CN117587125A - 检测甲基化的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种检测甲基化的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用，其中，以GRch38.p14为参考基因组，上述目标区域包括Chr1:63323655‑63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924‑180649302区域的全长或部分区域。通过检测上述目标区域的甲基化水平，能够提高对胰腺癌的诊断灵敏度和特异性，从而提高胰腺癌的早期检出率，为患者争取治疗时间，且检测过程能以微创甚至无创的方式进行，减少检测对患者产生的额外痛苦。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测甲基化的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。
背景技术
胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈现逐年增长的趋势，且死亡率居高不下。胰腺癌俗称“癌王”，其恶性程度极高，预后差，平均生存期小于12个月，5年生存率约9％。此外，胰腺癌起病隐匿，绝大多数患者在肿瘤恶化到晚期之前没有明显症状，因此一经发现多为晚期，丧失了最佳的手术治疗时机。
胰腺中一个细胞内基因发生突变到形成实体瘤，需要经历数年的时间，这为胰腺癌的早期筛查和诊断提供了较长的时间窗口。目前临床中常用影像学检查(如腹部超声、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、内窥镜超声(EUS)和正电子发射断层扫描(PET)等)来初步诊断胰腺癌，而确诊还需要进行组织病理学或细胞病理学检查。然而影像学检查难以发现5mm以下的肿块，待可以明确诊断时，绝大多数胰腺癌细胞已经侵犯周围组织和血管等。目前仍缺少灵敏度较高的检测手段。
发明内容
基于此，本申请提供一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。本申请通过检测特定区域的甲基化水平，能够提高胰腺癌的检测灵敏度。
此外，还提供一种诊断胰腺癌的核酸组合物和试剂盒。
检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用，以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，所述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
一种诊断胰腺癌的核酸组合物，所述核酸组合物能够检测目标区域的甲基化水平，以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，所述核酸组合物包括能够检测所述目标区域的甲基化水平的引物组。
在其中一个实施例中，所述引物组包括以下引物组中的至少一组：核苷酸序列如SEQ ID NO:7～10所示的引物组，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:11～14所示的引物组。
在其中一个实施例中，所述核酸组合物包括能够检测Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对。
在其中一个实施例中，所述引物对包括以下引物对中的至少一对：核苷酸序列如SEQ ID NO:33～34所示的第一引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:36～37所示的第二引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:39～40所示的第三引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:42～43所示的第四引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:45～46所示的第五引物对、核苷酸序列如SEQID NO:48～49所示的第六引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:51～52所示的第七引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:54～55所示的第八引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:57～58所示的第九引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸组合物还包括与所述引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中，所述检测探针包括以下检测探针中的至少一种：核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示的第一检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示的第二检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示的第三检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示的第四检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示的第五检测探针、核苷酸序列如SEQ IDNO:50所示的第六检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示的第七检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的第八检测探针和核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的第九检测探针；其中，所述第一检测探针与所述第一引物对对应，所述第二检测探针与所述第二引物对对应，所述第三检测探针与所述第三引物对对应，所述第四检测探针与所述第四引物对对应，所述第五检测探针与所述第五引物对对应，所述第六检测探针与所述第六引物对对应，所述第七检测探针与所述第七引物对对应，所述第八检测探针与所述第八引物对对应，所述第九检测探针与所述第九引物对对应。
