CN117778567A - 检测分子标志物的甲基化检测试剂在胰腺癌诊断中的用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种检测分子标志物的甲基化检测试剂在胰腺癌诊断中的用途。具体通过对Chr7:42227942‑42228320的全长或部分区域，和/或Chr5:2038423‑2038857的全长或部分区域的甲基化水平进行检测，可用于胰腺癌的诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，为胰腺癌的无创诊断提供了新的思路，为胰腺癌患者带来福音。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体而言，涉及检测分子标志物的甲基化检测试剂在胰腺癌诊断中的用途。
背景技术
胰腺肿瘤包括胰腺内分泌肿瘤和胰腺外分泌肿瘤，作为一种胰腺外分泌肿瘤，胰腺导管腺癌是最常见的胰腺癌类型。据统计，在2018年，全球范围内胰腺癌的新发病例为458918例，与胰腺癌相关的死亡病例为432242例，其比例接近1:1。在过去的30年中，胰腺癌的发病率增加了一倍以上，预计到2030年，胰腺癌或将成为全球癌症相关的第二大死因。如此高的发病率和死亡率与胰腺癌起病隐匿、侵袭性强密切相关。胰腺癌发病早期往往无特异性的临床症状，因而超过80％的患者在确诊时，癌症已经进入中晚期甚至发生远端转移。此外，胰腺癌预后很差，其5年生存率低于10％。
据报道，胰腺组织内的癌细胞需要上10年的时间才会发生远端转移，那么在早期诊断胰腺癌可以为患者提供宝贵的手术切除治疗的机会，从而提高患者的生活质量和生命周期。目前诊断胰腺癌的常用方法为影像学检查和病理活检，然而影像学检查对于胰腺微小病灶的诊断灵敏度较低，而病理活检则为有创操作，且存在细针穿刺时获取肿瘤细胞稀少的风险。因此，目前临床上急需高灵敏度、高特异性的且无创的胰腺癌诊断方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种高灵敏度的、高特异性的用于诊断胰腺癌的分子标志物用于胰腺癌的诊断。
具体技术方案如下：
本申请的第一方面，提供了检测分子标志物的甲基化水平的试剂在制备胰腺癌诊断产品中的用途，所述分子标志物包含Chr7:42227942-42228320的全长或部分区域和/或，所述分子标志物包含Chr5:2038423-2038857的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，所述分子标志物包含Chr7:42227942-42228320的全长或部分区域和Chr5:2038423-2038857的全长或部分区域。
在其中一个实施例中，所述Chr7:42227942-42228320的部分区域包括区域1、区域2、区域3、区域4、区域5中至少一个，
所述区域1为Chr7:42228172-42228320负链，所述区域2为Chr7:42228129-42228243负链，所述区域3为Chr7:42228113-42228212负链，所述区域4为Chr7:42228060-42228155负链、所述区域5为Chr7:42227942-42228105负链。
在其中一个实施例中，所述Chr5:2038423-2038857部分区域包括区域6、区域7、区域8、区域9中至少一个，
所述区域6为Chr5:2038697-2038857负链，所述区域7为Chr5:2038651-2038798负链，所述区域8为Chr5:2038532-2038657负链，所述区域9为Chr5:2038423-2038568负链。
在其中一个实施例中，所述分子标志物包含区域1～区域9中的至少一个；可选地，所述分子标志物包含区域1～区域5中至少一个，且包含区域6～区域9中的至少一个。
在其中一个实施例中，所述试剂包含PCR扩增的引物对。
在其中一个实施例中，所述引物对选自用于扩增区域1～区域9的引物对中的一组或多组。
所述扩增区域1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示，所述扩增区域2的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示，所述扩增区域3的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25～26所示，所述扩增区域4的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28～29所示，所述扩增区域5的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.31～32所示，所述扩增区域6的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.34～35所示，所述扩增区域7的引物对的核苷酸序列为SEQID NO.37～38所示，所述扩增区域8的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.40～41所示，所述扩增区域9的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.43～44所示。
在其中一个实施例中，所述试剂还包含检测探针。
在其中一个实施例中，所述区域1所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，所述区域2所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述区域3所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述区域4所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述区域5所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述区域6所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述区域7所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述区域8所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示，所述区域9所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
