CN116676384A - 胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒 - Google Patents

胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒。该生物标志物为VIPR2基因,通过检测该生物标志物的甲基化水平诊断胃癌。以VIPR2基因作为生物标志物,通过检测VIPR2基因的甲基化水平来诊断或辅助诊断胃癌,具有较高的灵敏度和特异性,可以有效地提高胃癌的检出率。

Description

胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒。
背景技术
胃癌是一种十分重要的疾病。据统计,2020年,在全球范围内,有超过一百万的人口被确诊为胃癌,同时有约76.9万人因胃癌而死亡,胃癌的发病率和致死率在癌症中分别位列第5位和第4位。在病原学上,胃癌是一种宿主和环境因素共同作用的多因素疾病。胃癌的危险因素包括:幽门螺杆菌感染、吸烟、饮酒、肥胖、盐摄入、萎缩性胃炎以及胃癌家族史等。胃腺癌是来源于胃的恶性肿瘤中最常见的类型(95%),其它不常见的胃癌种类还包括间质肿瘤、淋巴增生性肿瘤和神经内分泌肿瘤。
绝大多数患者被诊断为胃癌时已是在较晚期。晚期的胃癌是高度致命的,患者的中位生存期仅约9~10个月,相较之下,早期的胃癌是高度可治疗的,5年的生存率约95%左右。因此,胃癌的早期筛查十分重要。目前,胃镜及活检是胃癌诊断的金标准,但其作为侵入性检查,严重依赖检验设备和内镜医师资源、且检查过程痛苦,患者接受度较低。血清学检查CEA、CA19-9和CA72-4等肿瘤标志物的方法在进展期胃癌中的灵敏度较低,在早期胃癌中的灵敏度更是低于10%,因而其临床应用价值有限。
发明内容
基于此,有必要针对胃癌提供一种的生物标志物,通过检测该生物标志物的甲基化水平来诊断胃癌,可以改善传统生物标志物对胃癌检测灵敏度低的问题。
此外,还提供一种上述生物标志物在制备用于诊断胃癌的试剂或试剂盒中的应用、诊断胃癌的核酸产品和试剂盒。
一种胃癌的生物标志物,所述生物标志物为VIPR2基因,通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断胃癌。
经本研究发现,以VIPR2基因作为生物标志物,通过检测VIPR2基因的甲基化水平来诊断或辅助诊断胃癌,具有较高的灵敏度和特异性,可以有效地提高胃癌的检出率。
在其中一个实施例中,包括用于检测VIPR2基因甲基化水平的检测引物对。
在其中一个实施例中,所述核酸产品包括用于检测Chr7:159143816~159145800区域的甲基化水平的检测引物对。
在其中一个实施例中,所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针,所述检测探针上连接有荧光基团。
在其中一个实施例中,所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组:
用于检测Chr7:159143816~159143967区域内的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr7:159143974~159144108区域内的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr7:159144156~159144363区域内的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr7:159144373~159144511区域内的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr7:159144532~159144636区域内的正链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr7:159144649~159144787区域内的正链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr7:159144798~159144996区域内的正链的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr7:159145007~159145313区域内的正链的甲基化水平的第八引物对、用于检测Chr7:159145333~159145547区域内的正链的甲基化水平的第九引物对、用于检测Chr7:159145564~159145800区域内的正链的甲基化水平的第十引物对、用于检测Chr7:159145796~159145586区域内的负链的甲基化水平的第十一引物对、用于检测Chr7:159145571~159145408区域内的负链的甲基化水平的第十二引物对、用于检测Chr7:159145389~159145233区域内的负链的甲基化水平的第十三引物对、用于检测Chr7:159145214~159145111区域内的负链的甲基化水平的第十四引物对、用于检测Chr7:159145098~159145014区域内的负链的甲基化水平的第十五引物对、用于检测Chr7:159144958~159144874区域内的负链的甲基化水平的第十六引物对、用于检测Chr7:159144865~159144663区域内的负链的甲基化水平的第十七引物对、用于检测Chr7:159144649~159144409区域内的负链的甲基化水平的第十八引物对、用于检测Chr7:159144320~159144067区域内的负链的甲基化水平的第十九引物对、和用于检测Chr7:159144035~159143817区域内的负链的甲基化水平的第二十引物对。
在其中一个实施例中,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:1~SEQIDNO:2所示;和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:3~SEQIDNO:4所示;和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:5~SEQIDNO:6所示;和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:7~SEQIDNO:8所示;和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:9~SEQIDNO:10所示;和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:11~SEQIDNO:12所示;和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:13~SEQIDNO:14所示;和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:15~SEQIDNO:16所示;和/或,所述第九引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:17~SEQIDNO:18所示;和/或,所述第十引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:19~SEQIDNO:20所示;和/或,所述第十一引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:21~SEQIDNO:22所示;和/或,所述第十二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:23~SEQIDNO:24所示;和/或,所述第十三引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:25~SEQIDNO:26所示;和/或,所述第十四引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:27~SEQIDNO:28所示;和/或,所述第十五引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:29~SEQIDNO:30所示;和/或,所述第十六引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:31~SEQIDNO:32所示;和/或,所述第十七引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:33~SEQIDNO:34所示;和/或,所述第十八引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:35~SEQIDNO:36所示;和/或,所述第十九引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:37~SEQIDNO:38所示;和/或,所述第二十引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:39~SEQIDNO:40所示。
在其中一个实施例中,与所述第一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:41所示;和/或,与所述第二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:42所示;和/或,与所述第三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:43所示;和/或,与所述第四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:44所示;和/或,与所述第五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:45所示;和/或,与所述第六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:46所示;和/或,与所述第七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:47所示;和/或,与所述第八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:48所示;和/或,与所述第九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:49所示;和/或,与所述第十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:50所示;和/或,与所述第十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:51所示;和/或,与所述第十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:52所示;和/或,与所述第十三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:53所示;和/或,与所述第十四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:54所示和/或,与所述第十五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:55所示;和/或,与所述第十六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:56所示;和/或,与所述第十七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:57所示;和/或,与所述第十八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:58所示;和/或,与所述第十九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:59所示;和/或,与所述第二十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQIDNO:60所示。
