CN117535415A - 一种用于乳腺癌检测的核酸组合物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种用于乳腺癌检测的核酸组合物和试剂盒。本发明提供的乳腺癌检测试剂盒以第一核酸分子和第二核酸分子的组合作为乳腺癌生物标志物,通过检测样本中上述生物标志物的甲基化水平,对乳腺癌组织样本和血浆样本均具有优异的检测效果,对浸润性乳腺癌、非浸润性乳腺癌均具有较高的检测灵敏度,检测准确度高,不易出现假阴性结果,能够用于乳腺癌的早期诊断和筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,更具体地,涉及一种用于乳腺癌检测的核酸组合物和试剂盒。
背景技术
乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下,发生增殖失控的现象。疾病早期常表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状,晚期可因癌细胞发生远处转移,出现多器官病变,直接威胁患者的生命。随着医疗水平的提高,乳腺癌具有较高的疗效,且越早发现早治疗,其治愈率越高。但是早期乳腺癌的症状多不明显,常以乳房肿块、乳房皮肤异常、乳头溢液、乳头或乳晕异常等局部症状为主,由于表现不明显,非常容易被忽视。对健康妇女进行乳房x线检查已经成为降低乳腺癌死亡率的主要方式。此外还发展出了全场数字乳房x线摄影(FFDM),数字乳腺断层摄影术(DBT),乳房计算机断层扫描(BCT),自动乳房超声(ABUS),FFDM与ABUS的融合,DBT与ABUS的融合,磁共振成像(MRI),光学成像,无线电波成像,触觉传感器等技术。但影像学检测结果具有滞后性,而且可能对受检者造成放射性伤害。
因此,寻找新的无创、精确的乳腺肿瘤的早期诊断和筛查检测方法是当前临床上亟待解决的问题。目前现有的乳腺癌检测试剂盒检测乳腺癌的灵敏度和特异性较低,且缺乏对浸润性乳腺癌和非浸润性乳腺癌均具有优异检测效果的试剂盒。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种用于乳腺癌检测的核酸组合物和试剂盒,以改善现有技术对乳腺癌检测灵敏度和检测特异性欠佳,缺乏对浸润性乳腺癌和非浸润性乳腺癌的检测等的技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于乳腺癌检测的核酸组合物,其包括第一核酸分子和第二核酸分子的组合,所述第一核酸分子选自(a1)-(d1)中的至少一项:
(a1)SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b2)SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的互补序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(c1)(a1)或(b1)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的核酸分子;
(d1)与(a1)或(b1)或(c1)具有90%以上序列一致性的核酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a1)或(b1)或(c1)保持一致;
所述第二核酸分子选自(a2)-(d2)中的至少一项:
(a2)SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b2)SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的互补序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(c2)(a2)或(b2)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的核酸分子;
(d2)与(a2)或(b2)或(c2)具有90%以上序列一致性的核酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a2)或(b2)或(c2)保持一致。
优选地,所述第一核酸分子选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6所示的核酸分子中至少一个;所述第二核酸分子选自SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16所示的核酸分子中至少一个。
优选地,所述核酸组合物还包括所述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子,和所述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子。
优选地,所述核酸组合物还包括质粒,所述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子和所述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子重组于所述质粒上。
优选地,所述核酸组合物还包括引物对,所述引物对包括用于扩增所述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子的第一引物对,和用于扩增所述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子的第二引物对。
进一步优选地,所述第一引物对包括SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.4,和/或,SEQ IDNO.8~SEQ ID NO.9;所述第二引物对包括SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.14,和/或,SEQ IDNO.18~SEQ ID NO.19。
优选地,所述核酸组合物还包括用于标记所述第一核酸分子的第一探针和用于标记所述第二核酸分子的第二探针。
进一步优选地,所述第一探针包括SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.10;所述第二探针包括SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.20。
