CN116694763A - 一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用 - Google Patents

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CN116694763A CN202310648980.5A CN202310648980A CN116694763A CN 116694763 A CN116694763 A CN 116694763A CN 202310648980 A CN202310648980 A CN 202310648980A CN 116694763 A CN116694763 A CN 116694763A
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用。本发明提供的核酸产品和试剂盒通过检测样本中生物标志物的甲基化水平，可以对肝细胞癌进行检测或诊断，显著提高了肝细胞癌的检测灵敏度和检出率，适用于肝细胞癌的早筛早诊。本发明提供的试剂盒对肝细胞癌血浆样本具有较高的检测灵敏度，其检测肝细胞癌血浆样本的灵敏度可达95.7％，检测健康人血浆样本的特异性可达91.4％。

Description

一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用。
背景技术
原发性肝癌是世界范围内常见的恶性疾病，其发病率居恶性肿瘤第六位，死亡率居癌症相关死亡率的第二位。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的主要病理类型，恶性程度比其它病理类型的原发性肝癌高，有癌症之王之称，其主要的发病原因是乙型病毒性的肝炎、酗酒等各种因素导致肝脏的损伤、慢性炎症损伤，引起肝细胞恶变，形成恶性肿瘤。由于早期诊断率低，大部分HCC患者确诊时就已处于疾病中期或中晚期，治疗效果和预后较差。寻找准确、灵敏、特异的肝细胞癌生物标志物和检测技术，对肝细胞癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。
肿瘤标志物检测是近年发展起来的用于检测疾病的方法，寻找准确、灵敏、特异的肝细胞癌生物标志物对肝细胞癌的早筛早诊具有重要意义。大量研究证实DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA表达异常等细胞表观遗传水平的改变是肿瘤发生与发展的关键事件，其中DNA甲基化检测稳定性好，易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关，是最具肿瘤早筛潜力的标志物。已有研究通过检测外周血中的肿瘤细胞或DNA甲基化，寻找用于肝细胞癌早期诊断的标志物。专利文献CN115315529A公开了一些用于诊断肝细胞癌患者血浆样本的甲基化细胞游离DNA(cfDNA)生物标志物，但其诊断性能仍需要进一步优化。
因此，寻找高灵敏度、高特异性的用于肝细胞癌检测的DNA甲基化生物标志物仍然是急需的。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用，以改善现有的DNA甲基化生物标志物对肝细胞癌的检出率低、检测的灵敏度欠佳等技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于肝细胞癌检测的核酸产品，其为用于检测样本中生物标志物的甲基化水平的核酸产品，其中，所述生物标志物选自如下至少一种区域中的全长或部分区域：区域Ⅰ、区域Ⅱ；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域Ⅰ选自Chr19:19732624-19732815，所述区域Ⅱ选自Chr1:44405339-44405527。
优选地，所述生物标志物选自如SEQ ID NO.1～4所示核苷酸序列中的至少一个。
优选地，所述生物标志物选自如下任一组合：
SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.1的组合；
SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3的组合；
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的组合。
优选地，所述核酸产品包括用于检测所述生物标志物的甲基化水平的引物对，可选地，还包括检测探针。
优选地，所述引物对选自如下引物对中的至少一组：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对。
进一步优选地，所述引物对选自如下(1)-(4)组引物对中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.9～10所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.12～13所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.15～16所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.18～19所示的第四引物对。
优选地，所述检测探针选自如下检测探针中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.14所示；用于检测SEQID NO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供了一种用于肝细胞癌检测的试剂盒，其包括所述的核酸产品。
优选地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或多种。
本发明还提供了所述的核酸产品或所述的试剂盒在制备肝细胞癌诊断产品中的应用。