一种诊断胃癌的试剂盒,包括上述的核酸产品。
在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
附图说明
图1为测试二中VIPR2基因区域1~6检测胃癌患者血浆样本和正常人血浆样本的ROC曲线;
图2为测试二中VIPR2基因区域7~12检测胃癌患者血浆样本和正常人血浆样本的ROC曲线;
图3为测试二中VIPR2基因区域13~18检测胃癌患者血浆样本和正常人血浆样本的ROC曲线;
图4为测试二中VIPR2基因区域19~20检测胃癌患者血浆样本和正常人血浆样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
此外,术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
VIPR2(Vasoactive intestinal peptide receptor 2,Gene ID:7434)即血管活性肠肽受体2基因。作为血管活性肠肽(一种小的神经肽)的受体,VIPR2参与平滑肌的松弛、外分泌和内分泌作用以及水和离子在肺和小肠上皮细胞中的交换等。以GRCh38.p13为参考,VIPR2基因位于人类7号染色体上,具体位置为Chr7:159028175~159144957。需要说明的还是,本文中提到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考。
胃癌是一种复杂的异质性疾病,在胃从正常粘膜到表型改变,到组织变形,到腺瘤增生到最后形成胃腺癌,涉及多种遗传学和表观遗传学的改变。异常的基因甲基化可以使抑癌基因的表达沉默或者促进癌基因的表达,对肿瘤的发生发展有重要作用。某些DNA分子的异常甲基化可能发生在肿瘤形成的早期,因此,以这些异常甲基化的DNA分子作为液体活检技术的靶标,可以有效的区分正常组织和发生癌变的组织,为实现无创的、高灵敏度、高特异性的胃癌诊断铺平了道路。经本研究发现,以VIPR2基因作为生物标志物,通过检测VIPR2基因的甲基化水平来诊断或辅助诊断胃癌,具有较高的灵敏度和特异性,可以有效地提高胃癌的检出率。
基于此,本申请一实施方式提供了一种胃癌的生物标志物,生物标志物为VIPR2基因,通过检测生物标志物的甲基化水平诊断胃癌。
在一些实施例中,检测VIPR2基因的甲基化水平的目标区域(简称“目标区域”)为VIPR2基因的CpG岛。“CpG岛”指DNA上的一个区域,此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。在正常人基因组中,CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的,而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态,这种甲基化的形式随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态,导致染色体螺旋程度增加,转录抑制,基因表达缺失。
在一些实施例中,目标区域为Chr7:159143816~159145800。进一步地,目标区域为Chr7:159144409~159145389。采用Chr7:159144409~159145389作为目标区域时,检测的灵敏度和特异性更高。
在一些实施例中,目标区域为以下区域中的至少一种:Chr7:159143816~159143967、Chr7:159143974~159144108、Chr7:159144156~159144363、Chr7:159144373~159144511、Chr7:159144532~159144636、Chr7:159144649~159144787、Chr7:159144798~159144996、Chr7:159145007~159145313、Chr7:159145333~159145547、Chr7:159145564~159145800、Chr7:159145796~159145586、Chr7:159145571~159145408、Chr7:159145389~159145233、Chr7:159145214~159145111、Chr7:159145098~159145014、Chr7:159144958~159144874、Chr7:159144865~159144663、Chr7:159144649~159144409、Chr7:159144320~159144067和Chr7:159144035~159143817。
在一些实施例中,目标区域为以下区域中的至少一种:Chr7:159143816~159143967的正链、Chr7:159143974~159144108的正链、Chr7:159144156~159144363的正链、Chr7:159144373~159144511的正链、Chr7:159144532~159144636的正链、Chr7:159144649~159144787的正链、Chr7:159144798~159144996的正链、Chr7:159145007~159145313的正链、Chr7:159145333~159145547的正链、Chr7:159145564~159145800的正链、Chr7:159145796~159145586的负链、Chr7:159145571~159145408的负链、Chr7:159145389~159145233的负链、Chr7:159145214~159145111的负链、Chr7:159145098~159145014的负链、Chr7:159144958~159144874的负链、Chr7:159144865~159144663的负链、Chr7:159144649~159144409的负链、Chr7:159144320~159144067的负链和Chr7:159144035~159143817的负链。
在一些实施例中,通过检测上述目标区域中的目标位点的甲基化水平诊断胃癌。在一个可选地具体示例中,目标区域为Chr7:159144649~159144787区域的正链,目标位点为以下位点中的至少一个:Chr7:159144655、Chr7:159144664、Chr7:159144678、Chr7:159144684、Chr7:159144689、Chr7:159144692、Chr7:159144767、Chr7:159144774和Chr7:159144783。
在一个可选地具体示例中,目标区域为Chr7:159144798~159144996的正链,目标位点为以下位点中的至少一个:Chr7:159144802、Chr7:159144806、Chr7:159144809、Chr7:159144815、Chr7:159144918、Chr7:159144927、Chr7:159144932、Chr7:159144977、Chr7:159144980、Chr7:159144985和Chr7:159144992。
在一个可选地具体示例中,目标区域为Chr7:159145007~159145313的正链,目标位点为以下位点中的至少一个:Chr7:159145009、Chr7:159145011、Chr7:159145026、Chr7:159145263、Chr7:159145277、Chr7:159145279和Chr7:159145313。
在一个可选地具体示例中,目标区域为Chr7:159145389~159145233的负链,目标位点为以下位点中的至少一个:Chr7:159145385、Chr7:159145381、Chr7:159145369、Chr7:159145290、Chr7:159145284、Chr7:159145280、Chr7:159145278、Chr7:159145248和Chr7:159145237。
在一个可选地具体示例中,目标区域为:Chr7:159144958~159144874的负链,目标位点为以下位点中的至少一个:Chr7:159144958、Chr7:159144947、Chr7:159144945、Chr7:159144928、Chr7:159144919、Chr7:159144912、Chr7:159144886和Chr7:159144879。
在一个可选地具体示例中,目标区域为:Chr7:159144649~159144409的负链,目标位点为以下位点中的至少一个:Chr:159144647、Chr:159144644、Chr:159144637、Chr:159144559、Chr:159144552、Chr:159144545、Chr:159144425、Chr:159144416和Chr:159144412。
可以理解的是,在检测目标区域的甲基化水平时,可以针对上述任一目标区域的全区域进行检测,还可以针对上述任一目标区域的部分区域进行检测。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种上述生物标志物在制备用于诊断胃癌的试剂或试剂盒中的应用。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种诊断胃癌的试剂盒,该试剂盒包括用于检测VIPR2基因甲基化水平的试剂。
在一些实施例中,上述试剂盒包括核酸产品。该核酸产品用于检测VIPR2基因甲基化水平。
具体地,核酸产品包括用于检测VIPR2基因甲基化水平的检测引物对。在一些实施例中,上述核酸产品包括用于检测Chr7:159143816~159145800区域的甲基化水平的检测引物对。进一步地,上述核酸产品包括用于检测Chr7:159144409~159145389区域的甲基化水平的检测引物对。
可选地,用于检测VIPR2基因甲基化水平的检测引物对包括以下引物对中的至少一组:用于检测Chr7:159143816~159143967区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159143974~159144108区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144156~159144363区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144373~159144511区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144532~159144636区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144649~159144787区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144798~159144996区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145007~159145313区域的甲基化水平的引物对、Chr7:159145333~159145547区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145564~159145800区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145796~159145586区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145571~159145408区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145389~159145233区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145214~159145111区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159145098~159145014区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144958~159144874区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144865~159144663区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144649~159144409区域的甲基化水平的引物对、用于检测Chr7:159144320~159144067区域的甲基化水平的引物对和用于检测Chr7:159144035~159143817区域的甲基化水平的引物对中的至少一种。
