DTT）处理以消除蛋白质复合物，用无菌无RNase PBS洗涤；
使用miRNeasy mini kit（Qiagen）从外泌体中提取miRNA，提取的RNA通过Bioanalyzer（Agilent2100）检测：将样品置于冰上，融化后，充分混匀并离心，移液器吸取适量样品进行检测；采用RNA6000 Picokit试剂盒检测，检测结果浓度大于300 pg/ul，且样品总量超10 ng，可以进行建库。
各个样本的RNA总量及纯度符合要求后，进行Illumina NextSeq 500 SE50 (20M)测序，测序后下机数据经过去接头及低质量数据裁剪得到最终的clean data并以Fasta格式进行存储。
实施例2
通过miRExpress工具，基于miRBase (http://www.mirbase.org)的miRNA数据库信息对样本miRNA进行定量分析。该软件在接受Fastq格式的二代测序数据（简称raw data）后，将RawData与miRBase中的已知miRNA序列分析比对后将相同序列片段的读取计数称作Counts，用以衡量样本中miRNA的表达数量，从而得到样本miRNA表达谱。
根据样本分组信息，整合样本表达数据，使用R语言（版本3.4.3）中的DEGseqpackage比较样品间的表达差异。由此得到了两两样本间基因比较的foldchange（倍数变化），p-value，及q-value（q-value，矫正后的p值，又称q值，该值是基于计算得到的全部p值进一步归一化得到的p值）。然后，根据q-value<0.05和log2 (foldchange)的绝对值>2，筛选出两两样本间具有显著性差异的基因列表。
分析胃癌血清外泌体miRNA样本，发现59个共性基因，分别为：
hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23a-3p。
尿液外泌体miRNA交集如下：共有hsa-miR-143-3p、hsa-miR-1246、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-6087、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-4532、hsa-miR-23a-3p这7个共同miRNA。血清外泌体miRNA与尿液外泌体miRNA共性外泌体彼此重叠关系如图1如示。
实施例3
本发明通过对其中5个miRNA标志物的表达水平同步检测，来筛查患者是否发生早期胃癌。
主要通过下列步骤实现：
1. 收集患者的血液2ml, 或者尿液5ml, 采用透析与离心相结合的方法，分离出血液或尿液中的外泌体；
2. 采用磁性纳米粒子基础上的核酸提取试剂盒，提取外泌体中总RNA，用NanoDrop ND-1000检测RNA浓度和纯度，用DEPC处理的双蒸水稀释总RNA，保持浓度为100μg/ml,4℃保存备用；
3. 5个miRNA 标志物检测的PCR引物设计如下：
hsa-miR-143-3p，
F: GCCTGAGGTGCAGTGCT，（SEQ ID NO 1）
R: CTGCAGAACAACTTCTCTCTTCC，（SEQ ID NO 2）
hsa-miR-1246，
F: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTGCTCC，（SEQ ID NO 3）
R: ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG，（SEQ ID NO 4）
hsa-let-7g-5p，
F: GGCTGAGGTAGTAGTTTGTACAGT，（SEQ ID NO 5）
R: GGCAGTGGCCTGTACAGTTAT，（SEQ ID NO 6）
hsa-let-7c-5p，
F: TCCGGGTTGAGGTAGTAGGT，（SEQ ID NO 7）
R: GCTCCAAGGAAAGCTAGAAGGT，（SEQ ID NO 8）
hsa-miR-23a-3p，
F: CGGCTGGGGTTCCTGG，（SEQ ID NO 9）
R: GGTCGGTTGGAAATCCCTGG，（SEQ ID NO 10）。
4. 荧光磁性纳米粒子采用反向微乳法制备，采用电镜进行表征，制备后，用去离子水进行稀释，浓度为100 μg/ml。
5. 取5个PCR管，分别标记上1-5，对应5个miRNA标志物（hsa-miR-143-3p、hsa-miR-1246、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7c-5p和hsa-miR-23a-3p），每管50μl反应液的制备如下：
PCR buffer 10μl, 反转录酶1μl，Taq 酶1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTP混合液15μl，RNA 样品5μl，荧光磁性纳米粒子2μl，14μl去离子水，混匀后，放入定量PCR仪进行扩增。
6. PCR反应条件：37℃反转录15分钟，95℃反应30秒；然后， PCR 反应条件：95℃反应 5秒,60℃反应 15秒,72℃反应30秒，35个循环。
7. PCR反应产物，利用用NanoDrop进行定量检测。
8. 检测结果，输入公式，P = hsa-miR-143-3p量 x 0.021 +hsa-miR-1246量x0.025+ hsa-let-7g-5p量x0.031 +hsa-let-7c-p量x0.023 +hsa-miR-23a-3p量 x 0.026=2.743， P > 2，高度提示存在早期胃癌。
应用例1
一位腹部疼痛的邬姓患者来医院就诊，高度怀疑为早期胃癌，经患者知情同意，采集了患者的2 mL血液，进行5个miRNA标准物检测，具体按如下步骤：
1. 采用超速离心的方法，分离出血液中的外泌体；
2. 采用磁性纳米粒子基础上的RNA提取试剂盒，提取外泌体中的总RNA，用NanoDrop ND-1000检测RNA浓度和纯度，用DEPC处理的双蒸水进行稀释，控制浓度为100μg/ml；
3.采用反相微乳法制备荧光磁性纳米粒子，浓度控制为：100 μg/ml；
4. 采用5个PCR管，分别标记上1-5，对应5个miRNA标志物，每管50μl反应液的制备如下：PCR buffer 10μl, 反转录酶1μl，Taq 酶1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTP混合液15μl，RNA 样品5μl，荧光磁性纳米粒子2μl，14μl去离子水，混匀后，放入定量PCR仪进行扩增；
5. PCR反应条件：37℃反转录15分钟，95℃反应30秒；然后， PCR 反应条件：95℃反应 5秒,60℃反应 15秒,72℃反应30秒，35个循环；
6. PCR反应产物，利用NanoDrop进行定量检测，检测结果如下：
