CN117778582A - 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents
用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778582A CN117778582A CN202410175279.0A CN202410175279A CN117778582A CN 117778582 A CN117778582 A CN 117778582A CN 202410175279 A CN202410175279 A CN 202410175279A CN 117778582 A CN117778582 A CN 117778582A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- gastric cancer
- nucleic acid
- primer pair
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 157
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 156
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 156
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 107
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 100
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 99
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 166
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 9
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 7
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 201000011591 microinvasive gastric cancer Diseases 0.000 abstract description 10
- HEVGGTGPGPKZHF-UHFFFAOYSA-N Epilaurene Natural products CC1C(=C)CCC1(C)C1=CC=C(C)C=C1 HEVGGTGPGPKZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 91
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 description 40
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 37
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 33
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 26
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 10
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 8
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 5
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 4
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanimidamide Chemical compound NC(=N)CC1=CC=CC=C1 JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007279 Carcinoid tumour of the gastrointestinal tract Diseases 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- -1 MGB Chemical compound 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- JXRVKYBCWUJJBP-UHFFFAOYSA-L calcium;hydrogen sulfate Chemical compound [Ca+2].OS([O-])(=O)=O.OS([O-])(=O)=O JXRVKYBCWUJJBP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- MEAHOQPOZNHISZ-UHFFFAOYSA-M cesium;hydrogen sulfate Chemical compound [Cs+].OS([O-])(=O)=O MEAHOQPOZNHISZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000024334 diffuse gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- APGUSRKQFBWUPZ-UHFFFAOYSA-K disulfooxyalumanyl hydrogen sulfate Chemical compound [Al+3].OS([O-])(=O)=O.OS([O-])(=O)=O.OS([O-])(=O)=O APGUSRKQFBWUPZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001861 endoscopic biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请属于分子生物学检测领域,更具体地,涉及用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用。本申请提供的用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒,通过检测样本中Chr11:123430435‑123430582和/或Chr11:123430914‑123431068的甲基化水平,诊断胃癌血浆样本的性能较优异,能够有效区分胃癌患者和健康受试者,且对早期胃癌和不同Lauren分型的胃癌样本均具有优异的检测效果,适用于胃癌的早期筛查和诊断。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学检测领域,更具体地,涉及用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