在一些实施例中,用于检测VIPR2基因甲基化水平的检测引物对包括以下引物对中的至少一组:用于检测Chr7:159143816~159143967区域内的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr7:159143974~159144108区域内的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr7:159144156~159144363区域内的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr7:159144373~159144511区域内的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr7:159144532~159144636区域内的正链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr7:159144649~159144787区域内的正链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr7:159144798~159144996区域内的正链的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr7:159145007~159145313区域内的正链的甲基化水平的第八引物对、用于检测Chr7:159145333~159145547区域内的正链的甲基化水平的第九引物对、用于检测Chr7:159145564~159145800区域内的正链的甲基化水平的第十引物对、用于检测Chr7:159145796~159145586区域内的负链的甲基化水平的第十一引物对、用于检测Chr7:159145571~159145408区域内的负链的甲基化水平的第十二引物对、用于检测Chr7:159145389~159145233区域内的负链的甲基化水平的第十三引物对、用于检测Chr7:159145214~159145111区域内的负链的甲基化水平的第十四引物对、用于检测Chr7:159145098~159145014区域内的负链的甲基化水平的第十五引物对、用于检测Chr7:159144958~159144874区域内的负链的甲基化水平的第十六引物对、用于检测Chr7:159144865~159144663区域内的负链的甲基化水平的第十七引物对、用于检测Chr7:159144649~159144409区域内的负链的甲基化水平的第十八引物对、用于检测Chr7:159144320~159144067区域内的负链的甲基化水平的第十九引物对、和用于检测Chr7:159144035~159143817区域内的负链的甲基化水平的第二十引物对。
可选地,第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2所示。第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:4所示。第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:5~SEQ ID NO:6所示。第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:8所示。第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9~SEQ ID NO:10所示。第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:12所示。第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13~SEQ IDNO:14所示。第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:16所示。第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:17~SEQ ID NO:18所示。第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~SEQ ID NO:20所示。第十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:21~SEQ ID NO:22所示。第十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:24所示。第十三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:25~SEQ ID NO:26所示。第十四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:28所示。第十五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:29~SEQ ID NO:30所示。第十六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:32所示。第十七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:34所示。第十八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:35~SEQ ID NO:36所示。第十九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:37~SEQ ID NO:38所示。第二十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:39~SEQ ID NO:40所示。
在一些实施例中,上述诊断胃癌的试剂盒利用荧光定量法检测VIPR2基因甲基化水平。具体地,上述核酸产品还包括与检测引物对对应的检测探针,检测探针上连接有荧光基团。
可选地,与第一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:41所示。与第二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:42所示。与第三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:43所示。与第四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:44所示。与第五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:45所示。与第六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:46所示。与第七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:47所示。与第八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:48所示。与第九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:49所示。与第十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:50所示。与第十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ IDNO:51所示。与第十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:52所示。与第十三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:53所示。与第十四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:54所示。与第十五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:55所示。与第十六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:56所示。与第十七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:57所示。与第十八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:58所示。与第十九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:59所示。与第二十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:60所示。
在一些实施例中,上述核酸产品还包括内参引物对和与内参引物对对应的内参探针。可选地,内参引物对是针对ACTB基因设计的ACTB引物对。在一个可选地具体示例中,ACTB引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:61~62所示,与ACTB引物对对应的内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参引物对和内参探针对应设计即可。
在一些实施例中,检测探针和内参探针上均连接有荧光基团和淬灭基团。可选地,荧光基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。可选地,检测探针和内参探针上连接有荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然,在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,检测探针和内参探针上连接的荧光基团不限于上述,还可以是其他荧光基团。
在一些实施例中,上述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。核酸提取试剂用于提取核酸;甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变;质控品用于质控;PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系;核酸测序试剂用于测序。
在其中一个实施例中,甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
在其中一个实施例中,PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
在其中一个实施例中,质控品包括阳性参考品和阴性参考品。
可以理解的是,在其他实施例中,上述诊断胃癌的试剂盒检测VIPR2基因甲基化水平的方法不限于上述的荧光定量法,还可以是其他方法。例如甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法或甲基化敏感性限制性内切酶法等。对应地,上述诊断胃癌的试剂盒包括相应的试剂。
在一些实施例中,上述诊断胃癌的试剂盒适用的样本包括但不限于血液样本、组织样本和粪便样本。