本申请的第二方面，提供了一种核酸产品，所述核酸产品包括上述所定义的引物对。
在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括上述所定义的检测探针。
本申请的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述所定义的试剂。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请对Chr7:42227942-42228320的全长或部分区域，和/或Chr5:2038423-2038857的全长或部分区域的甲基化水平进行检测，可用于胰腺癌的诊断或辅助诊断，其中，两个区域的组合的甲基化水平用于检测血液样本的灵敏度范围为75.32％～87.01％，特异性范围为92.16％～96.08％，具有较高的灵敏度和特异性，为胰腺癌的无创诊断提供了新的思路，为胰腺癌患者带来福音。
附图说明
图1为3个探针在胰腺癌组织和正常组织中的甲基化水平，所用的统计学方法为未配对的student t检验；
图2为子区域组合的方式检测胰腺癌和健康人血浆样本的的灵敏度和特异性。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语解释
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，B，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多组”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
本申请中，“至少一者”、“至少一种”是指可以是所列项目中的任一项，或者是其中任意两种以上的组合。
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。可以理解，本文中被检测基因的目标区域是包括至少一个CpG二核苷酸(CG)的DNA序列。
术语“CpG岛”指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加,而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。
术语“CpG位点”指的是区域中至少一个CpG二核苷酸位点，尤其指区域中至少一个CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本申请一实施方式提供了检测分子标志物的甲基化水平的试剂在制备胰腺癌诊断产品中的用途，分子标志物包含Chr7:42227942-42228320的全长或部分区域和/或，分子标志物包含Chr5:2038423-2038857的全长或部分区域。本申请中所提到的区域位置均以GRCh38.p14为参考基因组。需要说明的是，本申请如果未指明该区域的DNA为正链还是负链，则表示既可以是该区域的DNA的正链，也可以是该区域的DNA的负链，还可以是该区域的DNA的正负两条链。
DNA的甲基化是表观遗传中一种常见的DNA修饰方式，在DNA甲基转移酶的作用下，在其胞嘧啶碱基的第5位碳原子上加上一个甲基基团。DNA的甲基化通常发生在癌症的早期，且稳定存在，其可以调节基因的表达。在癌症患者体内，某些抑癌基因的启动子区域高度甲基化，从而使抑癌基因沉默，导致癌症发生。当体内的肿瘤细胞发生坏死、凋亡或程序性死亡时，可采用液体活检的方式检出其释放到体液中的肿瘤基因的甲基化水平的变化，从而实现胰腺癌的无创或微创诊断。
在一个具体示例中，分子标志物包含Chr7:42227942-42228320的全长或部分区域和Chr5:2038423-2038857的全长或部分区域。
在一个具体示例中，Chr7:42227942-42228320的部分区域包括区域1～区域5中至少一个，其中，区域1为Chr7:42228172-42228320负链，区域2为Chr7:42228129-42228243负链，区域3为Chr7:42228113-42228212负链，区域4为Chr7:42228060-42228155负链、区域5为Chr7:42227942-42228105负链。
在一个具体示例中，Chr5:2038423-2038857部分区域包括区域6～区域9中至少一个，其中，区域6为Chr5:2038697-2038857负链，区域7为Chr5:2038651-2038798负链，区域8为Chr5:2038532-2038657负链，区域9为Chr5:2038423-2038568负链。
可以理解的是，Chr7:42227942-42228320和Chr5:2038423-2038857区域的部分区域也可以是上述未列举的其它位于该区域的部分区域。
在一个具体示例中，分子标志物可包含区域1～区域9中的至少一个。可选地，可包含区域1～区域9中的任意一个。单个区域检测胰腺癌组织样本的灵敏度均高于62％，其检测白细胞样本的特异性均高于83％；其中，区域3、区域4、区域6和区域7的检测性能优于其它区域。进一步，区域4检测效果最佳，其检测组织样本的灵敏度和特异性分别为77.91％和94.12％。
进一步，采用Chr7:42227942-42228320的部分区域和Chr5:2038423-2038857的部分区域组合进行诊断的灵敏度和特异性要优于单个区域。
可选地，分子标志物可包含区域1～区域5中至少一个，且包含区域6～区域9中的至少一个。
可选地，分子标志物可包含区域2～4中的任意一个，且包含区域6～7中的任意一个。其检测胰腺癌血浆样本的灵敏度均高于75％，其检测健康人血浆样本的特异性均高于92％。进一步，区域4和区域7组合检测胰腺癌血浆样本的诊断效果最佳，灵敏度和特异性分别为87.01％和95.1％。
在一个具体示例中，试剂包含PCR扩增的引物对。
在一个具体示例中，引物对选自用于扩增区域1～区域9的引物对中的一组或多组，扩增区域1～区域9的引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.19～20、SEQ ID NO.22～23、SEQ ID NO.25～26、SEQ ID NO.28～29、SEQ ID NO.31～32、SEQ ID NO.34～35、SEQ IDNO.37～38、SEQ ID NO.40～41、SEQ ID NO.43～44所示。