优选地,所述第一探针和所述第二探针的5’端均含有荧光报告基团,3’端均含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了所述核酸组合物在制备乳腺癌检测产品中的应用。
本发明还提供了一种乳腺癌检测试剂盒,其包括所述核酸组合物。
优选地,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
优选地,所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
(1)本发明提供的一种用于乳腺癌检测的核酸组合物,其中第一核酸分子和第二核酸分子的组合能够作为用于乳腺癌检测的生物标志物,采用第一引物对和第二引物对检测上述生物标志物的甲基化水平,能够有效区分乳腺癌患者和非癌受试者。
(2)本发明提供的一种乳腺癌检测试剂盒,通过检测样本中第一核酸分子和第二核酸分子的组合的甲基化水平,对乳腺癌组织样本和血浆样本均具有优异的检测效果,其检测乳腺癌血浆样本的灵敏度可达93.02%,检测非癌受试者血浆样本的特异性可达98.08%,检测准确度高,不易出现假阴性结果,能够用于乳腺癌的早期诊断和筛查。
(3)相较于现有技术,本发明提供的乳腺癌检测试剂盒对浸润性乳腺癌、非浸润性乳腺癌均具有较高的检测灵敏度,其检测浸润性乳腺癌血浆样本的灵敏度可达91.43%。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“检测”是指检测疾病的存在与否,在本发明中,“检测”乳腺癌是指判断受试者是否患有乳腺癌。
术语“生物标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,如蛋白质、DNA或RNA等,具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。乳腺癌病理类型多样,在临床应用时,高灵敏性、高特异性的生物标志物对于提高乳腺癌的检出率是十分重要的,因而需要探索能满足临床需求的、诊断性能优异的生物标志物,特别是高特异性的生物标志物。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100%,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。在本申请公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对,若Ct值满足所述要求(例如在血浆样本中Ct≤45),则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
本发明提供了一种用于乳腺癌检测的核酸组合物,其包括第一核酸分子和第二核酸分子的组合,上述第一核酸分子选自(a1)-(d1)中的至少一项:
(a1)SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b2)SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的互补序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(c1)(a1)或(b1)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的核酸分子;
(d1)与(a1)或(b1)或(c1)具有90%以上序列一致性的核酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a1)或(b1)或(c1)保持一致;
上述第二核酸分子选自(a2)-(d2)中的至少一项:
(a2)SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b2)SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的互补序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(c2)(a2)或(b2)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的核酸分子;
(d2)与(a2)或(b2)或(c2)具有90%以上序列一致性的核酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a2)或(b2)或(c2)保持一致。
发明人发现:第一核酸分子和第二核酸分子组合能够对乳腺癌样本和非癌受试者实现较好区分,通过检测样本中第一核酸分子和第二核酸分子组合的甲基化水平可以为受试者在检测或诊断乳腺癌等方面提供参考,第一核酸分子和第二核酸分子组合能够作为用于乳腺癌检测的生物标志物。
在本申请实施例中,以GRCh38.p14为参考基因组,上述SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列为Chr1:63319667-63319948正链区域;上述SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列为Chr3:5095852-5096226正链区域。
一些实施例中,上述第一核酸分子选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6所示的核酸分子中至少一个;上述第二核酸分子选自SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16所示的核酸分子中至少一个。