经验证,上述诊断胃癌的试剂盒的检测灵敏度可以达到80%以上,特异性达到94%以上,利于胃癌的早期诊断。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明,则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
以下实施例中的核酸组合21为核苷酸序列如SEQ ID NO:61~62所示的内参引物对、和与内参引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示的探针;核苷酸序列如SEQ IDNO:63所示的探针的5’端的报告基团为VIC,3’端淬灭基团为BHQ1。另外,实施例1~20中的核苷酸序列如SEQ ID NO:41~60所示的探针均为Taqman探针,5’端的报告基团为FAM,3’端淬灭基团为MGB。
实施例1
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合1和核酸组合21。核酸组合1包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示的探针,具体序列见表1。核酸组合1可检测VIPR2基因上Chr7:159143816~159143967区域(区域1)正链的甲基化水平。区域1正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CGTGATAAAACCCGTTACTTTCCAAGGACCCGCTCCGCAAAGCGCCCACCCTCGAGGGAGGAAAGCCGAGCTGCGCCTCCGCGCAAGGCCAGGGAGTGTGGCTCGAGCCCCGCTGCAGACCGGGCGTCGCCGGTTAATCAATGACACTGTCG。
核酸组合1可检测位于区域1正链上Chr7:159143816、Chr7:159143828、Chr7:159143868、Chr7:159143882、Chr7:159143889、Chr7:159143943、Chr7:159143946、Chr7:159143966位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合2和核酸组合21。核酸组合2包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示的探针,具体序列见表1。核酸组合2可检测VIPR2基因上Chr7:159143974~159144108区域(区域2)正链的甲基化水平。区域2正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CAGCGCAGCCTCCCAGCTGCGGAGGGGCCGCGGATCGATCCAGACCTGCCTCGGCTGCGACGCGCACGAAAACCGCGCGCACCGCAAACCCGCTTCAGTCTCCAAGAGGAAAGCAAGAAACAAGGCTCGGGTTTT。
核酸组合2可检测位于区域2正链上Chr7:159143977、Chr7:159143993、Chr7:159144025、Chr7:159144031、Chr7:159144034、Chr7:159144036、Chr7:159144040和Chr7:159144101位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合3和核酸组合21。核酸组合3包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示的探针,具体序列见表1。核酸组合3可检测VIPR2基因上Chr7:159144156~159144363区域(区域3)正链的甲基化水平。区域3正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
AATTCAGAACTCCATGTGCGAAGGCACTTAATCAACAAACTTATGAGCAGTTAGTTCCTCCAGTGCCCTTGGGAAAAAGCAACTATTTCCAAAAGGAAACTTTATTTAACCGACGCCACGTCCCCCCGACACTAAAACTAACCAGTAAGTACAGGGAGGGACCGAGAGGCATCTGCGGCCAACGCCAACCCCGATCTCCCCGTGAAAC
核酸组合3可检测位于区域3正链上Chr7:159144174、Chr7:159144318、Chr7:159144331、Chr7:159144347和Chr7:159144356位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合4和核酸组合21。核酸组合4包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示的探针,具体序列见表1。核酸组合4可检测VIPR2基因上Chr7:159144373~159144511区域(区域4)正链的甲基化水平。区域4正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
GCGCAGGCGCCCGCAGCTCCCAGCTCCCGGGACGGCCCCGAACGAGCTCATCGTTGACGCGTCCAGGAAGAAACGATCCCGTTTCCAGCAAACCCCGGACGGTGGGGCGCGGGGAAGGGCGCAGGCAGCCTCCCAACCC。
核酸组合4可检测位于该区域正链上Chr7:159144374、Chr7:159144380、Chr7:159144384、Chr7:159144424、Chr7:159144430、Chr7:159144432、Chr7:159144446、Chr7:159144492和Chr7:159144511位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例5
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合5和核酸组合21。核酸组合5包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示的探针,具体序列见表1。核酸组合5可检测VIPR2基因上Chr7:159144532~159144636区域(区域5)正链的甲基化水平,区域5正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
ACCGGAGCTCAGCGCTTCACGCTCTCCGGGAGGAAGCTCCGGACCCCGGGCGACCCCGCTCCCTCTCCCGGACCCCGCCCGCGCTCCAGCACCCGGGAGGAAGGC。
核酸组合5可检测位于区域5正链上Chr7:159144534、Chr7:159144544、Chr7:159144551、Chr7:159144571、Chr7:159144578、Chr7:159144582、Chr7:159144625和Chr7:159144636位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例6
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合6和核酸组合21。核酸组合6包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示的探针,具体序列见表1。核酸组合6可检测VIPR2基因上Chr7:159144649~159144787区域(区域6)正链的甲基化水平。区域6正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
GAGGAGCGCTCTTCTCGGAAGGGGAGAACCGGGTCCGAGGCGCCGTGGGGCGGGGGTCGCGGGCGCACTCACGGGGGCGAGCAGCCAGCAGGTCAGCAGCGCGGGAGGCAGCAGCGTCCGCATCCCGAGCTCAGCGTGC。
核酸组合6可检测位于区域6正链上Chr7:159144655、Chr7:159144664、Chr7:159144678、Chr7:159144684、Chr7:159144689、Chr7:159144692、Chr7:159144767、Chr7:159144774和Chr7:159144783位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例7
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合7和核酸组合21。核酸组合7包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示的探针,具体序列见表1。核酸组合7可检测VIPR2基因上Chr7:159144798~159144996区域(区域7)正链的甲基化水平。区域7正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CCAGCGCCCGCCGCCTCCGTCCTAGGTCCCCGCGGTTCCGCCGCCTCCAGCATGGGCCGGGAGCGAGTGCGCGGAGACCTCGGGCCCCGCAGCTGTAGCCGAGCGCCCGAGCGCGGGGGCCGCCCCCTCCGTCCCGGCAGCTGGAGCGCGCTCAATGCACGCCCGTCCCCCACGCGCCCCGCCGCTCCGCCCCCCGCCC。
核酸组合7可检测位于该区域正链上Chr7:159144802、Chr7:159144806、Chr7:159144809、Chr7:159144815、Chr7:159144918、Chr7:159144927、Chr7:159144932、Chr7:159144977、Chr7:159144980、Chr7:159144985和Chr7:159144992位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例8
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合8和核酸组合21。核酸组合8包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示的探针,具体序列见表1。核酸组合8可检测VIPR2基因上Chr7:159145007~159145313区域正链(区域8)的甲基化水平。区域8正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CCCGCGCTGCCCCAATCCTCGTCTCCCTCCTCCCCCGAGAACCCCCGCTCCGCGCCCCTCCTCACCGCCCCCCACTTCCCCTTCCGCTGCGCCCCGCGCCCTCTCCTCGCCCCTGGGCTCTCTGTCCCCGCCGCGCGCGCTCCCTCTGGTCTCCTCGACCCCCCCAGCCTCTCTCTCCGTTCTCCTCCCCTCTTCCCTGGCCCACGCCCCCCTCCCGGCCGCGCCTCCCCGATCTGTGGGCGGAGGGGCTGGGAAGCGGGGTGCTCAGTGCGCGCCCGGCTCCGAGTAGAGAGAACTGGGGGAGAGC。
核酸组合8可检测位于区域8正链上Chr7:159145009、Chr7:159145011、Chr7:159145026、Chr7:159145263、Chr7:159145277、Chr7:159145279和Chr7:159145313位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例9
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合9和核酸组合21。核酸组合9包括核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示的探针,具体序列见表1。核酸组合9可检测VIPR2基因上Chr7:159145333~159145547区域(区域9)正链的甲基化水平。区域9正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