总体而言，通过本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于肝细胞癌检测的核酸产品和试剂盒，通过检测样本中生物标志物的甲基化水平，对肝细胞癌的检测具有较高的灵敏度和特异性，且肝细胞癌检测的准确度高，不易出现假阳性结果。该试剂盒在血浆游离DNA样本中仍具有优异检测效果，为肝细胞癌的无创或微创、高灵敏度、高特异性检测提供了一种新的检测技术。本发明提供的试剂盒诊断肝细胞癌患者血浆样本的AUC值均大于等于0.873，对肝细胞癌的检出具有较好的准确度，检测灵敏度可达95.7％，检测健康人血浆样本的特异性可达91.4％。
(2)本发明提供了一些能够用于肝细胞癌检测的生物标志物，以单一区域作为生物标志物时，对肝细胞癌血浆样本均具有一定的检出率，其检测肝细胞癌的灵敏度最高可达85.7％，检测健康人的特异性可达91.4％。以单一区域组合作为生物标志物时，其检测肝细胞癌的灵敏度较单一区域有显著提高，其中通过检测以区域1、区域2、区域3和区域4组合作为生物标志物的甲基化水平，肝细胞癌的检测灵敏度可达95.7％。
附图说明
图1为区域1诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图2为区域2诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图3为区域3诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图4为区域4诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图5为组合1(区域1+3)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图6为组合2(区域1+4)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图7为组合3(区域2+3)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图8为组合4(区域2+4)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图9为组合5(区域1+2+3)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图10为组合6(区域2+3+4)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线；
图11为组合7(区域1+2+3+4)诊断肝细胞癌血浆样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”肝细胞癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有肝细胞癌。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”还可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”是指一种可在样品中检测到的指示物。生物标志物可用作个体应答或受益于治疗的可能性的指示物和/或用作以某些分子、病理学、组织学和/或临床表现为特征的疾病或疾患(例如，癌症)特定亚型的指示物。在一些实施例中，生物标记物为基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标记。
术语“cfDNA样本”涵盖的样本包括从个体中获取的包含cfDNA的血液样本或血浆样本。所述cfDNA样本可通过任何合适的方法(例如通过静脉穿刺)获得。该术语还包括在采购后以任何方式处理过的样本，例如用试剂、清洗或富集特定类型的分子(例如，甲基化cfDNA生物标志物)处理过的样本。
术语“亚硫酸氢盐转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐的试剂、亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或其组合，其可用以区分CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤35)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断检测的不同可能切点的真阳性率相比于假阳性率的图。它展示了灵敏度和特异度之间的协调，具体取决于所选的切割点(灵敏度的任何升高都将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。
本发明提供了一种肝细胞癌检测的核酸产品，所述核酸产品用于检测样本中生物标志物的甲基化水平，其中，所述生物标志物选自如下至少一种区域的全长或部分区域：区域Ⅰ、区域Ⅱ；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域Ⅰ选自Chr19:19732624-19732815，所述区域Ⅱ选自Chr1:154567661-154567844。
一些实施例中，所述区域Ⅰ的部分区域选自区域1或区域2，所述区域Ⅱ的部分区域选自区域3或区域4，其中所述区域1选自Chr1:115839038-115839225正链，所述区域2选自Chr19:19732627-19732804负链，区域3选自Chr1:44405349-44405508正链，区域4选自Chr1:44405339-44405527负链。
一些实施例中，所述生物标志物选自如下至少一个区域：区域1、区域2、区域3和区域4。以GRCh38.p14为参考基因组，区域1～4的具体信息如下表所示。
生物标志物 染色体位置(GRCh38.p14) 核苷酸序列
区域1 Chr19:19732624-19732815正链 SEQ ID NO.1
区域2 Chr19:19732627-19732804负链 SEQ ID NO.2