在本申请具体实施例中,以GRCh38.p14为参考基因组,上述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为Chr1:63319667-63319839正链区域;上述SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列为Chr1:63319745-63319948负链区域;上述SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列为Chr3:5095852-5096051正链区域;上述SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列为Chr3:5096030-5096226负链区域。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括上述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子,和上述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子。在本发明具体实施例中,上述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子选自SEQ ID NO.2和SEQID NO.7所示的核酸分子中至少一个,上述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子选自SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.17所示的核酸分子中至少一个。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂没有特别限制,可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,如肼盐、重硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括质粒,上述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子和上述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子重组于上述质粒上。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括引物对,上述引物对包括用于扩增上述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子的第一引物对,和用于扩增上述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子的第二引物对。
一些实施例中,上述第一引物对包括SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.4,和/或,SEQ IDNO.8~SEQ ID NO.9;上述第二引物对包括SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.14,和/或,SEQ IDNO.18~SEQ ID NO.19。
较佳实施例中,上述引物对选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.14的组合;
SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18~SEQ ID NO.19的组合;
SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.14的组合;
SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.18~SEQ ID NO.19的组合。
需要说明的是,若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对)所示的核苷酸序列具有至少85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)等以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的乳腺癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),则也在本发明的保护范围内。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括用于标记上述第一核酸分子的第一探针和用于标记上述第二核酸分子的第二探针。
一些实施例中,上述第一探针包括SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.10;上述第二探针包括SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.20。可以理解的是,当进行甲基化特异性荧光定量PCR时,检测探针的核苷酸序列不限于上述,还可以根据上述第一核酸分子和上述第二核酸分子进行设计。
较佳实施例中,上述第一探针和上述第二探针的5’端均含有荧光报告基团,3’端均含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了上述核酸组合物在制备乳腺癌检测产品中的应用。
本发明还提供了一种乳腺癌检测试剂盒,其包括上述核酸组合物。
一些实施例中,上述乳腺癌检测试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,内参基因的检测引物对和检测探针是针对ACTB基因设计的。在本发明具体实施例中,ACTB基因的检测引物对和检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~23所示。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参基因的检测引物对对应设计即可。
一些实施例中,上述内参基因的检测探针的5’端含有荧光报告基团,3’端含有荧光淬灭基团。一些实施例中,上述阳性对照是指其中包含甲基化的生物标志物,用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的生物标志物,用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中,上述荧光报告基团选自FAM、ROX、TAMRA、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种,上述荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时,不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,检测探针的荧光基团不限于上述,还可以是其他荧光基团。