GAGGAGGACCGGGCCAGGTGTGCGCTCGGAAGGGGCGGATGCCTTTGCGGCCGCCTGTACCTGCCTTTCTAAACAACTGCGGAAGCCCAAGAAAGCGGCCAGAGACCCGTCCGGGGTGGGCGCGCCGTCTTTGTAGCCAGTGGGGCTAGGTTGGGGCATCTGAAAATGGAGAAAATCAGAGTGCTTTTTGGTGGGGATCCCCGCAGCCTCAAAGA。
核酸组合9可检测位于区域9正链上Chr7:159145342、Chr7:159145368、Chr7:159145380、Chr7:159145384和Chr7:159145534位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例10
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合10和核酸组合21。核酸组合10包括核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示的探针,具体序列见表1。核酸组合10可检测VIPR2基因上Chr7:159145564-159145800bp区域(区域10)正链的甲基化水平。区域10正链的核苷酸序列如下(5’-3’):
AGAAAGCTGGAGAAAAACGCAGACGGGGGTATAGGTGGGTCCCAGCCTCAGCTGGGTGGCGGGTTTTGTGTCCTGCGTTTGCAAAACGGGGGTCATTCTCTCCCCGCAAACGCGGCGGCGGGTGGGGAACGCTGGGCGGGGACTCACGCGGTGCCACTGGGGCCGCCCCGCCGCGCCCCACGCGGGACTGCGCGGCCTCCCAAGGCGCCCGCGTGACCAACCCAGGAGAGCTCGGCG。
核酸组合10可检测位于区域10正链上Chr7:159145581、Chr7:159145587、Chr7:159145710、Chr7:159145712、Chr7:159145727、Chr7:159145796和Chr7:159145799位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例11
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合11和核酸组合21。核酸组合11包括核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示的探针,具体序列见表1。核酸组合11可检测VIPR2基因上Chr7:159145796~159145586区域(区域11)负链的甲基化水平。区域11负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
GAGCTCTCCTGGGTTGGTCACGCGGGCGCCTTGGGAGGCCGCGCAGTCCCGCGTGGGGCGCGGCGGGGCGGCCCCAGTGGCACCGCGTGAGTCCCCGCCCAGCGTTCCCCACCCGCCGCCGCGTTTGCGGGGAGAGAATGACCCCCGTTTTGCAAACGCAGGACACAAAACCCGCCACCCAGCTGAGGCTGGGACCCACCTATACCCCCGT。
核酸组合11可检测位于区域11负链上Chr7:159145776、Chr7:159145675、Chr7:159145669、Chr7:159145651和Chr7:159145588位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例12
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合12和核酸组合21。核酸组合12包括核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:52所示的探针,具体序列见表1。该核苷酸组合12可检测VIPR2基因上Chr7:159145571~159145408区域负链(区域12)的甲基化水平。区域12负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
AGCTTTCTGTTCGACCTGATGTCCTCTTTGAGGCTGCGGGGATCCCCACCAAAAAGCACTCTGATTTTCTCCATTTTCAGATGCCCCAACCTAGCCCCACTGGCTACAAAGACGGCGCGCCCACCCCGGACGGGTCTCTGGCCGCTTTCTTGGGCTTCCGCAGT。
核酸组合12可检测位于区域12负链上Chr7:159145560、Chr7:159145459、Chr7:159145456、Chr7:159145454、Chr7:159145429和Chr7:159145413位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例13
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合13和核酸组合21。核酸组合13包括核苷酸序列如SEQ ID NO:25~26所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示的探针,具体序列见表1。核酸组合13可检测VIPR2基因上Chr7:159145389~159145233区域(区域13)负链的甲基化水平。区域13负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CAGGCGGCCGCAAAGGCATCCGCCCCTTCCGAGCGCACACCTGGCCCGGTCCTCCTCTCCCGGCCCCGCGCCGGCCGCTCTCCCCCAGTTCTCTCTACTCGGAGCCGGGCGCGCACTGAGCACCCCGCTTCCCAGCCCCTCCGCCCACAGATCGGGG。
核酸组合13可检测位于该区域负链上Chr7:159145385、Chr7:159145381、Chr7:159145369、Chr7:159145290、Chr7:159145284、Chr7:159145280、Chr7:159145278、Chr7:159145248和Chr7:159145237位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例14
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合14和核酸组合21。核酸组合14包括核苷酸序列如SEQ ID NO:27~28所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示的探针,具体序列见表1。核酸组合14可检测VIPR2基因上Chr7:159145214~159145111区域(区域14)负链的甲基化水平。区域14负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
GGCGTGGGCCAGGGAAGAGGGGAGGAGAACGGAGAGAGAGGCTGGGGGGGTCGAGGAGACCAGAGGGAGCGCGCGCGGCGGGGACAGAGAGCCCAGGGGCGAGG。
核酸组合14可检测位于区域14负链上Chr7:159145212、Chr7:159145185、Chr7:159145163和Chr7:159145115位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例15
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合15和核酸组合21。核酸组合15包括核苷酸序列如SEQ ID NO:29~30所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示的探针,具体序列见表1。该核苷酸组合15可检测VIPR2基因上Chr7:159145098~159145014区域(区域15)负链的甲基化。区域15负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
GCGCAGCGGAAGGGGAAGTGGGGGGCGGTGAGGAGGGGCGCGGAGCGGGGGTTCTCGGGGGAGGAGGGAGACGAGGATTGGGGCA。
核酸组合15可检测位于该区域负链上Chr7:159145097、Chr7:159145092、Chr7:159145060、Chr7:159145058、Chr7:159145053、Chr7:159145043和Chr7:159145027位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例16
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合16和核酸组合21。核酸组合16包括核苷酸序列如SEQ ID NO:31~32所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的探针,具体序列见表1。核酸组合16可检测VIPR2基因上Chr7:159144958~159144874区域(区域16)负链的甲基化水平。区域16负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CGTGCATTGAGCGCGCTCCAGCTGCCGGGACGGAGGGGGCGGCCCCCGCGCTCGGGCGCTCGGCTACAGCTGCGGGGCCCGAGGT。
核酸组合16可检测位于区域16负链上Chr7:159144958、Chr7:159144947、Chr7:159144945、Chr7:159144928、Chr7:159144919、Chr7:159144912、Chr7:159144886和Chr7:159144879位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例17
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合17和核酸组合21。核酸组合17包括核苷酸序列如SEQ ID NO:33~34所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:57所示的探针,具体序列见表1。核酸组合17可检测VIPR2基因上Chr7:159144865~159144663区域(区域17)负链的甲基化水平。区域17负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
ACTCGCTCCCGGCCCATGCTGGAGGCGGCGGAACCGCGGGGACCTAGGACGGAGGCGGCGGGCGCTGGGCGGCCCCCGGCACGCTGAGCTCGGGATGCGGACGCTGCTGCCTCCCGCGCTGCTGACCTGCTGGCTGCTCGCCCCCGTGAGTGCGCCCGCGACCCCCGCCCCACGGCGCCTCGGACCCGGTTCTCCCCTTCCGA。
核酸组合17可检测位于区域17负链上Chr7:159144862、Chr7:159144856、Chr7:159144796、Chr7:159144789、Chr7:159144784、Chr7:159144679和Chr7:159144665位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例18