随着社会经济高速发展和人口老龄化的加剧,癌症已成为严重威胁人类生命健康的主要原因之一。胃癌是一种原发于胃,且具有高度侵袭性的上皮性恶性肿瘤。在世界范围内,每年约有120万人被诊断患有胃癌,约有86万人因胃癌而死亡。尽管手术、放化疗、分子靶向和免疫治疗的等治疗方案的进步改善了胃癌患者的存活率和预后,但是由于胃癌尤其是早期胃癌,通常无明显的体征,直至疾病发展至中晚期,患者才出现不适,致使胃癌的诊断往往是被延误的。早诊早治对于改善胃癌患者的生存率和预后至关重要。
内镜及内镜下活检是目前诊断胃癌的金标准。但是内镜检查属于侵入性检查,患者的依从性较低,依赖内镜诊断早癌对医师的技能和经验要求很高,且内镜资源紧张,尚无法满足大量需要进行筛查和早期诊断患者的需求。因此,非侵入性的、有效的分子标志物用于胃癌的早期诊断迫在眉睫。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,也是最早发现的DNA修饰之一,其参与细胞增殖、分化、发育、凋亡、疾病发生等重要的生命活动。DNA甲基化可以引起染色质结构和DNA稳定性的变化,从而调节基因表达。位于基因启动子区域的DNA的异常甲基化会导致抑癌基因沉默,这种甲基化水平的改变通常发生在癌症的早期,并伴随癌症的进展稳定存在。因此,发生异常甲基化的DNA区域可作为早期胃癌诊断的肿瘤标志物。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本申请的目的在于提供用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用,旨在解决传统技术对于胃癌的诊断手段不足,检测胃癌的灵敏度和特异性欠佳,缺乏对不同病理分期和不同分型的胃癌的检测等的技术问题。
为实现上述目的,本申请提供了用于检测胃癌的核酸组合,以GRCh38.p14为参考基因组,所述核酸组合用于检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平。
优选地,所述核酸组合包括用于检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平的引物对。
进一步优选地,所述用于检测Chr11:123430435-123430582的甲基化水平的引物对选自如下引物对中的至少一组:
SEQ ID NO.5~6所示的第一引物对;SEQ ID NO.8~9所示的第二引物对;SEQ IDNO.11~12所示的第三引物对;SEQ ID NO.14~15所示的第四引物对。
进一步优选地,所述用于检测Chr11:23430914-123431068的甲基化水平的引物对选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.29~30所示的第九引物对;SEQ ID NO.32~33所示的第十引物对;SEQID NO.35~36所示的第十一引物对;SEQ ID NO.38~39所示的第十二引物对。
优选地,所述核酸组合还包括检测探针。
进一步优选地,所述核酸组合选自如下(1)-(8)组核酸组合中的至少一组:
(1)SEQ ID NO.5~6所示的第一引物对和SEQ ID NO.7所示的第一探针;
(2)SEQ ID NO.8~9所示的第二引物对和SEQ ID NO.10所示的第二探针;
(3)SEQ ID NO.11~12所示的第三引物对和SEQ ID NO.13所示的第三探针;
(4)SEQ ID NO.14~15所示的第四引物对和SEQ ID NO.16所示的第四探针;
(5)SEQ ID NO.29~30所示的第九引物对和SEQ ID NO.31所示的第九探针;
(6)SEQ ID NO.32~33所示的第十引物对和SEQ ID NO.34所示的第十探针;
(7)SEQ ID NO.35~36所示的第十一引物对和SEQ ID NO.37所示的第十一探针;
(8)SEQ ID NO.38~39所示的第十二引物对和SEQ ID NO.40所示的第十二探针。
优选地,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,所述检测探针的3'端包含有荧光淬灭基团。
本申请还提供了用于检测胃癌的试剂盒,所述试剂盒包括所述核酸组合。
优选地,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
本申请还提供了所述核酸组合或所述试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
优选地,所述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌;和/或,所述胃癌选自Lauren分型中肠型、弥漫型或混合型的胃癌。
优选地,所述胃癌诊断产品包括体外血液甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
总体而言,通过本申请所构思的以上技术方案与传统技术相比,主要具备以下的技术优点:
1.本申请提供的用于检测胃癌的核酸组合,通过检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平,诊断胃癌血浆样本的性能较优异,能够有效区分胃癌患者和健康受试者,且对早期胃癌和不同Lauren分型的胃癌样本均具有优异的检测效果,适用于胃癌的早期筛查和诊断。
2.优选实施例中,采用本申请提供的用于检测胃癌的试剂盒联合检测Chr11:123430435-123430582和Chr11:123430914-123431068的甲基化水平,诊断胃癌血浆样本的灵敏度可达87.68%,特异性达95.59%。具体地,上述试剂盒诊断早期胃癌(Ⅰ&Ⅱ期)血浆样本的灵敏度为78.95%,检测进展期胃癌(Ⅲ&Ⅳ期)的灵敏度为94.44%;检测肠型、弥漫型和未分型胃癌血浆样本的灵敏度分别为84.85%、88.10%和85.45%。