区域3 Chr1:44405349-44405508正链 SEQ ID NO.3
区域4 Chr1:44405339-44405527负链 SEQ ID NO.4
发明人发现：区域1～4均能对肝细胞癌样本和正常样本实现较好区分，进一步实验发现，将本发明中所述区域进行组合，检测区域组合的甲基化水平时，一些区域组合检测肝细胞癌样本的灵敏度和特异性相对于单一区域进行检测时有所提高。
较佳的生物标志物选自如下任一组合：区域3或区域4与区域1的组合；区域3或区域4与区域2的组合；区域1和区域2与区域3的组合；区域2和区域3与区域4的组合；区域1、区域2和区域3与区域4的组合。
一些实施例中，较佳的生物标志物选自如下任一组合：
SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.1的组合；
SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3的组合；
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的组合。
可以理解的是，在检测生物标志物的甲基化水平时，可以针对上述任一生物标志物的全长区域进行检测，还可以针对上述任一生物标志物的部分区域进行检测。
一些实施例中，上述生物标志物来源于ctDNA。ctDNA是一类来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞并释放入血的血浆游离DNA(cfDNA)，其包含多种肿瘤特异性的信息：如肿瘤基因的突变及拷贝数变化，肿瘤DNA的甲基化改变的信息等。在一些实施例中，上述生物标志物来自cfDNA。
一些实施例中，上述核酸产品包括用于检测上述生物标志物的甲基化水平的引物对，可选地，还包括检测探针。本申请对上述引物对没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对，只要可以实现检测上述核苷酸序列是否发生甲基化的目的即可。
可选地，上述引物对选自如下引物对中的至少一组：用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对。
可选地，上述引物对选自如下(1)-(4)组引物对中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.9～10所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.12～13所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.15～16所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.18～19所示的第四引物对。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)等以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的肝细胞癌诊断功能(灵敏度或特异性与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述检测探针选自如下检测探针中的至少一种：用于检测SEQ IDNO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.14所示；用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.20所示。可以理解的是，当进行甲基化特异性荧光定量PCR时，检测探针的核苷酸序列不限于上述，还可以根据上述生物标志物进行设计。
在一些实施例中，上述核酸产品还包括内参引物对和与内参引物对对应的检测探针。可选地，内参引物对是针对ACTB基因设计的检测引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参引物对对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针，可选地，检测探针为TaqMan探针。具体地，上述生物标志物的检测探针和上述内参引物对对应的检测探针均含有荧光基因，其中，荧光基因包括荧光报告基因和荧光淬灭基因。可选地，荧光报告基团位于检测探针的5’端，淬灭基团位于检测探针的3’端。可选地，荧光报告基团选自FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种，荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ-2和BHQ-3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
一些实施例中，上述核酸产品检测样本中生物标志物的甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP Seq)或甲基化DNA免疫沉淀微阵列分析(MeDIP chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了一种肝细胞癌检测的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测样本中生物标志物的甲基化水平的核酸产品。
一些实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或多种。
一些实施例中，甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。一些实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐转化试剂。用亚硫酸氢盐处理DNA会将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但不会影响甲基化胞嘧啶残基。用亚硫酸氢盐处理后，DNA中残留的唯一一种胞嘧啶是甲基化胞嘧啶。