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合18和核酸组合21。核酸组合18包括核苷酸序列如SEQ ID NO:35~36所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:58所示的探针,具体序列见表1。核酸组合18可检测VIPR2基因上Chr7:159144649~159144409区域(区域18)负链的甲基化水平。区域18负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CCCGCCGGTCTTCGCCTTCCTCCCGGGTGCTGGAGCGCGGGCGGGGTCCGGGAGAGGGAGCGGGGTCGCCCGGGGTCCGGAGCTTCCTCCCGGAGAGCGTGAAGCGCTGAGCTCCGGTCCCGCCGGGTTGCGGGACTCGGGTTGGGAGGCTGCCTGCGCCCTTCCCCGCGCCCCACCGTCCGGGGTTTGCTGGAAACGGGATCGTTTCTTCCTGGACGCGTCAACGATGAGCTCGTTCGGG。
核酸组合18可检测位于区域18负链上Chr7:159144647、Chr7:159144644、Chr7:159144637、Chr7:159144559、Chr7:159144552、Chr7:159144545、Chr7:159144425、Chr7:159144416和Chr7:159144412位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例19
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合19和核酸组合21。核酸组合19包括核苷酸序列如SEQ ID NO:37~38所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的探针,具体序列见表1。该核苷酸组合19可检测VIPR2基因上Chr7:159144320~159144067区域(区域19)负链的甲基化水平。区域19负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
TCGGTCCCTCCCTGTACTTACTGGTTAGTTTTAGTGTCGGGGGGACGTGGCGTCGGTTAAATAAAGTTTCCTTTTGGAAATAGTTGCTTTTTCCCAAGGGCACTGGAGGAACTAACTGCTCATAAGTTTGTTGATTAAGTGCCTTCGCACATGGAGTTCTGAATTATTCCCTCTGTGAACCTTAAAAAAAAAGGAAAGAAAAAAGAAAGAAAAAAACCCGAGCCTTGTTTCTTGCTTTCCTCTTGGAGACTGAA。
核酸组合19可检测位于区域19负链上Chr7:159144319、Chr7:159144275、Chr7:159144270和Chr7:159144267位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例20
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的试剂盒,其包括核酸组合20和核酸组合21。核酸组合20包括核苷酸序列如SEQ ID NO:39~40所示的引物对和该引物对对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示的探针,具体序列见表1。核酸组合20可检测VIPR2基因上Chr7:159144035~159143817区域负链(区域20)的甲基化。区域20负链的核苷酸序列如下(5’-3’):
CGTCGCAGCCGAGGCAGGTCTGGATCGATCCGCGGCCCCTCCGCAGCTGGGAGGCTGCGCTGCTGACCCGACAGTGTCATTGATTAACCGGCGACGCCCGGTCTGCAGCGGGGCTCGAGCCACACTCCCTGGCCTTGCGCGGAGGCGCAGCTCGGCTTTCCTCCCTCGAGGGTGGGCGCTTTGCGGAGCGGGTCCTTGGAAAGTAACGGGTTTTATCAC。
核酸组合20可检测位于区域20负链上Chr7:159144035、Chr7:159144032、Chr7:159144026、Chr7:159143937、Chr7:159143927、Chr7:159143920和Chr7:159143829位置上胞嘧啶的甲基化。
表1
/>
测试一
1.DNA模板的提取
收集武汉某医院收集30例胃癌患者的癌组织样本和30例癌旁组织样本。组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。采用QIAamp DNA FFPE TissueKit(56404)提取组织DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
2.亚硫酸氢盐的转化
将提取好的各样本的全部基因组分别进行亚硫酸氢盐转化,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书。
3.PCR反应
将各亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化荧光定量PCR反应以检测目标区域在组织样本的甲基化水平,每个目标区域单独进行检测,即一个PCR管中每次只加入一个目标区域的检测引物对和对应的探针,同时加入内参基因ACTB的检测引物对和对应的探针。各个基因区域及ACTB基因的上下游引物和探针序列如表1所示。
PCR反应体系各组分配方如表2所示。
表2
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5
dNTPs 各2.5mM 3
VIPR2目标区域上游引物 10μM 0.5
VIPR2目标区域下游引物 10μM 0.5
VIPR2目标区域探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB探针 10μM 0.5
Taq酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
如表2所示,在检测VIPR2基因区域1~20中的其中一个区域在样本中的甲基化状态时,只需将该区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和样本DNA等按照表2中的体积加入到反应体系中。
PCR反应条件如表3所示。
表3
阴性对照和阳性对照:在对目的基因的不同区域分别进行检测时,阴性对照和阳性对照应进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照为含有ACTB基因和目标基因序列的人工合成质粒,浓度为103拷贝/微升,阳性对照的制备方法为:将完全甲基化的各目的基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即各扩增区域中除了CG二核苷酸中的C保持不变外,其余位置的C均变成T,其他三种碱基的种类和位置保持不变)进行人工合成,并克隆至载体,形成人工合成质粒。VIPR2基因区域1~20的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1~20的人工合成质粒1:1混合而成。例如区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1:1混合而成。
Ct值读取:PCR完成后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1~2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个基因区域的Ct值。
质量控制:阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
4.QPCR结果分析
结果分析和判读方法:对于组织样本,当某一检测区域在样本上的Ct值≤38时,即认为在该样本在此区域被检出甲基化,若某一检测区域在样本上的Ct值>38,则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比,计算甲基化检测的灵敏度和特异性,结果如表4所示。在本实施例中,灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例,特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表4
从表4可以看出,VIPR2基因区域1~20对胃癌组织样本、癌旁组织样本的检出效果各不相同。整体来看,目标区域1~20在胃癌组织样本中的灵敏度在60%以上,其在癌旁组织样本中的特异性高于73%。另外,可以看出,区域6、区域7、区域8、区域13、区域16和区域18的检测灵敏度和特异性明显优于其它区域,这几个区域在胃癌组织样本中的检出率均大于等于83.3%,在癌旁组织样本中的特异性均大于等于90%。
测试二
1.样本收集、DNA模板的提取和亚硫酸氢盐转化同测试一。
2.PCR扩增及测序
以亚硫酸氢盐转化后的组织基因组DNA为模板,设计甲基化和非甲基化引物对,见表5,进行PCR反应扩增VIPR2基因区域Chr7:159144409~159145389,PCR反应体系见表6,PCR扩增程序见表7。在PCR扩增结束后,使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司),同时从5’端和3’端测序。
表5
表6
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
甲基化上游引物(10μM) 1
甲基化下游引物(10μM) 1
非甲基化上游引物(10μM) 0.5
非甲基化下游引物(10μM) 0.5
热启动Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表7
3.结果分析
根据测序峰图对每个样本的扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶,则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶,则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰),则其为部分甲基化的。如果扩增子中95%以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的,则认为此样本在该基因区域中是甲基化阳性的。对于VIPR2基因区域Chr7:159144409~159145389,共有127个CpG二核苷酸,若某一样本该区域中至少有120个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的,则此样本在该区域为甲基化阳性的。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比,计算甲基化检测的灵敏度和特异性,见表8。
表8
综上,除了使用甲基化荧光定量PCR的方法以外,使用亚硫酸氢盐测序的方法检测VIPR2基因区域Chr7:159144409~159145389的甲基化水平,同样可以有效区分胃癌组织样本和癌旁组织样本,检测的灵敏度大于83%,特异性高于86%。
测试三
考虑到使用甲基化荧光定量PCR的方法检测受试者样本的甲基化程度更加便捷和节约时间,本申请收集了受试者的血液样本,结合表1中展示的引物对和探针检测受试者血浆cfDNA的甲基化状态,进而判断其是否为癌症阳性。具体操作如下:于武汉某医院收集经组织活检确诊为胃癌患者的血浆样本及健康人血浆样本,每人收集5mL,共收集到胃癌患者血浆样本64例,健康人血浆样本53例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作参见试剂盒说明书;并按照测试一提供方法进行重亚硫酸氢盐转化、选用表1中针对VIPR2基因基于20个区域的特异性引物和探针组合进行QPCR实验,QPCR检测结果用2-ΔΔCt法进行ROC分析,统计每个区域对胃癌患者的灵敏度、特异性及AUC值,结果如图1~图4及表9所示。