一些实施例中,上述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中,上述乳腺癌检测试剂盒可包含一个或更多个适用于上述试剂盒中含有的组合物的容器。组合物可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。合适的容器包括,例如,瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料制成,例如玻璃或塑料。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述乳腺癌检测试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本或组织样本。
本申请对上述试剂盒检测样本中生物标志物的甲基化水平的方法没有特别的限定,所用方法可以是但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明提供了上述核酸组合物或上述乳腺癌检测试剂盒在监测患者是否罹患乳腺癌、或监测乳腺癌患者是否乳腺癌复发中的应用。在一些实施例中,可以通过以下方式在一段时间内监测上述患者:以一定间隔重复采集cfDNA样本,并分析上述cfDNA,以确定上述乳腺癌患者是否正在进展。可监测任何进展期的乳腺癌患者,包括非浸润性乳腺癌、浸润性乳腺癌或乳腺癌复发。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。
本申请实施例中,所用试剂如无特殊说明,均为市售产品。
以下为实施例:
实施例1
本实施例基于TCGA数据库及临床样本高通量甲基化测序数据,将临床样本高通量甲基化测序数据中乳腺癌患者和健康人群甲基化数据进行差异分析,筛选甲基化差异位点,对筛选到的甲基化差异位点进行临床验证,以第一核酸分子(SEQ ID NO.24或其互补链)和第二核酸分子(SEQ ID NO.25或其互补链)的组合作为生物标志物,通过亚硫酸氢盐测序法验证其在乳腺癌组织样本和非癌样本中的甲基化水平,以明确其是否可作为检测乳腺癌的生物标志物。
SEQ ID NO.24的物理位置为Chr1:63319667-63319948正链,其DNA序列为:5’-GCGGCCTCCTGCGTCAAGGCCAGCAGGAACCTTCCTGTCGCCC TCCCCGGCCGCCGCTTCGCCTCCTTCCCGCCCCCGGAGGTTGTGCAGGCGCTATGGTCCGCCTGGAGGGAGAAAGCCGGCGGCCGGTTCCTGAGCCGAGAGCGGCCGCGGAAAAATCCTCTGCCTCCGCTGGAAATCGATATTAGGCCGGCGCGGGCGCGGGACGTCGGGGCCGCAGCCAGTAGGTTGTGCACGTCTCATCATTTAGCTAATCGAGTCGAAAAGTTTCTGTAAGGGCCG-3’。
SEQ ID NO.25的物理位置为Chr3:5095852-5096226正链,其DNA序列为:5’-GCCCCAGAGCAGCGTGAAGAACCCGATGTTATCAACAGCGTTTTA TTTGGACGCTCTGAATCCGTTTTCCCCTAGCACATCGGCAGAGCAGACCGCCTGCCTCGGCCTTGTCAACGCCAAGGGTGTTTTGGACGGATGTGTCTATCCTGAAAGCTTCCAGCCTGGCTTTGAACTTGACTTGGCAACGGATGAAAACCTCGGCGAGCATCCCCAGACAACCCCGCTGCGCGTCAGAGCGCTGCTCCCGCGTCCTCCTGCCGGCAGAAGCCCCTGCAGTGCGCCCCGCGACCACCAGCTGGAACCAAAAGGCGGCGCGCAGGCGCGGAGCCCACGGGGAGCCCAGGCTGGGGCGCGTGTCAGCTCCGCCTGACCTGC-3’。
第一核酸分子包括靶区域1和靶区域2,其中,
靶区域1的物理位置为Chr1:63319667-63319839正链,其DNA序列为:
5’-GCGGCCTCCTGCGTCAAGGCCAGCAGGAACCTTCCTGTCGCCCT CCCCGGCCGCCGCTTCGCCTCCTTCCCGCCCCCGGAGGTTGTGCAGGCG CTATGGTCCGCCTGGAGGGAGAAAGCCGGCGGCCGGTTCCTGAGCCGA GAGCGGCCGCGGAAAAATCCTCTGCCTCCGCT-3’(SEQ ID NO.1)。
靶区域1完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
5’-GCGGTTTTTTGCGTTAAGGTTAGTAGGAATTTTTTTGTCGTTTTTT TCGGTCGTCGTTTCGTTTTTTTTTCGTTTTCGGAGGTTGTGTAGGCGTTAT GGTTCGTTTGGAGGGAGAAAGTCGGCGGTCGGTTTTTGAGTCGAGAGC GGTCGCGGAAAAATTTTTTGTTTTCGTT-3’(SEQ ID NO.2)。
靶区域1目的位点的甲基化特异性引物和检测探针包括:
正向引物:5’-GCGGTTTTTTGCGTTAAGGTTAGTA-3’(SEQ ID NO.3),反向引物:5’-AACGAAAACAAAAAATTTTTCCGCG-3’(SEQ ID NO.4),
检测探针:5’-TCGTTTGGAGGGAGAAAGTCGGCGG-3’(SEQ ID NO.5),5’端荧光报告基团为FAM,3’端荧光淬灭基团为BHQ1。
靶区域2的物理位置为Chr1:63319745-63319948负链,其DNA序列为:
5’-CGGCCCTTACAGAAACTTTTCGACTCGATTAGCTAAATGATGAGA CGTGCACAACCTACTGGCTGCGGCCCCGACGTCCCGCGCCCGCGCCGGCCTAATATCGATTTCCAGCGGAGGCAGAGGATTTTTCCGCGGCCGCTCTCGGCTCAGGAACCGGCCGCCGGCTTTCTCCCTCCAGGCGGACCATAGCGCCTGCACAACCTC-3’(SEQ IDNO.6)。
靶区域2完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