一些实施例中，PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中，上述试剂盒可用于检测样本中上述一种或更多种生物标志物的甲基化水平，其显示与健康对照受试者或未患癌症的受试者相比，来自患有HCC的患者的cfDNA样本中的甲基化频率有所升高。
一些实施例中，上述试剂盒可包含一个或更多个适用于上述试剂盒中含有的组合物的容器。组合物可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料制成，例如玻璃或塑料。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本、组织样本或口腔、鼻咽等拭子来源的细胞样本。
本申请对上述试剂盒检测样本中生物标志物的甲基化水平的方法没有特别的限定，所用方法可以是但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP Seq)或甲基化DNA免疫沉淀微阵列分析(MeDIP chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述样本中目标区域的甲基化水平进行检测，对肝细胞癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述核酸产品或试剂盒在监测患者是否罹患肝细胞癌、或监测HCC患者是否肝细胞癌复发中的应用。在一些实施例中，通过以下方式在一段时间内监测上述患者：以一定间隔重复采集cfDNA样本，并分析上述cfDNA，以确定上述HCC是否正在进展。可监测任何进展期的HCC，包括原发性肿瘤、转移或复发。
一些实施例中，本发明提供的上述核酸产品或试剂盒尤其可用于诊断或监测患有容易发生HCC的基础病症或疾病(例如慢性肝病、肝脏炎症或肝损伤)的患者。其中，容易发生HCC的基础病症或疾病包括但不限于肝硬化、脂肪性肝病、肝炎(例如，酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎或病毒性肝炎)、甲型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、丁型肝炎病毒感染、戊型肝炎病毒感染、遗传性血色病、威尔逊氏症、原发性胆汁性肝硬化和α1抗胰蛋白酶缺乏症。
本发明还提供了上述的核酸产品或试剂盒在制备肝细胞癌诊断产品中的应用。肝细胞癌诊断产品可以为试剂、试剂盒、芯片和测序文库等中的一种或多种。
本发明提供了一些能够用于检测肝细胞癌的生物标志物，通过检测样本中生物标志物的甲基化水平，能够对肝细胞癌进行较高的灵敏度和特异性检测，并且检测的准确度高，不易出现假阳性结果。具体地，本发明提供的试剂盒检测肝细胞癌患者血浆样本的AUC值均大于等于0.873，对肝细胞癌的检出具有较好的准确度，检测灵敏度可达95.7％，检测健康人血浆样本的特异性可达91.3％。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
本申请所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测甲基化水平
以GRCh38.p14为参考基因组，以区域1(Chr19:19732624-19732815正链)、区域2(Chr19:19732627-19732804负链)、区域3(Chr1:44405349-44405508正链)、区域4(Chr1:44405339-44405527负链)为目标序列，设计适用于荧光定量PCR扩增的甲基化引物对和检测探针。具体的实验步骤包括：
1.DNA样本的提取、纯化和转化
使用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen，Valencia，CA，USA)从8mL血浆中提取cfDNA。DNA用Nanodrop 2000超微量分光光度计(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)定量。将基因组DNA进行亚硫酸氢钠化学修饰，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶同时保持甲基化胞嘧啶不变。采用ZYMO公司提供的EZ DNA Methylation-GoldKit进行DNA转化及纯化，具体操作参考试剂盒说明书完成。区域1～4的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示。
表1区域1～4的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列
2.甲基化特异性荧光定量PCR
1)甲基化引物对和检测探针设计：
分别以区域1～4经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计甲基化检测引物对和检测探针用以扩增目标区域。甲基化检测引物对的序列、检测探针的序列具体信息如表2所示。
表2检测引物对、检测探针的核苷酸序列
2)qPCR扩增：
在对样本进行qMSP分析之前，需验证甲基化引物对的扩增性能。具体地，102拷贝/uL、103拷贝/uL、104拷贝/uL、105拷贝/uL、106拷贝/uL含亚硫酸氢盐转化后的各个目标区域的质粒，以及按上述梯度稀释的含转化后的内参基因ACTB质粒(上游扩增引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.21)，下游扩增引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQID NO.22)，检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.23))被扩增以构建标准曲线，并计算各个目标区域的扩增效率，发现表2提供的检测引物对的扩增效率均处于90％～110％之间。