一种诊断胰腺癌的试剂盒，所述试剂盒能够检测目标区域的甲基化水平，以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，所述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，所述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测所述目标区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括能够检测所述目标区域的甲基化水平的试剂，所述试剂包括如上述任一实施例所述的核酸组合物。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种：核酸提取试剂、甲基化转化试剂、核酸纯化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文所述的“优选地”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。所述的“进一步”用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本文所述的“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
所述的“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
所述的“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化，或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
所述的“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。
所述的“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
所述的“TaqMan探针”是指包含5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本申请一实施方式提供了一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用，以GRch38.p14为参考基因组，上述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，上述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
通过检测上述目标区域的甲基化水平，能够提高对胰腺癌的诊断灵敏度和特异性，从而提高胰腺癌的早期检出率，为患者争取治疗时间，且检测过程能以微创甚至无创的方式进行，减少检测对患者产生的额外痛苦。
可以理解的是，染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构。需要说明的是，在本文中，对于一个区域，如果未指明是DNA的正链还是负链，则表示既可以是该区域的DNA的正链，也可以是该区域的DNA的负链，还可以是该区域的DNA的正负两条链。例如，若区域Chr1:63323655-63324026描述为“Chr1:63323655-63324026区域”，则表示可以是Chr1:63323655-63324026区域内的DNA的正链，也可以是Chr1:63323655-63324026区域内的DNA的负链，还可以是Chr1:63323655-63324026区域内的DNA的正、负两条链。
本申请一实施方式还提供了一种诊断胰腺癌的核酸组合物，该核酸组合物能够检测目标区域的甲基化水平，以GRch38.p14为参考基因组，上述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物包括能够检测上述目标区域的甲基化水平的引物组。
优选地，上述引物组包括以下引物组中的至少一组：核苷酸序列如SEQ ID NO:7～10所示的引物组，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:11～14所示的引物组。以上两个引物组均包含甲基化引物对和非甲基化引物对，可用于亚硫酸氢盐测序法以检测目标区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物包括能够检测Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对。
优选地，上述引物对包括以下引物对中的至少一对：核苷酸序列如SEQ ID NO:33～34所示的第一引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:36～37所示的第二引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:39～40所示的第三引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:42～43所示的第四引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:45～46所示的第五引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:48～49所示的第六引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:51～52所示的第七引物对、核苷酸序列如SEQID NO:54～55所示的第八引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:57～58所示的第九引物对。
进一步地，上述核酸组合物还包括与上述引物对对应的检测探针。
优选地，上述检测探针包括以下检测探针中的至少一种：核苷酸序列如SEQ IDNO:35所示的第一检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示的第二检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示的第三检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示的第四检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示的第五检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示的第六检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示的第七检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的第八检测探针和核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的第九检测探针；其中，第一检测探针与第一引物对对应，第二检测探针与第二引物对对应，第三检测探针与第三引物对对应，第四检测探针与第四引物对对应，第五检测探针与第五引物对对应，第六检测探针与第六引物对对应，第七检测探针与第七引物对对应，第八检测探针与第八引物对对应，第九检测探针与第九引物对对应。