在一个具体示例中，试剂还包含检测探针。需要说明的，探针可为TaqMan探针，标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
在一个具体示例中，探针5’端标记有荧光报告基团FAM或ROX或VIC，3’端标记有荧光猝灭基团为MGB或BHQ-1。可以理解的是，探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
在一个具体示例中，区域1～区域9所对应的检测探针的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.39、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.45所示。
在一个具体示例中，诊断产品包括试剂、试剂盒、芯片和诊断系统。
进一步地，本申请一实施方式提供了一种核酸产品，包括上述的引物对。进一步，还包括上述的检测探针。
进一步地，本申请一实施方式提供了一种试剂盒，包括上述的试剂。
该试剂可通过如下方法中的一种或几种实现对分子标志物的甲基化检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法、甲基化特异性微阵列法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性高效液相层析法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在一个具体示例中，该试剂盒还包括核酸提取试剂、DNA的纯化试剂、亚硫酸氢盐、PCR试剂等。其中PCR试剂可包括缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等。
在一个具体示例中，试剂盒的检测样本可以来自血液(包括全血、血浆、血清)、组织、细胞、粪便、唾液等。
更进一步地，本申请一实施方式还提供了一种诊断系统，包括甲基化信息获取模块和甲基化信息分析判断模块，其中，
甲基化信息获取模块用于获取待测样本中上述区域的甲基化信息；
甲基化信息分析判断模块用于根据上述甲基化信息判断待测样本类型为胰腺癌样本或者健康样本。
在一些具体示例中，分子标志物为选自区域1～5中的任意一个区域和选自区域6～9中的任意一个区域的组合，获取待测样本中分子标志物的甲基化信息，当扩增分子标志物中的任一个或两个区域的Ct值都小于等于阈值时，则认为该样本为甲基化阳性样本，且该样本为癌症阳性样本；当扩增分子标志物中的两个区域的Ct值都大于阈值时，则认为该样本为甲基化阴性样本，且该样本为癌症阴性样本。对于胰腺组织样本，该阈值可以设置为38，对于血浆样本，该阈值可以设置为45。可选地，本领域技术人员也可通过对胰腺癌患者和健康人的样本集进行ROC曲线分析，选择约登指数最大时的截断值作为阈值。
此外，本申请一实施方式还提供了一种胰腺癌的诊断方法，该诊断方法通过检测上述分子标志物的甲基化水平来实现对胰腺癌的诊断，或使用上述试剂、试剂盒或诊断系统对胰腺癌进行诊断，该方法具有高的灵敏度和特异性。
具体实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1分析关键GpG位点的甲基化水平
从TCGA数据库中下载Illumina 450K芯片的甲基化测序数据，分析cg06310816、cg17390350、cg00213479三个探针所检测的CpG位点在胰腺癌组织和正常组织中的甲基化水平。从图1可以看出，所述3个探针检测的CpG位点在胰腺癌组织中的甲基化水平(β值)显著高于正常组织，图1所用的统计学方法为未配对的student t检验。若某个基因其DNA序列在正常组织中是低甲基化的，而其在发生癌变的组织中是高甲基化的，则该基因可能是一个有潜力的检测癌症的分子标志物，通过检测该基因DNA序列甲基化水平的异常来诊断癌症。虽然上述3个探针所识别的CpG位点在胰腺癌组织和正常组织中展示出不同的甲基化状态，但是，上述3个探针所识别的CpG位点的上下游区域是否能够作为诊断胰腺癌的分子标志物仍需要探究。
实施例2检测候选区域甲基化水平的方法
在一段DNA区域内，DNA甲基化转移酶的工作是连续的，则该段DNA可能具有相似的甲基化状态，因此，推测实验例1中在3个探针识别的DNA区域的上下游区域，其甲基化状态可能是相似的。为此，本实施例设计了一系列的检测引物对来分别检测3个探针所识别CpG位点及其上下游区域DNA的甲基化水平，进而探究这些DNA区域是否能作为诊断胰腺癌的甲基化分子标志物。3个探针所识别的关键胞嘧啶位点及本实验例中所延伸的上下游DNA区域如表1所示。分别以Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为靶标，设计甲基化检测引物对和检测探针，利用甲基化特异性荧光定量PCR法来检测这些区域在各类样本中的甲基化状态。
表1关键的胞嘧啶位点及延伸的上下游DNA区域
具体的检测方法如下所示：
1)样本收集
收集已确诊为胰腺癌的胰腺组织样本86例，收集已确诊为胰腺癌的抗凝血血液样本77例，收集健康人的抗凝血血液样本102例作为对照。胰腺组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织。血液样本每份收集的体积为8～10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)样本DNA提取
对于胰腺组织样本，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
对于抗凝血样本，经离心后，取白细胞层用于基因组DNA的提取。采用天根生化科技(北京)有限公司的离心柱型血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行白细胞基因组DNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
抗凝血样本经离心后，收集血浆层，用于提取血浆游离DNA。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3)样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4)甲基化特异性荧光定量PCR
由于血浆cfDNA片段较短，且在170bp处富集，又考虑到荧光定量PCR的扩增效率，难以在血浆样本中直接扩增Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的全长区域。因此，将Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域分为若干个子区域(子区域的DNA片段长度均不超过170bp)，分别检测各个样本在各个子区域中的甲基化状态。