表3 qMSP反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
每一目标区域上游引物 10μM 0.5
每一目标区域下游引物 10μM 0.5
每一目标区域检测探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB检测探针 10μM 0.5
PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
表4 qMSP反应程序
进行qPCR反应检测样本时，需要同时设置阴性对照和阳性对照，以保证实验体系是可靠的。阴性对照管：按照表3的配方配置PCR反应体系，但是模板为TE缓冲液。阳性对照管：按照表3的配方配置PCR反应体系，模板为含ACTB(转化后序列)和区域(转化后序列)的人工合成的质粒。阳性对照模板的制备方法：将ACTB基因经亚硫酸氢盐转化后的序列和各个区域经亚硫酸氢盐转化后的序列分别克隆至pUC57上，形成人工合成质粒，将各个质粒均稀释到103拷贝/微升。例如区域1的阳性对照模板为：103拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒和103拷贝/微升的含区域1转化后序列的质粒1:1混合而成。检测探针均为TaqMan探针，目标区域1、2、3、4的检测探针5’端的荧光报告基团分别为ROX、FAM、CY3、CY5；3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)qMSP结果分析
定义ΔCt＝Ct(目标区域)-Ct(ACTB)，计算所有样本中扩增各个区域的ΔCt值，然后使用IBM SPSS 20.0软件进行受试者操作曲线特征(ROC)分析。根据ROC分析结果，选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，若待测样本的ΔCt值小于等于截断值，则该样本为甲基化阳性，该样本为肝细胞癌阳性样本；若待测样本的ΔCt值大于截断值，则该样本为甲基化阴性，该样本为肝细胞癌阴性样本。
实施例2qMSP法检测待测样本中单个区域的甲基化水平诊断肝细胞癌血浆样本的性能
1)样本收集
收集93例经组织活检确诊为肝细胞癌的患者的血浆样本，收集健康人的血浆样本145例作为对照，每份血样样本的体积大于8mL。所有血浆样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)血浆样本中游离DNA的提取、纯化和转化同实施例1。
3)qMSP检测及结果分析
采用实施例1提供的引物对和探针分别扩增区域1～4，根据得到的ΔCt值进行ROC分析，ΔCt值为目标基因与内参基因ACTB的Ct值之差。具体地，将肝细胞癌血浆样本的状态变量定为“1”，将健康人血浆样本的状态变量定为“0”，点击“分析”-“ROC曲线图”，分别指定检验变量和状态变量的值，将状态变量的值定为1，并选择“较小的检验结果表示更明确的检验”，得出检验肝细胞癌的ROC分析结果，选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，并得到平均AUC值、灵敏度和特异性数值，结果如表5所示，区域1、2、3、4检测肝细胞癌血浆样本的ROC曲线分别如图1、图2、图3、和图4所示。
表5区域1～4检测肝细胞癌血浆样本的性能
目标区域 灵敏度(％) 特异性(％) AUC值 截断值(概率值)
区域1 84.8 88.2 0.906 17.98
区域2 83.9 91.4 0.873 18.00
区域3 83.4 85.9 0.891 17.99
区域4 85.7 90.9 0.898 18.01
由表5可以看出，各个区域诊断肝细胞癌血浆样本的AUC值范围为0.873～0.906，表明各区域对于肝细胞癌均有较好的检出效果，其中区域1的甲基化水平诊断肝细胞癌的AUC值高达0.906，诊断性能最佳。各个区域对肝细胞癌血浆样本的检测灵敏度相差不大，均在83.4％～85.7％之间，处于较高水平。各个区域对健康人血浆样本的检测特异性也处于较高水平，均大于等于85.9％，其中，区域2、区域4对于健康人血浆样本的检测特异性相对较优，检测特异性均大于90.9％。
实施例3qMSP法检测待测样本中多个区域的甲基化水平联合诊断肝细胞癌血浆样本的性能
样本收集同实施例2。血浆样本中游离DNA的提取、转化和纯化同实施例1。
在本实施例中，使用Logistic回归模型分析了来自多个区域的联合诊断的效果。当使用不同的方式进行组合时，所使用的计算方程不同，具体如表6所示。根据上述方程，ΔCt值为目标基因与内参基因ACTB的Ct值之差，计算多区域联合诊断样本的概率值P，若P值小于截断值，则表明此样本为健康人样本，若P值大于等于截断值，则表明此样本为肝细胞癌阳性样本。具体的分析方法为：首先对多个区域的ΔCt值进行二元Logistic分析，得出一个概率值，再以概率值为检验变量进行ROC分析，软件设置过程同上述单一检测区域的分析过程。
本实施例中将表3中所示4个区域中任意两个区域或三个区域或全部四个区域进行组合，并进行了联合诊断的分析，本发明选取了7种组合方式进行展示和分析，组合1～7诊断肝细胞癌血浆样本的性能如表7和图5、图6、图7、图8、图9、图10和图11所示。
表6多区域联合诊断肝细胞癌的计算方程式
表7多区域联合诊断肝细胞癌血浆样本的性能
组合 目标区域 灵敏度(％) 特异性(％) AUC值 截断值(概率值)
1 区域1+3 89.5 83.0 0.953 0.32
2 区域1+4 89.8 82.3 0.954 0.39
3 区域2+3 89.1 90.3 0.943 0.52
4 区域2+4 89.9 88.6 0.957 0.53
5 区域1+2+3 91.3 86.8 0.981 0.54
6 区域2+3+4 94.6 87.5 0.979 0.44
7 区域1+2+3+4 95.7 80.5 0.921 0.68