在其中一个实施例中，上述检测探针为TaqMan荧光探针。检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。可以理解的是，对目标区域甲基化的检测与对内参基因的检测可以在同一个反应孔中进行也可以在不同反应孔中进行，根据实际情况来合理选择检测探针的荧光基团。
在其中一个实施例中，采用选自第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对中的一种及其对应的检测探针，以及选自第六引物对、第七引物对、第八引物对和第九引物对中的一种及其对应的检测探针的组合，可以通过荧光定量PCR法检测目标区域的甲基化水平。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种诊断胰腺癌的试剂盒，该试剂盒能够检测目标区域的甲基化水平，以GRch38.p14为参考基因组，上述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，上述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，上述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测所述目标区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
在其中一个实施例中，上述试剂盒包括能够检测所述目标区域的甲基化水平的试剂，该试剂包括如上述任一实施例所述的核酸组合物。
在其中一个实施例中，上述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种：核酸提取试剂、甲基化转化试剂、核酸纯化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂。
在其中一个实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，质控试剂包括阳性参考品和阴性参考品。
在一些实施例中，上述试剂盒适用的样本包括但不限于组织样本或血液样本，其中，组织样本包括胰腺组织样本，血液样本包括血浆样本、血清样本、全血样本和分离的血细胞样本中的至少一种。
此外，本申请一实施方式还提供了一种诊断胰腺癌的方法，该方法包括步骤a1和步骤a2。具体地：
步骤a1：获取待测者样本在目标区域的甲基化水平的数据，以GRch38.p14为参考基因组，该目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域；上述样本包括胰腺组织样本和血液样本中的至少一种。
在其中一个实施例中，血液样本包括血浆样本、血清样本、全血样本和分离的血细胞样本中的至少一种。
在其中一个实施例中，上述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
步骤a2：根据上述数据判断该待测者是否患有胰腺癌。
具体地，若上述数据显示该待测者样本在目标区域为甲基化阳性，则判断该待测者患有胰腺癌。
在其中一个实施例中，上述数据为亚硫酸氢盐测序数据。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶，则其为部分甲基化的。如果测序区域中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的(包括完全甲基化和部分甲基化)，则认为此样本在该区域是甲基化阳性的；否则认为此样本在该区域为甲基化阴性。若目标区域中至少一个区域为甲基化阳性，则认为此样本是胰腺癌阳性样本，该待测者患有胰腺癌；否则，认为此样本是胰腺癌阴性样本，该待测者不患有胰腺癌。
在其中一个实施例中，上述数据为甲基化特异性PCR检测数据。
在其中一个实施例中，上述样本为胰腺组织样本，若目标区域中至少一个区域的Ct值≤38，认为此样本为胰腺癌阳性样本，该待测者患有胰腺癌；否则，认为此样本是胰腺癌阴性样本，该待测者不患有胰腺癌。
在其中一个实施例中，上述样本为血浆样本，若目标区域中至少一个区域的Ct值≤45，认为此样本为胰腺癌阳性样本，该待测者患有胰腺癌；否则，认为此样本是胰腺癌阴性样本，该待测者不患有胰腺癌。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
亚硫酸氢盐测序法分析目标区域的甲基化状态及其诊断胰腺癌的性能
1.样本的收集
共收集已确诊为胰腺癌的胰腺组织样本86例，收集健康人的抗凝血血液样本102例作为对照。胰腺组织样本均为经过福尔马林浸泡和石蜡包埋的组织。所有样本的收集过程均经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取
当所用DNA来源于胰腺组织时，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
抗凝血血液样本经离心后，取白细胞层用于基因组DNA的提取。采用天根生化科技(北京)有限公司的离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行白细胞基因组DNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
3.样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.PCR扩增及测序
以GRch38.p14为参考基因组，以位于Chr1:63323655-63324026(区域1)的DNA片段(SEQ ID NO:1)和位于Chr5:180648924-180649302(区域2)的DNA片段(SEQ ID NO:4)为参考，分别以完全甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列和完全未甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计两个区域各自对应的甲基化的引物对和非甲基化的引物对，扩增相应的模板区域(扩增子的序列如表1所示)。筛选最佳的甲基化引物对和非甲基化引物对的投入配比，以保证在一个PCR反应体系中同时加入甲基化引物对和非甲基化引物对时，当模板中存在大于或等于1％的甲基化序列时，即可扩增得到甲基化的产物，仅当模板为非甲基化序列时，扩增产物为非甲基化产物。
表1.Chr1:63323655-63324026和Chr5:180648924-180649302的DNA序列