3.本申请提供了非侵入性的、能够用于胃癌的早期诊断的分子标志物,有利于胃癌的早期检出,提高患者的生存率。
附图说明
图1是本申请实施例提供的核酸组合1~4检测区域A的甲基化水平进而诊断胃癌的ROC曲线,其中内容A为核酸组合1、内容B为核酸组合2、内容C为核酸组合3、内容D为核酸组合4;
图2是本申请实施例提供的核酸组合9~12检测区域B的甲基化水平进而诊断胃癌的ROC曲线,其中内容A为核酸组合9、内容B为核酸组合10、内容C为核酸组合11、内容D为核酸组合12;
图3是本申请实施例提供的核酸组合3和核酸组合12联合检测区域A和区域B的甲基化水平从而诊断胃癌血浆样本的性能;
图4是本申请实施例提供的核酸组合3和核酸组合12联合检测区域A和区域B的甲基化水平从而诊断胃癌血浆样本的性能验证。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
在本申请的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”胃癌是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有胃癌。
术语“胃癌”以最广泛的含义使用,并且是指在胃中开始的所有癌症。其包括在胃中开始的以下亚型:腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤和鳞状细胞癌、小细胞癌和平滑肌肉瘤。其还包括以下阶段(根据TNM分类所限定):0期、IA期、IB期、IIA期、IIB期、IIIA期、IIIB期、IIIC期和IV期。或其还包括以下类型(根据Lauren分型所限定):肠型、弥漫型和混合型。
术语“样本”是指可能包含需要进行分析的目标区域的任何物质,包括生物样本。在本申请中,“样本”或“生物样本”可以是直接从生物来源获得的样本或者是被处理的样本。样本或生物样本包括,但不限于,体液(例如全血、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样本、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样本,以及由此衍生出的加工样本。
术语“受试者”可以是哺乳动物或哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本申请中,哺乳动物是指任何种类的哺乳动物,优选人(包括人、人受试者或人患者)。
术语“分子标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,如蛋白质、DNA或RNA等,具有非常广泛的用途。分子标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的分子标志物可大大提高患者的临床治疗效果。低甲基化分子标志物容易在检测中由于检测方法不当或者操作失误而检不出甲基化胞嘧啶,极易造成假阳性结果。在临床应用时,筛选高甲基化、高灵敏度、高特异性的分子标志物对于提高胃癌的检出率是十分重要的。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”是指一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本申请公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指正向引物和反向引物组成的组。
术语“甲基化转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐或其组合的试剂,经过甲基化转化试剂处理的DNA,其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变,可以区分例如CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
术语“检测探针”是指包含5'荧光报告基团和3'淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。当检测探针所携带的荧光基团不同时,qPCR反应体系可满足同时检测多个目标基因的需求。
术语“硫化测序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)”是通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留;然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增,将扩增得到的PCR产物进行克隆测序,将测得的序列与原始序列比对,统计甲基化位点及数量,并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经甲基化转化试剂处理后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可区分甲基化与非甲基化的DNA序列。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经甲基化转化试剂转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。在本申请公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地,是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断检测的不同可能切点的真阳性率相比于假阳性率的图。它展示了灵敏度和特异度之间的协调,具体取决于所选的切割点(灵敏度的任何升高都将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好;最佳值是1;随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线,面积为0.5)。
本申请提供了用于检测胃癌的核酸组合,以GRCh38.p14为参考基因组,所述核酸组合用于检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平。
本领域技术人员理解,上述Chr11:123430435-123430582区域、Chr11:123430914-123431068区域的全长序列的至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的连续片段,同样适用于检测胃癌。在一些实施方案中,上述连续片段包含原始区域中部分或全部的(差异)甲基化位点。在一些实施方案中,一个区域与另一个区域的连续片段也可以组合使用,以构成上述用于检测胃癌的实施方案。