表7中，组合1～4为双区域组合对应的诊断肝细胞癌的结果，其中，所有双区域组合诊断肝细胞癌的AUC值均大于等于0.943，表明以上双区域组合对肝细胞癌的检出具有较好的准确度。双区域组合进行肝细胞癌血浆样本检测时，其检测灵敏度相对单区域检测有一定程度提高，双区域组合诊断肝细胞癌的检测灵敏度为89.1％～89.9％；检测健康人血浆样本的特异性的范围也在82.3％～90.3％之间，依然处于较高水平。
由表4可知，区域2检测健康人血液样本的特异性最高(特异性为91.4％)，区域4次之(特异性为90.9％)。将区域2与区域4组合进行肝细胞癌血浆样本检测，由表7可以看出，组合4(区域2+区域4)检测肝细胞癌血浆样本的灵敏度为89.9％，明显高于区域2(灵敏度为83.9％)、区域4(灵敏度为85.7％)的单区域检测，且高于其他双区域组合检测。此外，组合4检测的AUC值为0.957，在双区域组合中的效果最佳。组合4检测健康人血浆样本的特异性为88.6％，略低于区域2、区域4的单区域检测，与其他双区域组合检测相比仍处于较高水平。
意外的是，将区域2与检测特异性最低的区域3(特异性为85.9％)组合检测时，其检测肝细胞癌血浆样本的特异性为90.3％，显著高于其它双区域组合，甚至高于组合4(区域2+区域4)。由此可以看出，将单区域检测特异性最高、最低的区域进行组合检测时，其检测特异性高于两个单区域检测特异性均较高的区域的组合。
表7中，组合5～6为三区域组合对应的诊断肝细胞癌血浆样本的结果，组合7为全部四个区域组合对应的诊断肝细胞癌血浆样本的结果。三区域组合的检测灵敏度均高于双区域检测，而四区域组合的检测灵敏度较三区域组合仍有提升。其中，区域1+2+3+4组合对于肝细胞癌血浆样本的检测灵敏度达到了95.7％，在所有组合检测方式中检测肝细胞癌血浆样本的灵敏度最高，区域1+2+3+4组合检测健康人血浆样本的检测特异性有一定程度的降低，其检测特异性仍大于80％，处于较好的水平。
综合评估本实施例中组合1～7的检测效果，整体趋势是随着组合区域个数的增加，其检测肝细胞癌血浆样本的检测灵敏度逐渐提升，其中区域1+2+3+4组合检测的检测灵敏度最高、检测特异性最低。在具体应用中应综合考虑灵敏度和特异性的影响，进而选择合适的区域组合检测方式。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于肝细胞癌检测的核酸产品，其特征在于，其为用于检测样本中生物标志物的甲基化水平的核酸产品，其中，所述生物标志物选自如下至少一种区域中的全长或部分区域：区域Ⅰ、区域Ⅱ；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域Ⅰ选自Chr19:19732624-19732815，所述区域Ⅱ选自Chr1:44405339-44405527。
2.如权利要求1所述的核酸产品，其特征在于，所述生物标志物选自如SEQ ID NO.1～4所示核苷酸序列中的至少一个。
3.如权利要求2所述的核酸产品，其特征在于，所述生物标志物选自如下任一组合：
SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.1的组合；
SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3的组合；
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4的组合。
4.如权利要求1至3任一项所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括用于检测所述生物标志物的甲基化水平的引物对，可选地，还包括检测探针。
5.如权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，所述引物对选自如下引物对中的至少一组：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对。
6.如权利要求5所述的核酸产品，其特征在于，所述引物对选自如下(1)-(4)组引物对中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.9～10所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.12～13所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.15～16所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.18～19所示的第四引物对。
7.如权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，所述检测探针选自如下检测探针中的至少一种：
用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.11所示；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.14所示；用于检测SEQ IDNO.3区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.17所示；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的检测探针如SEQ ID NO.20所示。
8.一种用于肝细胞癌检测的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1至7任一项所述的核酸产品。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、阳性对照品、阴性对照品、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或多种。
10.如权利要求1至7任一项所述的核酸产品或如权利要求8或9所述的试剂盒在制备肝细胞癌诊断产品中的应用。
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