以转化后的组织样本DNA或白细胞基因组DNA为模板，分别以表2中SEQ ID NO:7～10和SEQ ID NO:11～14为引物对，进行PCR反应来扩增区域1和区域2。PCR反应的配置体系如表3所示，体系中用到的DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara,Cat:R010A)。PCR扩增程序同表4，在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序，同时从5’端和3’端测序。
表2.甲基化引物对和非甲基化引物对
表3.PCR反应体系
| 组分 | 用量(μL) |
| 10×buffer(Mg2+Free) | 5 |
| 25mM Mg2+ | 4 |
| dNTP Mix(10mM each) | 1 |
| 甲基化上游引物(10μM) | 1 |
| 甲基化下游引物(10μM) | 1 |
| 非甲基化上游引物(10μM) | 0.5 |
| 非甲基化下游引物(10μM) | 0.5 |
| DNA聚合酶 | 0.5 |
| 模板DNA(5ng/μL) | 10 |
| 超纯水 | 补至50 |
表4.PCR扩增程序
5.结果分析
根据测序峰图对每个样本中两个不同扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。
如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的(包括完全甲基化和部分甲基化)，则认为此样本在该扩增区域是甲基化阳性的；否则认为此样本在该扩增区域为甲基化阴性。
当仅以区域1作为目标区域时，若待测样本在区域1为甲基化阳性，则此样本为胰腺癌阳性样本；若待测样本在区域1为甲基化阴性，则此样本为胰腺癌阴性样本。当仅以区域2作为目标区域时，判断胰腺癌阳性样本和阴性样本的原理与上述相同。
当以区域1和区域2同时作为目标区域时，若待测样本在区域1和区域2中至少一个区域为甲基化阳性，则此样本为胰腺癌阳性样本；若待测样本在区域1和区域2中都为甲基化阴性，则此样本为胰腺癌阴性样本。
分别计算组织样本和白细胞样本在区域1和/或区域2的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目；并计算利用区域1和/或区域2的甲基化水平区分胰腺癌组织样本和健康白细胞样本的灵敏度和特异性，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
利用亚硫酸氢盐测序的方法，通过检测区域1和/或区域2的甲基化水平诊断胰腺癌的灵敏度和特异性如表5所示。
表5.区域1和/或区域2的甲基化水平诊断胰腺癌的灵敏度和特异性
由表5可以看出，利用亚硫酸氢盐测序的方法，单独检测区域1或区域2的甲基化水平，来区分胰腺癌组织样本和健康人白细胞样本的效果不如同时检测区域1和区域2的效果好。虽然通过单独检测区域1或区域2来检测出健康人白细胞样本的特异性大于97％，但是其检测出胰腺癌组织样本的灵敏度最高仅为63.95％。若同时检测区域1和区域2的甲基化水平，其检测胰腺癌组织样本的灵敏度可提高至93.02％，同时，其检测健康人白细胞样本的特异性仍然较高，为97.06％。可见，检测区域1和区域2的甲基化水平，其诊断性能优于单独检测其中一个区域。
实施例2
荧光定量甲基化特异性PCR法分析组织样本的目标区域的甲基化状态及其诊断胰腺癌的性能
本实施例提供了基于荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)的方法检测区域1的部分区域和区域2的部分区域的甲基化水平的方法，可以根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本，该方法简单、便捷且易于操作，可以在半个工作日内出示检测报告。具体的实验流程及检测效果如下所示。
1.样本的收集
胰腺癌组织样本和健康人抗凝血血液样本的收集与实施例1中的相同。
2.样本DNA的提取
组织样本和白细胞样本DNA的提取同实施例1中步骤2。
3.样本DNA的转化和纯化
步骤同实施例1中步骤3。
4.荧光定量甲基化特异性PCR
在本实施例中，仅检测区域1的子区域(部分区域)和区域2的子区域(部分区域)的甲基化水平，这些子区域的DNA片段长度不超过170bp。此外，本实施例仅列举了区域1的5个子区域(区域1A、区域1B、区域1C、区域1D和区域1E)和区域2的4个子区域(区域2A、区域2B、区域2C和区域2D)的组合。可以理解的是，区域1的子区域不仅包括区域1A、区域1B、区域1C、区域1D和区域1E，还包括其它未列举的子区域；区域2的子区域不仅包括区域2A、区域2B、区域2C和区域2D，还包括其它未列举的子区域。
设计针对各个子区域的检测引物对和检测探针，以经亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板，进行甲基化荧光定量PCR反应以检测各个样本中区域1的子区域和区域2的子区域的组合的甲基化状态。区域1A、区域1B、区域1C、区域1D、区域1E、区域2A、区域2B、区域2C和区域2D的DNA序列，以及转化后的DNA序列如表6所示。用于扩增和检测各个子区域的引物对和探针的核苷酸序列如表7所示，检测引物对和探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点如表8所示。
表6.各个子区域的位置及核苷酸序列
表7.检测引物对和探针的核苷酸序列
表8.检测引物对及探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点
当同时检测区域1的任一子区域和区域2的任一子区域的组合的甲基化水平时，在PCR管中需加入对应的检测引物对和检测探针，同时扩增两个子区域。此时，根据检测的目的区域不同，共有20种组合方式，本实施例仅展示12种组合方式来举例说明检测组合的甲基化水平诊断胰腺癌的效果，子区域的组合方式如表9所示。
PCR扩增时，每个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外，需按照表9中的组合方式加入两个子区域对应的检测引物对和探针，此外，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和探针。
检测探针均为TaqMan探针，两个目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团分别为FAM和ROX，3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应体系的配置如表10所示，按照表11展示的扩增程序进行PCR扩增。
表9.区域1的子区域和区域2的子区域的组合方式