对于各个子区域，以经亚硫酸氢盐转化后的序列作为模板，分别设计用于扩增各个子区域的引物对和检测探针，Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的子区域及其经亚硫酸氢盐转化后的序列如表2所示。用于扩增和检测各个子区域的引物对和检测探针的核苷酸序列如表3所示，检测引物对和检测探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点如表4所示。
表2 Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的子区域
表3扩增和检测各个子区域的引物对和检测探针的核苷酸序列
表4子区域的检测引物对及探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点
按照表5的配方配置甲基化荧光定量PCR反应体系，反应体系中用到的引物对和TaqMan检测探针由上海生工生物合成，用到的模板为从各类样本中提取的且经亚硫酸氢盐转化的DNA，其它组分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。在每个PCR管中，除加入目标区域的引物对和检测探针以外，还需加入内参基因ACTB的引物对和检测探针。内参基因ACTB的上游扩增引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG，SEQ ID NO.46；下游扩增引物为：AATAACACCCCCACCCTGC，SEQ ID NO.47；检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG，SEQ ID NO.48。所述检测探针均为TaqMan探针，目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM或ROX，3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。若只检测一个目标子区域，则在反应体系中加入该子区域对应的扩增引物对和检测探针，若同时检测两个目标子区域，则在反应体系中同时加入这两个子区域对应的扩增引物对和检测探针。PCR反应体系配置结束后按照表6所示的反应程序进行扩增。
表5 qPCR反应体系
表6 qPCR扩增程序
阴性对照管：按照表5的配方配置PCR反应体系，但是模板为TE缓冲液。
阳性对照管：按照表5的配方配置PCR反应体系，但是模板为含ACTB(转化后序列)和目标区域的人工合成的质粒。阳性对照模板的制备方法：将ACTB基因经亚硫酸氢盐转化后的序列和各个子区域经亚硫酸氢盐转化后的序列分别克隆至pUC57上，形成人工合成质粒，将各个质粒均稀释到103拷贝/微升。如区域1的阳性对照模板为：103拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒和103拷贝/微升的含区域1转化后序列的质粒1:1混合而成。
Ct值读取：qPCR反应结束后，可手动调整基线，将基线荧光值标准差的10倍高度对应的荧光强度值设置为阈值，阈值线为穿过阈值的与X轴平行的直线，其必须位于指数扩增期内，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤33，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
实验例3Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的子区域检测组织样本的性能
按照实施例2提供的方法进行86例胰腺癌组织样本和102例健康人的血液样本中白细胞DNA的提取和重亚硫酸氢盐的转化及纯化，然后选用针对各个子区域及内参基因的扩增引物对和探测探针，进行甲基化荧光定量PCR反应。
当目标子区域为单个时，若扩增某一子区域的Ct值≤38，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，且该样本为癌症阳性样本；若扩增某一子区域的Ct值＞38，则认为该样本中此区域为甲基化阴性，且该样本为癌症阴性样本。
当目标区域为两个时，若扩增目标区域中的任一个或两个区域的Ct值都小于等于38，则认为该样本为甲基化阳性样本，且该样本为癌症阳性样本；若扩增目标区域中的两个区域的Ct值都大于38，则认为该样本为甲基化阴性样本，且该样本为癌症阴性样本。
根据上述判断标准，分析利用Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的子区域的甲基化水平检测组织样本的性能，结果如表7所示。
表7各子区域检测胰腺癌组织样本的性能
由表7可以看出，通过检测Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域各个子区域或子区域的组合的甲基化水平，可以有效区分胰腺癌组织样本和健康人白细胞样本。然而，各个子区域或子区域的组合的检测性能不是完全相同的。单个子区域检测胰腺癌组织样本的灵敏度均高于62％，其检测白细胞样本的特异性均高于83％；子区域3、子区域4、子区域6和子区域7的检测性能优于其它子区域；另外，子区域4检测效果最佳，其检测的灵敏度和特异性分别为77.91％和94.12％。当检测的目标区域为两个子区域的组合时，其检测胰腺癌的灵敏度有了显著的提升(均高于82％)，而检测特异性没有明显的下降，说明使用两个子区域的组合作为标志物，通过检测标志物的甲基化水平诊断胰腺癌比使用单个子区域作为标志物诊断效果更优。另外，子区域4和子区域7组合时，其检测胰腺癌组织样本的灵敏度可达91.86％，其检测健康人血液样本的特异性可达92.16％。
实验例4 Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的子区域的组合检测血液样本的性能
按照实施例2提供的方法对77例胰腺癌患者的血液样本和102例健康人的血液样本进行血浆游离DNA的提取和重亚硫酸氢盐的转化及纯化，然后选用针对各个子区域及内参基因的扩增引物对和探测探针，进行甲基化荧光定量PCR反应。由实验例3可以看出，两个子区域组合的方式检测效果更好，因此在检测血液样本时，均使用组合的方式检测待测样本的甲基化水平。PCR结果的判断标准为：若扩增目标区域中的任一个或两个区域的Ct值都小于等于45，则认为该样本为甲基化阳性样本，且该样本为癌症阳性样本；若扩增目标区域中的两个区域的Ct值都大于45，则认为该样本为甲基化阴性样本，且该样本为癌症阴性样本。