5’-CGGTTTTTATAGAAATTTTTCGATTCGATTAGTTAAATGATGAGAC GTGTATAATTTATTGGTTGCGGTTTCGACGTTTCGCGTTCGCGTCGGTTTAATATCGATTTTTAGCGGAGGTAGAGGATTTTTTCGCGGTCGTTTTCGGTTTAGGAATCGGTCGTCGGTTTTTTTTTTTTAGGCGGATTATAGCGTTTGTATAATTTT-3’(SEQ IDNO.7)。
靶区域2目的位点的甲基化特异性引物和检测探针包括:
正向引物:5’-CGGTTTTTATAGAAATTTTTCGATT-3’(SEQ ID NO.8),反向引物:5’-AAAATTATACAAACGCTATAATCCG-3’(SEQ ID NO.9),
检测探针:5’-TCGCGTTCGCGTCGGTTTAATATCG-3’(SEQ ID NO.10),作为一种优选,5’端荧光报告基团为ROX,3’端荧光淬灭基团为BHQ2;
第二核酸分子包括靶区域3和靶区域4,其中,
靶区域3的物理位置为Chr3:5095852-5096051正链,其DNA序列为:
5’-GCCCCAGAGCAGCGTGAAGAACCCGATGTTATCAACAGCGTTTT ATTTGGACGCTCTGAATCCGTTTTCCCCTAGCACATCGGCAGAGCAGACCGCCTGCCTCGGCCTTGTCAACGCCAAGGGTGTTTTGGACGGATGTGTCTATCCTGAAAGCTTCCAGCCTGGCTTTGAACTTGACTTGGCAACGGATGAAAACCTCG-3’(SEQ IDNO.11)。
靶区域3完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
5’-GTTTTAGAGTAGCGTGAAGAATTCGATGTTATTAATAGCGTTTTAT TTGGACGTTTTGAATTCGTTTTTTTTTAGTATATCGGTAGAGTAGATCGTTTGTTTCGGTTTTGTTAACGTTAAGGGTGTTTTGGACGGATGTGTTTATTTTGAAAGTTTTTAGTTTGGTTTTGAATTTGATTTGGTAACGGATGAAAATTTCG-3’(SEQ IDNO.12)。
靶区域3目的位点的甲基化特异性引物和检测探针包括:
正向引物:5’-CGTTGGAGTTTTCGTCGTA-3’(SEQ ID NO.13),
反向引物:5’-GAAAACCCGACCTAATACTACGAAT-3’(SEQ ID NO.14),
检测探针:5’-TCGTTATTATGAGTACGCGCGGTTCGC-3’(SEQ ID NO.15),5’端荧光报告基团为TAMRA,3’端荧光淬灭基团为BHQ2;
靶区域4的物理位置为Chr3:5096030-5096226负链,其DNA序列为:
5’-GCAGGTCAGGCGGAGCTGACACGCGCCCCAGCCTGGGCTCCCC GTGGGCTCCGCGCCTGCGCGCCGCCTTTTGGTTCCAGCTGGTGGTCGCGGGGCGCACTGCAGGGGCTTCTGCCGGCAGGAGGACGCGGGAGCAGCGCTCTGACGCGCAGCGGGGTTGTCTGGGGATGCTCGCCGAGGTTTTCATCCGTTGCCAA-3’(SEQ ID NO.16)。
靶区域4完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
5’-GTAGGTTAGGCGGAGTTGATACGCGTTTTAGTTTGGGTTTTTCGT GGGTTTCGCGTTTGCGCGTCGTTTTTTGGTTTTAGTTGGTGGTCGCGGGGCGTATTGTAGGGGTTTTTGTCGGTAGGAGGACGCGGGAGTAGCGTTTTGACGCGTAGCGGGGTTGTTTGGGGATGTTCGTCGAGGTTTTTATTCGTTGTTAA-3’(SEQ ID NO.17)。
靶区域4目的位点的甲基化特异性引物和检测探针包括:
正向引物:5’-TATTTCGGATTTTTGATTTGCG-3’(SEQ ID NO.18),
反向引物:5’-TAAAAAAAAAAAACGATAACGACGA-3’(SEQ ID NO.19),
检测探针:5’-ACGTATTCGGTCGTAAGTTTCGCGTT-3’(SEQ ID NO.20),5’端荧光报告基团为VIC,3’端荧光淬灭基团为BHQ1;
内参基因ACTB的检测引物对和检测探针包括:
正向引物:5’-GTGATGGAGGAGTTTAGTAAGTT-3’(SEQ ID NO.21),
反向引物:5’-GCACTCTTCCGAAACGAAACG-3’(SEQ ID NO.22),
检测探针:5’-ACCACCACCCAAACACAATAACAAACACA-3’(SEQ ID NO.23),5’端荧光报告基团为CY5,3’端荧光淬灭基团为BHQ2。
实施例2
1)样本收集
共收集了74例经病理检测确诊为乳腺癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本74例,其中包括浸润性乳腺癌62例(浸润性导管癌52例,浸润性小叶癌10例),非浸润性乳腺癌12例(导管原位癌)。所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2)DNA样本的提取、纯化和转化
使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)从乳腺癌和癌旁乳腺组织中提取DNA。在DNA提取之前,通过组织病理学评估确认了乳腺癌组织样品中存在肿瘤细胞,非乳腺癌组织样本(癌旁样本)中未发现肿瘤细胞。DNA用Nanodrop 2000超微量分光光度计(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)定量。将基因组DNA进行亚硫酸氢钠化学修饰,将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶同时保持甲基化胞嘧啶不变。采用ZYMO公司提供的EZ DNA Methylation-Gold Kit进行DNA转化及纯化,具体操作参考试剂盒说明书完成。
3)qPCR扩增
按表1、表2所示的反应体系和反应程序进行PCR扩增。