表10、qMSP反应体系
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 3 |
| 区域1子区域上游引物 | 10μM | 0.5 |
| 区域1子区域下游引物 | 10μM | 0.5 |
| 区域1子区域检测探针 | 10μM | 0.5 |
| 区域2子区域上游引物 | 10μM | 0.5 |
| 区域2子区域下游引物 | 10μM | 0.5 |
| 区域2子区域检测探针 | 10μM | 0.5 |
| ACTB上游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB下游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB检测探针 | 10μM | 0.5 |
| PlatinumTM II Taq Hot-Start DNA Polymerase | / | 0.5 |
| 待测样本DNA(5ng/μL) | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
表11、qMSP反应程序
阴性对照和阳性对照：在检测过程中，需同时设置阴性对照管和阳性对照管，阴性对照管和阳性对照管与实验管仅模板不同，其它反应成分相同。阴性对照管将DNA模板更换为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列片段进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将区域1的子区域1A、子区域1B、子区域1C、子区域1D、子区域1E和区域2的子区域2A、子区域2B、子区域2C、子区域2D各自对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列片段(SEQ ID NO:24～32)进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。阳性对照管DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含SEQ ID NO:24～28序列片段之一的人工合成质粒和103拷贝/微升的含SEQ ID NO:29～32序列片段之一的人工合成质粒等体积混合而成。
Ct值读取：PCR完成后，可手动设置基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环时的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：每个样本进行2～3个重复。阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
5.qMSP结果分析
根据qMSP的结果来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本和白细胞样本，若扩增某一子区域的Ct值≤38，则认为样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一子区域的Ct值＞38，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。
按照表9的组合方式，当利用区域1的一个子区域和区域2的一个子区域的组合作为标志物，通过检测该组合物的甲基化水平来分析其诊断胰腺癌的性能时，胰腺癌阳性样本的判断标准为：待测样本在区域1中所检测的子区域为甲基化阳性；或，待测样本在区域2中所检测的子区域为甲基化阳性；或，待测样本在区域1中所检测的子区域和区域2中所检测的子区域都为甲基化阳性。胰腺癌阴性样本的判断标准为：待测样本在区域1中所检测的子区域为甲基化阴性，且在区域2中所检测的区域为甲基化阴性。
区域1的一个子区域和区域2的一个子区域的组合在胰腺癌组织样本、健康人白细胞样本中的甲基化状态、及其诊断性能如表12所示。
表12.区域组合诊断胰腺癌组织样本、健康人白细胞样本的性能
由表12可以看出，利用qMSP的方法，通过检测区域1的子区域和区域2的子区域的组合的甲基化水平来诊断胰腺癌组织样本的性能优异。在表12中，列举的区域组合检测胰腺癌组织样本的灵敏度范围为89.53％～95.35％，其在健康人白细胞样本中的特异性范围为93.14％～98.04。此外，可以看出不同的组合方式所形成的组合物其诊断胰腺癌样本的性能差别不大，说明区域1的任意一个子区域和区域2的任意一个子区域的组合都可以实现对癌症样本和健康样本的区分。
实施例3
荧光定量甲基化特异性PCR法分析血浆样本目标区域的甲基化状态及其诊断胰腺癌的性能
1.样本的收集
胰腺癌患者血液样本的收集：共收集经组织活检确诊为胰腺癌的患者的抗凝血血液样本77例，每人收集约10mL。健康人抗凝血血液样本的收集与实施例1中的相同。所有血液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取
收集的抗凝血样本经离心后，收集血浆层，用于提取血浆游离DNA。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化
步骤与实施例1中步骤3相同。
4.荧光定量甲基化特异性PCR
步骤与实施例2中步骤4相同。
5.qMSP结果分析
根据qMSP的结果来判断待测样本的甲基化水平。对于血浆样本，若扩增某一子区域的Ct值≤45，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一子区域的Ct值＞45，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。
按照表9的组合方式，当利用区域1的一个子区域和区域2的一个子区域的组合作为标志物，通过检测该组合的甲基化水平来分析其诊断胰腺癌的性能时，胰腺癌阳性样本的判断标准为：待测样本在区域1中所检测的子区域为甲基化阳性；或，待测样本在区域2中所检测的子区域为甲基化阳性；或，待测样本在区域1中所检测的子区域和区域2中所检测的子区域都为甲基化阳性。胰腺癌阴性样本的判断标准为：待测样本在区域1中所检测的子区域为甲基化阴性，且在区域2中所检测的区域为甲基化阴性。
区域1的一个子区域和区域2的一个子区域的组合在胰腺癌患者和健康人的血浆样本中的甲基化状态、及其诊断性能如表13所示。
表13.区域组合诊断胰腺癌、健康人血浆样本的性能