本申请对于胃癌的类型、分期没有限制。在本申请的一些具体实施例中,上述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌。在另一具体实施例中,上述胃癌可以是Lauren分型中肠型、弥漫型或混合型的胃癌。
一些实施例中,上述胃癌为来自受试者的胃癌,上述受试者是哺乳动物。较佳实施例中,上述哺乳动物是人。
一些实施例中,上述样本选自组织(例如组织切片)、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在申请的一些优选实施例中,上述样本为组织、全血、血浆或血清。在申请的一些更优选实施例中,上述样本为全血、血浆或血清。由于采样的便捷性等方面,本申请提供的检测胃癌的核酸组合可以是用于胃癌早期筛查、检测或辅助检测的核酸组合。
一些实施例中,上述核酸组合包括用于检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平的引物对。
一些实施例中,上述用于检测Chr11:123430435-123430582的甲基化水平的引物对选自如下引物对中的至少一组:
SEQ ID NO.5~6所示的第一引物对;SEQ ID NO.8~9所示的第二引物对;SEQ IDNO.11~12所示的第三引物对;SEQ ID NO.14~15所示的第四引物对。
一些实施例中,上述用于检测Chr11:123430914-123431068的甲基化水平的引物对选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.29~30所示的第九引物对;SEQ ID NO.32~33所示的第十引物对;SEQID NO.35~36所示的第十一引物对;SEQ ID NO.38~39所示的第十二引物对。
需要说明的是,若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第九引物对、第十引物对、第十一引物对、第十二引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)等以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的胃癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本申请的保护范围内。
一些实施例中,上述核酸组合还包括检测探针。
较佳实施例中,上述核酸组合选自如下(1)-(8)组核酸组合中的至少一组:
(1)SEQ ID NO.5~6所示的第一引物对和SEQ ID NO.7所示的第一探针;
(2)SEQ ID NO.8~9所示的第二引物对和SEQ ID NO.10所示的第二探针;
(3)SEQ ID NO.11~12所示的第三引物对和SEQ ID NO.13所示的第三探针;
(4)SEQ ID NO.14~15所示的第四引物对和SEQ ID NO.16所示的第四探针;
(5)SEQ ID NO.29~30所示的第九引物对和SEQ ID NO.31所示的第九探针;
(6)SEQ ID NO.32~33所示的第十引物对和SEQ ID NO.34所示的第十探针;
(7)SEQ ID NO.35~36所示的第十一引物对和SEQ ID NO.37所示的第十一探针;
(8)SEQ ID NO.38~39所示的第十二引物对和SEQ ID NO.40所示的第十二探针。
更佳实施例中,上述核酸组合选自上述第三引物对和第三探针与上述第十二引物对和第十二探针的组合。
本申请的一些方面,提供了上述核酸组合在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的用途。
基于此,本申请还提供了用于检测胃癌的试剂盒,上述试剂盒包括上述核酸组合。
一些实施例中,上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述内参基因可以为但不限于ACTB。在本申请的一些具体实施例中,内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.53~54所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.55。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参引物对对应设计即可。
一些实施例中,上述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,所述检测探针的3'端包含有荧光淬灭基团。上述荧光报告基团独立地选自FAM、ROX、VIC、HEX、NED、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种;上述荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。需要注意的是,各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于前述所列举。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本申请对甲基化转化试剂无特别限制,现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,例如但不限于肼盐、重亚硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)。
一些实施例中,上述核酸提取试剂包括但不限于裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。一些实施例中,上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中,上述阳性对照品是指其中包含甲基化的目标区域,用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性参考品是指其中不包含甲基化的目标区域,用于监测实验是否受到污染。
本领域技术人员已知可以用于检测样本中基因组DNA或游离DNA甲基化水平的方法,例如但不限于聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术和基因测序技术中的一种或多种。