表9
VIPR2 灵敏度 特异性 AUC值
区域1 63.9% 86.8% 0.745
区域2 68.9% 81.1% 0.736
区域3 60.7% 86.8% 0.743
区域4 72.1% 86.8% 0.798
区域5 70.5% 88.7% 0.799
区域6 80.3% 94.3% 0.873
区域7 83.6% 96.2% 0.898
区域8 82% 96.2% 0.900
区域9 62.3% 84.9% 0.737
区域10 65.6% 88.7% 0.758
区域11 65.6% 84.9% 0.750
区域12 62.3% 88.7% 0.760
区域13 86.9% 94.3% 0.901
区域14 73.8% 92.5% 0.833
区域15 70.5% 90.6% 0.818
区域16 83.6% 96.2% 0.895
区域17 62.3% 90.6% 0.752
区域18 82.0% 88.7% 0.865
区域19 67.2% 86.8% 0.767
区域20 70.5% 88.7% 0.792
从图1~图4及表9可以看出,虽然检测效果各异,但是VIPR2基因区域1~20对胃癌血浆样本和健康人血浆样本可以实现较好的区分,其各区域的检测灵敏度均在60%以上,特异性均在81%以上。其中,区域6、区域7、区域8、区域13、区域16和区域18的检测的AUC值明显高于其他区域,而且,在血浆样本中,这6个区域对胃癌的检测灵敏度均在80%以上,特异性均在94%以上。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是,在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 胃癌的生物标志物、核酸产品和试剂盒
<160> 67
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtgataaaa ttcgttattt tttaagg 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacaatatc attaattaac cgacg 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcgtagtt ttttagttgc ggag 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaacccgaa ccttatttct tactt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatttagaat tttatgtgcg aaggt 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtttcacgaa aaaatcgaaa ttaa 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgtaggcgt tcgtagtttt tag 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattaaaaa actacctacg ccctt 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcggagttt agcgttttac gtt 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccttcctcc cgaatactaa aa 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggagcgtt tttttcggaa 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acacgctaaa ctcgaaatac gaac 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttagcgttcg tcgttttcgt t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacgaaaaa cgaaacgacg a 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcgcgttgt tttaattttc gt 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctctccccc aattctctct ac 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggaggatc gggttaggtg t 21
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tctttaaaac tacgaaaatc cccac 25
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaagttgga gaaaaacgta gacg 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgccgaactc tcctaaatta atc 23
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagttttttt gggttggtta cg 22
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acgaaaatat aaataaatcc caacc 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agttttttgt tcgatttgat gtttt 25
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
actacgaaaa cccaaaaaaa cga 23
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taggcggtcg taaaggtatt cg 22
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccccgatcta taaacgaaaa aacta 25
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggcgtgggtt agggaagag 19
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cctcgcccct aaactctcta tc 22
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgtagcgga aggggaagt 19
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
taccccaatc ctcgtctccc 20
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgtgtattga gcgcgtttta gt 22
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
acctcgaacc ccgcaactat 20
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
attcgttttc ggtttatgtt gga 23
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcgaaaaaaa aaaaccgaat cc 22
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcggtttttt tttgtattta ttggt 25
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cccgaacgaa ctcatcgtta a 21
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcggtttttt tttgtattta ttggt 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttcaatctcc aaaaaaaaaa caaaa 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgtcgtagtc gaggtaggtt tg 22
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtaataaaac ccgttacttt ccaaa 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tttcgaggga ggaaagtcga gttgc 25
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttcggttgcg acgcgtacga aa 22
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tagggaggga tcgagaggta tttgc 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tcgttgacgc gtttaggaag aaacg 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aggaagtttc ggatttcggg cgatt 25
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agaatcgggt tcgaggcgtc gt 22
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cgtttttttc gtttcggtag ttgga 25
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aagcggggtg tttagtgcgc gtt 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cggatgtttt tgcggtcgtt tgt 23
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
atttacgcgg tgttattggg gtcgt 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cgtttgcggg gagagaatga ttttc 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttttattggt tataaagacg gcgcg 25
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttattcggag tcgggcgcgt at 22
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cggagagaga ggttgggggg gtc 23
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cgcggagcgg gggttttc 18
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggacggaggg ggcggttttc 20