表1qMSP反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum IIPCR缓冲液 | 5× | 5 |
dNTPs | 各2.5mM | 3 |
每一靶区域的正向引物 | 10μM | 各0.5 |
每一靶区域的反向引物 | 10μM | 各0.5 |
每一靶区域的检测探针 | 10μM | 各0.5 |
ACTB正向引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB反向引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB检测探针 | 10μM | 0.5 |
PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase | / | 0.5 |
待测样本DNA | / | 5 |
纯化水 | / | 补至25 |
表2 qMSP反应程序
4)质量控制
阴性对照管:按照表1的配方配置PCR反应体系,模板为TE缓冲液。
阳性对照管:按照表1的配方配置PCR反应体系。阳性对照模板的制备方法包括:将ACTB基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成,并克隆至载体上,形成人工合成质粒。将完全甲基化的靶区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成,并分别克隆至载体,形成人工合成质粒。将浓度为103copies/μL的ACTB的合成质粒和每一浓度为103copies/μL的靶区域的合成质粒以等体积混合。
阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照各基因的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因ACTB的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
5)qMSP检测及结果分析
根据各个靶区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本,若扩增某一靶区域的Ct值≤38,则该样本中此靶区域为甲基化阳性,若扩增某一靶区域的Ct值>38,则该样本中此靶区域为甲基化阴性。在靶区域联合检测时,若待测样本中靶区域组合中任意一个靶区域为甲基化阳性,则该样本为乳腺癌阳性样本,仅当待测样本中靶区域组合中的两个靶区域都为甲基化阴性,该样本为乳腺癌阴性样本。具体检测结果见表3、表4、表5。
表3靶区域联合检测乳腺癌组织样本的性能
表4靶区域联合检测癌旁正常组织样本的性能
表5靶区域联合检测浸润性乳腺癌和非浸润性乳腺癌组织样本的性能
由表3、表4可知,靶区域联合检测乳腺癌组织样本时,其阳性检出率(灵敏度)为89.19%~95.94%,阴性检出率(特异性)为85.14%~89.19%。在所有靶区域联合检测中,靶区域2联合靶区域3检测乳腺癌组织样本的性能最好,其阳性检出率(灵敏度)和阴性检出率(特异性)均明显优于其它靶区域联合检测的性能。靶区域1联合靶区域4检测乳腺癌组织样本的阳性检出率(灵敏度)低于其它靶区域联合检测,但其阴性检出率(特异性)可达87.84%,仅次于靶区域2联合靶区域3的阴性检出率。具体地,靶区域联合检测浸润性乳腺癌组织样本的灵敏度范围为88.71%~95.16%,靶区域联合检测非浸润性乳腺癌组织样本的灵敏度范围为75%~100%(见表5)。
实施例3
1)样本收集
收集43例经组织活检确诊为乳腺癌的患者的血浆,其中包括浸润性乳腺癌35例(浸润性导管癌25例,浸润性小叶癌10例),非浸润性乳腺癌8例(导管原位癌);收集非癌受试者的血浆样本52例作为对照,其中包括纤维瘤患者5例,乳腺增生患者15例,乳腺囊肿患者7例,健康人25例。每份血浆样本的体积大于8mL。所有血浆样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
使用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)从血浆中提取cfDNA。DNA用Qubit 2.0fluorimeter(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)定量。
2)DNA转化及纯化、qPCR扩增、质量控制同实施例2。
3)qMSP检测及结果分析
根据各个靶区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于血浆样本,若扩增某一靶区域的Ct值≤45,则该样本中此靶区域为甲基化阳性,若扩增某一靶区域的Ct值>45,则该样本中此靶区域为甲基化阴性。在靶区域联合检测时,若待测样本中靶区域组合中任意一个靶区域为甲基化阳性,则该样本为乳腺癌阳性样本,仅当待测样本中靶区域组合中的两个靶区域都为甲基化阴性,该样本为乳腺癌阴性样本。具体检测结果见表6、表7、表8。
表6靶区域联合检测乳腺癌患者血浆样本的性能
表7靶区域联合检测非癌受试者血浆样本的性能
表8靶区域联合检测浸润性乳腺癌和非浸润性乳腺癌血浆样本的性能
由表6、7可以看出,靶区域联合检测对乳腺癌患者血浆样本仍具有较高的阳性检出率(灵敏度),阳性检出率范围为83.72%~93.02%,靶区域联合检测非癌受试者血浆样本的阴性率(特异性)均大于等于92.31%,其中靶区域2联合靶区域3检测乳腺癌患者血浆样本的性能最好,阳性检出率(灵敏度)达93.02%,阴性率(特异性)达98.08%。有趣的是,对比表6、表7发现,同一靶区域联合检测非癌受试者血浆样本的阴性率(特异性)明显高于检测乳腺癌患者血浆样本的阳性检出率(灵敏度),这表明本发明提供的乳腺癌检测试剂盒对非癌受试者血浆样本具有优异的检测特异性,能够降低假阴性样本的检出,检测准确度高。具体地,靶区域联合检测浸润性乳腺癌血浆样本的灵敏度范围为85.71%~91.43%,检测非浸润性乳腺癌血浆样本的灵敏度范围为75%~100%(见表8)。
对比表3、表6发现,靶区域联合检测对乳腺癌组织样本和乳腺癌血浆样本均具有良好的阳性检出率(灵敏度),最高检测灵敏度分别为95.94%、93.02%。而对比表4、表7,意外发现,靶区域联合检测非癌受试者血浆样本的阴性率(特异性)明显高于靶区域联合检测癌旁正常组织样本的阴性率(特异性)。
对比例1