在一些具体的实施例中,上述聚合酶链式反应技术包括但不限于RT-PCR、免疫PCR、巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落PCR、梯度PCR、多重PCR等;上述基因测序技术包括但不限于扩增子测序技术,例如扩增子简化基因组甲基化测序,全基因组甲基化测序(Whole Genome BisulfiteSequencing,WGBS),DNA富集测序,焦磷酸盐测序,亚硫酸盐转化测序;上述质谱分析技术包括但不限于基于质谱的MALDI-TOFMS、GC-MS、LC-MS、FT-MS、ICP-MS、SIMS的检测技术;上述原位杂交技术包括但不限于基于芯片检测平台,如450K和850K甲基化检测技术。
在一些更具体的实施例中,用于检测样本中基因组DNA或游离DNA甲基化水平的方法包括但不限于荧光定量PCR(qPCR)、甲基化特异性PCR(MSP)、数字PCR(ddPCR)、DNA甲基化芯片、扩增子测序、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
在本申请的一些方面,提供了上述核酸组合或试剂盒在制备用于胃癌诊断产品中的用途。
本申请对于胃癌的类型、分期没有限制。一些实施例中,上述胃癌选自I期胃癌、II期胃癌、III期胃癌或IV期胃癌;和/或,上述胃癌选自Lauren分型中肠型、弥漫型、混合型或未分型的胃癌。
一些实施例中,上述胃癌诊断产品包括但不限于体外血液甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中。
基于此,本申请还提供了一种诊断胃癌的方法,包括如下步骤:获得受试者的待测样本,提取所述待测样本的基因组DNA和/或游离DNA,然后检测DNA中上述的目标区域的甲基化水平,进而判别受试者是否存在胃癌。
在本申请的一些具体的实施例中,上述待测样本选自组织、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在本申请的一些优选实施例中,上述待测样本为组织、全血、血浆或血清。在本申请的一些更优选实施例中,上述待测样本为全血、血浆或血清。
在本申请的其他方面,还提供了上述核酸组合或试剂盒在制备预测胃癌、检测胃癌、胃癌分类、胃癌治疗监测、胃癌预后或其它评价胃癌的相关指标的诊断产品中的应用。
基于此,本申请还提供了一种诊断胃癌、胃癌早期筛查、检测或辅助检测的方法,包括以下步骤:获得受试者的待测样本,其中待测样本为全血、血清或血浆样本;然后提取待测样本的游离DNA,并进行亚硫酸氢盐转化;随后对经亚硫酸氢盐转化的游离DNA进行多重PCR反应;基于检测结果判断受试者是否存在胃癌。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本申请,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请。下述实施例与测试例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例与测试例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下为实施例:
实施例1甲基化检测方法的建立
以GRCh38.p14为参考基因组,区域A(Chr11:123430435-123430582)DNA序列为:
AAGGCAAAGACGCCAGCAAGCGAGGAAGCGCAGCGGAAGAAAAACAAGCG GGCGCGCGAGGGGAGCCCCAGGAGGGCTGCCGAGTGGCTGGCAGGCGGCTCCCG CCCCTCCCGGGTGGCCTCGCCGGCGGCTGACGGCCCGGAGGACG(SEQ ID NO.1)。
以GRCh38.p14为参考基因组,区域B(Chr11:123430914-123431068)DNA序列为:
GGCGCTTCAAGATGCGCCGCATGAAGAACGTACAGGAGCAGAGCCTGGAGG CCGGGCTGGCCCGGGACCTGCCCGCCGTCTTGGCCCCCGGCAAGGAGTTCCTGCA GCTGCCGTCCATCGAGATCACGCCCTCCAGCGACGAGGACACCCCGTGG(SEQ ID NO.2)。
为了能够区分甲基化的DNA和未甲基化的DNA,本申请使用重亚硫酸氢盐修饰原始的DNA。在重亚硫酸氢盐的作用下,未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,在随后的PCR扩增中,尿嘧啶碱基最终被胸腺嘧啶碱基所替代。通过比较重亚硫酸氢盐处理前后CpG二核苷酸位点为CG还是TG来判断胞嘧啶是否为甲基化的胞嘧啶。
区域A经重亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
AAGGTAAAGACGTTAGTAAGCGAGGAAGCGTAGCGGAAGAAAAATAAGCGG GCGCGCGAGGGGAGTTTTAGGAGGGTTGTCGAGTGGTTGGTAGGCGGTTTTCGTT TTTTTCGGGTGGTTTCGTCGGCGGTTGACGGTTCGGAGGACG(SEQ ID NO.3)。
区域B经重亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
GGCGTTTTAAGATGCGTCGTATGAAGAACGTATAGGAGTAGAGTTTGGAGGTC GGGTTGGTTCGGGATTTGTTCGTCGTTTTGGTTTTCGGTAAGGAGTTTTTGTAGTTG TCGTTTATCGAGATTACGTTTTTTAGCGACGAGGATATTTCGTGG(SEQ ID NO.4)。
将SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.4的DNA序列人工合成,并分别构建至pMD-18T质粒载体上。使用甲基化引物设计软件分别设计SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4特异性的甲基化检测引物对,并人工合成所设计的引物对,随后使用甲基化特异性荧光定量PCR反应(SYBRGreen法)验证甲基化检测引物对是否可用,要求甲基化检测引物对的扩增效率在90%~110%之间,且仅仅扩增甲基化的质粒模板,不扩增非甲基化的质粒模板。引物筛选时所用的qMSP反应体系、扩增程序如表1、表2所示。
表1qMSP反应体系(SYBR Green法)