由表13可以看出，利用qMSP的方法，通过检测区域1的子区域和区域2的子区域的组合的甲基化水平来诊断胰腺癌血浆样本的性能优异。在表13中，列举的组合物检测胰腺癌患者血浆样本的灵敏度范围为80.52％～88.31％，其在健康人血浆样本中的特异性范围为94.12％～98.04％。可以理解的是，由于血浆中靶标DNA片段的丰富很低，所以目标组合检测胰腺癌血浆样本的灵敏度低于组织样本。此外，可以看出不同的组合方式所形成的组合物其诊断胰腺癌样本的性能差别不大，说明区域1的任意一个子区域和区域2的任意一个子区域的组合都可以实现对癌症样本和健康样本的区分。本实施例提供的血浆cfDNA甲基化检测方法有助于实现胰腺癌的无创或微创诊断。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (12)
1.检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用，其特征在于，以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
3.一种诊断胰腺癌的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物能够检测目标区域的甲基化水平，以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括能够检测所述目标区域的甲基化水平的引物组；
可选地，所述引物组包括以下引物组中的至少一组：核苷酸序列如SEQ ID NO:7～10所示的引物组，以及核苷酸序列如SEQ ID NO:11～14所示的引物组。
5.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括能够检测Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的引物对。
6.根据权利要求5所述的核酸组合物，其特征在于，所述引物对包括以下引物对中的至少一对：
核苷酸序列如SEQ ID NO:33～34所示的第一引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:36～37所示的第二引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:39～40所示的第三引物对、核苷酸序列如SEQID NO:42～43所示的第四引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:45～46所示的第五引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:48～49所示的第六引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:51～52所示的第七引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:54～55所示的第八引物对和核苷酸序列如SEQ IDNO:57～58所示的第九引物对。
7.根据权利要求6所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物还包括与所述引物对对应的检测探针；
进一步地，所述检测探针包括以下检测探针中的至少一种：核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示的第一检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示的第二检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示的第三检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示的第四检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示的第五检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示的第六检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示的第七检测探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的第八检测探针和核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示的第九检测探针；其中，所述第一检测探针与所述第一引物对对应，所述第二检测探针与所述第二引物对对应，所述第三检测探针与所述第三引物对对应，所述第四检测探针与所述第四引物对对应，所述第五检测探针与所述第五引物对对应，所述第六检测探针与所述第六引物对对应，所述第七检测探针与所述第七引物对对应，所述第八检测探针与所述第八引物对对应，所述第九检测探针与所述第九引物对对应。
8.一种诊断胰腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒能够检测目标区域的甲基化水平，以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括Chr1:63323655-63324026区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649302区域的全长或部分区域。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述目标区域包括Chr1:63323792-63323879区域、Chr1:63323807-63323934区域、Chr1:63323754-63323846区域、Chr1:63323702-63323804区域和Chr1:63323878-63323993区域中的至少一个区域的全长或部分区域，以及Chr5:180648924-180649047区域、Chr5:180649020-180649148区域、Chr5:180649140-180649220区域和Chr5:180649151-180649286区域中的至少一个区域的全长或部分区域。
10.根据权利要求8～9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测所述目标区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
11.根据权利要求8～9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测所述目标区域的甲基化水平的试剂，所述试剂包括如权利要求3～7任一项所述的核酸组合物。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种：核酸提取试剂、甲基化转化试剂、核酸纯化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂。
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