根据上述判断标准，分析利用Chr7:42227942-42228320(负链)和Chr5:2038423-2038857(负链)区域的子区域的甲基化水平检测血浆样本的性能，结果如表8所示。
表8各子区域的组合检测胰腺癌血浆样本的性能
由表8可以看出，通过检测Chr7:42227942-42228320(负链)区域中的一个子区域和Chr5:2038423-2038857(负链)区域中一个子区域组合的甲基化水平，可以有效区分胰腺癌和健康人的血浆样本(图2)。在表8列举的子区域组合中，其检测胰腺癌血浆样本的灵敏度均高于75％，其检测健康人血浆样本的特异性均高于92％。此外，同时检测子区域4和子区域7的甲基化水平时，诊断效果最佳，其检测的灵敏度和特异性分别为87.01％和95.1％。该技术方案为胰腺癌的无创诊断提供了新的思路，为胰腺癌患者带来福音。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.检测分子标志物甲基化水平的试剂在制备胰腺癌诊断产品中的用途，其特征在于，以GRCh38.p14为参考，所述分子标志物包含Chr7:42227942-42228320的全长或部分区域和/或，所述分子标志物包含Chr5:2038423-2038857的全长或部分区域。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Chr7:42227942-42228320的部分区域包括区域1、区域2、区域3、区域4和区域5中至少一个，
所述区域1为Chr7:42228172-42228320负链，所述区域2为Chr7:42228129-42228243负链，所述区域3为Chr7:42228113-42228212负链，所述区域4为Chr7:42228060-42228155负链，所述区域5为Chr7:42227942-42228105负链；
所述Chr5:2038423-2038857部分区域包括区域6、区域7、区域8、区域9中至少一个，
所述区域6为Chr5:2038697-2038857负链，所述区域7为Chr5:2038651-2038798负链，所述区域8为Chr5:2038532-2038657负链，所述区域9为Chr5:2038423-2038568负链。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述分子标志物包含区域1～区域9中的至少一个；可选地，所述分子标志物包含区域1～区域5中至少一个，且包含区域6～区域9中的至少一个。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包含PCR扩增的引物对。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述引物对选自用于扩增区域1～区域9的引物对中的一组或多组，
所述扩增区域1的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示，所述扩增区域2的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示，所述扩增区域3的引物对的核苷酸序列如SEQID NO.25～26所示，所述扩增区域4的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28～29所示，所述扩增区域5的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.31～32所示，所述扩增区域6的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.34～35所示，所述扩增区域7的引物对的核苷酸序列为SEQ IDNO.37～38所示，所述扩增区域8的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.40～41所示，所述扩增区域9的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.43～44所示。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述试剂还包含检测探针。
7.根据权利要求6所述的用途，所述区域1所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，所述区域2所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述区域3所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述区域4所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述区域5所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述区域6所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述区域7所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述区域8所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示，所述区域9所对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
8.一种核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括权利要求4或5中所述定义的引物对。
9.根据权利要求8所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括权利要求6或7中所定义的检测探针。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4～7中所定义的试剂。
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