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttgggcggtt ttcggtacgt tga 23
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tttcggagag cgtgaagcgt tgagt 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gggacgtggc gtcggttaaa taaag 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttcggtttgt agcggggttc gagtt 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 62
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggagtggttt ttgggtttg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cgtgaaacgc gtagttcgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcactaacta caaaaacgac gcg 23
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggggttgtga aatgtgtagt ttgt 24
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ccccactaac tacaaaaaca acaca 25

Claims (11)

1.一种胃癌的生物标志物,其特征在于,所述生物标志物为VIPR2基因,通过检测所述生物标志物的甲基化水平诊断胃癌。
2.如权利要求1所述的生物标志物在制备用于诊断胃癌的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种核酸产品,其特征在于,包括用于检测VIPR2基因甲基化水平的检测引物对。
4.根据权利要求3所述的核酸产品,其特征在于,所述核酸产品包括用于检测Chr7:159143816~159145800区域的甲基化水平的检测引物对。
5.根据权利要求4所述的核酸产品,其特征在于,所述核酸产品包括用于检测Chr7:159144409~159145389区域的甲基化水平的检测引物对。
6.根据权利要求3~4任一项所述的核酸产品,其特征在于,所述核酸产品还包括与所述检测引物对对应的检测探针,所述检测探针上连接有荧光基团。
7.根据权利要求5所述的核酸产品,其特征在于,所述检测引物对包括以下引物对中的至少一组:
用于检测Chr7:159143816~159143967区域内的正链的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr7:159143974~159144108区域内的正链的甲基化水平的第二引物对、用于检测Chr7:159144156~159144363区域内的正链的甲基化水平的第三引物对、用于检测Chr7:159144373~159144511区域内的正链的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr7:159144532~159144636区域内的正链的甲基化水平的第五引物对、用于检测Chr7:159144649~159144787区域内的正链的甲基化水平的第六引物对、用于检测Chr7:159144798~159144996区域内的正链的甲基化水平的第七引物对、用于检测Chr7:159145007~159145313区域内的正链的甲基化水平的第八引物对、用于检测Chr7:159145333~159145547区域内的正链的甲基化水平的第九引物对、用于检测Chr7:159145564~159145800区域内的正链的甲基化水平的第十引物对、用于检测Chr7:159145796~159145586区域内的负链的甲基化水平的第十一引物对、用于检测Chr7:159145571~159145408区域内的负链的甲基化水平的第十二引物对、用于检测Chr7:159145389~159145233区域内的负链的甲基化水平的第十三引物对、用于检测Chr7:159145214~159145111区域内的负链的甲基化水平的第十四引物对、用于检测Chr7:159145098~159145014区域内的负链的甲基化水平的第十五引物对、用于检测Chr7:159144958~159144874区域内的负链的甲基化水平的第十六引物对、用于检测Chr7:159144865~159144663区域内的负链的甲基化水平的第十七引物对、用于检测Chr7:159144649~159144409区域内的负链的甲基化水平的第十八引物对、用于检测Chr7:159144320~159144067区域内的负链的甲基化水平的第十九引物对、和用于检测Chr7:159144035~159143817区域内的负链的甲基化水平的第二十引物对。
8.根据权利要求7所述的核酸产品,其特征在于,所述第一引物对的核苷酸序列如SEQID NO:1~SEQ ID NO:2所示;和/或,所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~SEQID NO:4所示;和/或,所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:5~SEQ ID NO:6所示;和/或,所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:8所示;和/或,所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9~SEQ ID NO:10所示;和/或,所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:12所示;和/或,所述第七引物对的核苷酸序列如SEQID NO:13~SEQ ID NO:14所示;和/或,所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:16所示;和/或,所述第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:17~SEQ ID NO:18所示;和/或,所述第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:19~SEQ ID NO:20所示;和/或,所述第十一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:21~SEQ ID NO:22所示;和/或,所述第十二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:24所示;和/或,所述第十三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:25~SEQ ID NO:26所示;和/或,所述第十四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:27~SEQ ID NO:28所示;和/或,所述第十五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:29~SEQ ID NO:30所示;和/或,所述第十六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:31~SEQ IDNO:32所示;和/或,所述第十七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:34所示;和/或,所述第十八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:35~SEQ ID NO:36所示;和/或,所述第十九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:37~SEQ ID NO:38所示;和/或,所述第二十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:39~SEQ ID NO:40所示。
9.根据权利要求8所述的核酸产品,其特征在于,与所述第一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:41所示;和/或,与所述第二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:42所示;和/或,与所述第三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:43所示;和/或,与所述第四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:44所示;和/或,与所述第五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:45所示;和/或,与所述第六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:46所示;和/或,与所述第七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:47所示;和/或,与所述第八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:48所示;和/或,与所述第九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ IDNO:49所示;和/或,与所述第十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:50所示;和/或,与所述第十一引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:51所示;和/或,与所述第十二引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:52所示;和/或,与所述第十三引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:53所示;和/或,与所述第十四引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:54所示和/或,与所述第十五引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:55所示;和/或,与所述第十六引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:56所示;和/或,与所述第十七引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:57所示;和/或,与所述第十八引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:58所示;和/或,与所述第十九引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:59所示;和/或,与所述第二十引物对对应的检测探针的核酸序列如SEQ ID NO:60所示。
10.一种诊断胃癌的试剂盒,其特征在于,包括权利要求3~9任一项所述的核酸产品。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控品、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
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