本实施例的样本同实施例3,采用血清标记物的检测方法对乳腺癌血浆样本中肿瘤标志物(CA125、CA153)含量进行检测,从而评估肿瘤标志物(CA125、CA153)检测乳腺癌患者血浆样本的性能,结果如表9所示。
表9肿瘤标志物CA125、CA153检测乳腺癌患者血浆样本的性能
综合表6、表7、表9可以看出,相比常规的CA125和CA153肿瘤标志物,本发明提供的试剂盒通过检测第一核酸分子和第二核酸分子组合的甲基化水平,检测乳腺癌患者血浆样本的灵敏度和检测非癌受试者血浆样本的特异性大幅提升,其中灵敏度的提升尤为显著,说明本发明的试剂盒对乳腺癌的早期筛查、监测病情变化和预后评估均具有良好的参考价值。
综上,本发明提供的试剂盒通过检测第一核酸分子和第二核酸分子组合的甲基化水平,对乳腺癌患者血浆样本、组织样本均具有良好的检测灵敏度,对非癌受试者血浆样本和癌旁正常组织样本均具有优异的检测特异性,检测准确度高。此外,本发明提供的试剂盒对浸润性乳腺癌和非浸润乳腺癌均具有较高的检测灵敏度。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于乳腺癌检测的核酸组合物,其特征在于,包括第一核酸分子和第二核酸分子的组合,所述第一核酸分子选自(a1)-(d1)中的至少一项:
(a1)SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b2)SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的互补序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(c1)(a1)或(b1)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的核酸分子;
(d1)与(a1)或(b1)或(c1)具有90%以上序列一致性的核酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a1)或(b1)或(c1)保持一致;
所述第二核酸分子选自(a2)-(d2)中的至少一项:
(a2)SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b2)SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的互补序列的全长或部分区域,其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(c2)(a2)或(b2)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的核酸分子;
(d2)与(a2)或(b2)或(c2)具有90%以上序列一致性的核酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a2)或(b2)或(c2)保持一致。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物,其特征在于,所述第一核酸分子选自SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.6所示的核酸分子中至少一个;所述第二核酸分子选自SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.16所示的核酸分子中至少一个。
3.根据权利要求1所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括所述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子,和所述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括质粒,所述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子和所述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子重组于所述质粒上。
5.根据权利要求3所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括引物对,所述引物对包括用于扩增所述第一核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子的第一引物对,和用于扩增所述第二核酸分子经甲基化转化试剂转化后的核酸分子的第二引物对;
所述第一引物对包括SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.4,和/或,SEQ ID NO.8~SEQ IDNO.9;所述第二引物对包括SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.14,和/或,SEQ ID NO.18~SEQ IDNO.19。
6.根据权利要求1所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括用于标记所述第一核酸分子的第一探针和用于标记所述第二核酸分子的第二探针;
所述第一探针包括SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.10;所述第二探针包括SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.20。
7.根据权利要求6所述的核酸组合物,其特征在于,所述第一探针和所述第二探针的5’端均含有荧光报告基团,3’端均含有荧光淬灭基团。
8.权利要求1~7任一项所述的核酸组合物在制备乳腺癌检测产品中的应用。
9.一种乳腺癌检测试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1~7任一项所述的核酸组合物。
10.根据权利要求9所述的乳腺癌检测试剂盒,其特征在于,其还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种;所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
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