hsa-miR-143-3p量： 25μg/ml
hsa-miR-1246量： 28μg/ml
hsa-let-7g-5p量： 16μg/ml
hsa-let-7c-5p量： 32μg/ml
hsa-miR-23a-3p量： 11μg/ml
7. 检测结果，输入公式，P = hsa-miR-143-3p量 x 0.021 +hsa-miR-1246量x0.025+ hsa-let-7g-5p量x0.031 +hsa-let-7c-p量x0.023 +hsa-miR-23a-3p量 x 0.026=2.743， P > 2，高度提示存在早期胃癌。
把检测结果提交给临床医生，患者采用胃镜活检胃部组织标本，进行病理分析，确诊胃部存在腺癌。
此实施例表明：5个miRNA 标志物的检测，可以用于筛选早期胃癌患者，帮助医生对胃癌的诊断作判断。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种胃癌早期筛查miRNA定量PCR检测试剂盒
<130> 20220522
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctgaggtg cagtgct 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcagaaca acttctctct tcc 23
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcctg ctcc 44
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acactccagc tgggaatgga tttttgg 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggctgaggta gtagtttgta cagt 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcagtggcc tgtacagtta t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccgggttga ggtagtaggt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctccaagga aagctagaag gt 22
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggctggggt tcctgg 16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtcggttgg aaatccctgg 20

Claims (10)

1.一种试剂，其特征在于，所述试剂中含有检测胃癌高表达miRNA的引物或者探针；所miRNA选自下列中的一个或者多个：
发明通过对胃癌患者血清与尿液样本中提取的外泌体进行基因测序，筛选出胃癌血清与尿液外泌体中共有的高表达miRNA；
hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-6087或者hsa-miR-4532。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，检测miRNA的引物或者探针与磁性粒子连接，所述的磁性粒子是磁性纳米粒子或者荧光磁性纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的检测miRNA的引物或者探针选自序列如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 10的多核苷酸中的一条或者多条；
或者，所述的检测miRNA的引物选自上述多核苷酸的两两组合；
或者，所述的检测miRNA的引物选自一对或者若干对引物对，每对引物对含有两条多核苷酸，可选的引物对选自：
（a）SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2；
（b）SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4；
（c）SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6；
（d）SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8；或者
（e）SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10。
4.一种胃癌早期筛查miRNA定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有如权利要求1-3中任意一项所述的试剂。
5.一种组合物，其特征在于，含有一个或者多个miRNA，所述的miRNA选自：
hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-484、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-6087或者hsa-miR-4532。
6.根据权利要求5所述组合物的应用。
7.一种检测如权利要求5所述组合物的方法，其特征在于，所述的检测包括但不限于确定：如权利要求5所述组合物存在与否、如权利要求5所述组合物的数量或者表达量。
8.一种如权利要求1至3任一项所述试剂的应用，其特征在于，使用权利要求1至3所述的试剂检测权利要求5所述组合物的存在、数量或者表达量。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
（1）获取待检测的样本；
（2）分离纯化，获得待检测的样本中的外泌体；
（3）提取步骤（2）中外泌体的RNA；
（4）使用权利要求1中所述的试剂检测步骤（3）提取的RNA，或者使用PCR、定量PCR确定权利要求5所述组合物的存在、数量或者表达量。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括使用以下公式计算p值：
p = hsa-miR-143-3p x 0.021 + hsa-miR-1246 x 0.025+ hsa-let-7g-5p x 0.035+ hsa-let-7c-5p x 0.028 + hsa-miR-23a-3p x 0.026；和/或
判断p值是否大于等于2当P >= 2, 结果是阳性，高度提示被检测的患者患有早期胃癌；当P < 2，结果是阴性，高度提示被检测的患者，患有早期胃癌的可能性小。
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