表2 qMSP扩增程序(SYBR Green法)
经过多轮筛选获得满足要求的可扩增区域A、区域B的甲基化检测引物各8对,如表3所示。为了提高甲基化特异性qPCR检测临床样本的灵敏度和特异性,在实际应用时,发明人使用qPCR(探针法)检测临床样本。本申请中每对甲基化检测引物对相对应的检测探针的核苷酸序列见表3。在实际应用时,对于每个样本均需检测内参基因的量以评估样本质量是否合格,因此,发明人构建了含转化后ACTB基因序列的质粒,并设计了ACTB特异性的甲基化检测引物对和检测探针(表3)。对于区域A,检测探针5'端的荧光报告基团为FAM,3'端的荧光淬灭基团为MGB;对于区域B,检测探针5'端的荧光报告基团为ROX,3'端的荧光淬灭基团也为MGB;对于ACTB基因,检测探针5'端的报告基团为VIC,3'端猝灭基团为BHQ1。
表3区域A、区域B和ACTB的甲基化检测引物对和检测探针的核苷酸序列
将上述甲基化检测引物对和检测探针人工合成后,使用qPCR(探针法)分别扩增含甲基化模板的质粒和含非甲基化模板的质粒,扩增体系、扩增程序如表4、表5所示。
表4 qPCR(探针法)反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum IIPCR缓冲液(Thermo Scientific) | 5× | 5 |
dNTPs | 各2.5mM | 3 |
区域A或B上游引物 | 10μM | 0.5 |
区域A或B下游引物 | 10μM | 0.5 |
区域A或B检测探针 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因上游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因下游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因检测探针 | 10μM | 0.5 |
DNA聚合酶 | / | 0.5 |
区域A(或B)和ACTB的质粒 | 每种103copies/μL | 1 |
纯化水 | / | 补至25 |
表5 qPCR(探针法)扩增程序
分析甲基化检测引物对与检测探针连用的扩增效果,发现核酸组合1、2、3、4、9、10、11、12扩增效率高,且无非特异性扩增,即不扩增非甲基化的质粒模板,因此,这些核酸组合可用于临床样本的检测。
实施例2区域A、区域B区分胃癌组织样本和癌旁正常组织样本的性能
使用qPCR(探针法),基于核酸组合1、2、3、4、9、10、11、12分别分析胃癌组织样本和癌旁正常样本中区域A、区域B的甲基化水平及其诊断组织样本的性能。
1.样本收集
收集78例经病理检测确诊为胃癌患者的癌组织样本,其中按照病理分期包括Ⅰ期&Ⅱ期26例,Ⅲ期&Ⅳ期52例,同时采集配对的78例癌旁组织样本,所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.组织样本DNA提取、转化和纯化
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化及DNA纯化回收,样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作步骤见试剂盒说明书。
3.qPCR(探针法)检测
将经亚硫酸氢盐转化并纯化的模板DNA进行MSP反应,以检测各个待测样本中区域A、区域B的甲基化状态,即分别使用核酸组合1、2、3、4扩增各个待测样本中的区域A,分别使用核酸组合9、10、11、12扩增各个待测样本中的区域B。进行PCR反应的过程中,在一个PCR管中,首先需加入反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、模板等必须的成分;然后加入区域A或区域B的甲基化检测引物对和检测探针,此外,还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增,PCR反应液配置体系如表4,其中模板为从待测样本中经提取、转化和纯化的DNA,模板加入的体积为5μL,按照表5提供的扩增程序进行PCR扩增。
在检测待测样本时,阴性对照和阳性对照应同步进行检测。阴性对照孔的模板为TE缓冲液。阳性对照孔的模板DNA为103拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒和103拷贝/微升的含转化后区域A或区域B的质粒1:1等体积混合而成。
4.qPCR结果分析及区域A、区域B诊断胃癌组织样本的性能分析
1)Ct值读取:PCR完成后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1~2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个基因的Ct值。
2)质量控制:阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
3)结果分析和判读方法:对于组织样本,若待测样本在某一检测区域的Ct值≤38时,即认为该样本在此区域为甲基化阳性,该样本为胃癌阳性样本;若待测样本在某一检测区域的Ct值>38,则认为该样本在此区域为甲基化阴性,该样本为胃癌阴性样本。
核酸组合1~4、9~12通过检测各待测组织样本中区域A、区域B的甲基化水平,进而诊断胃癌和癌旁组织样本的性能如表6所示。
表6区域A、区域B诊断胃癌组织样本和癌旁组织样本的性能
从表6可以看出,1)区域A、区域B在胃癌组织样本中甲基化阳性样本比例较高,而在癌旁组织样本中甲基化阴性样本比例较高;2)基于表6中所示的核酸组合,使用qPCR(探针法)检测区域A、区域B可有效区分胃癌组织样本和癌旁组织样本。区域A、区域B检测胃癌组织样本的灵敏度均高于91%,对早期胃癌(Ⅰ&Ⅱ期)的检出率均高于80%,对进展期胃癌(Ⅲ&Ⅳ期)的检出率高于96%,一些核酸组合(如核酸组合1、4、9、11、12)对进展期胃癌组织样本的检出率可达到100%。区域A、区域B检测癌旁组织的特异性范围为75.64%~85.9%,分析原因可能是在癌旁组织中,一些在组织化学上呈现出正常形态的细胞,其在分子水平上可能已经发生甲基化的改变,因此,区域A、区域B诊断癌旁组织样本的特异性略低。
实施例3区域A、区域B区分胃癌血浆样本和非癌血浆样本的性能
为了满足非侵入性诊断的需求,本实施例使用qPCR(探针法),基于核酸组合1、2、3、4、9、10、11、12分别分析区域A和/或区域B的甲基化水平区分胃癌患者和非癌患者血浆样本的性能。
1.血液样本收集
于武汉某医院收集经病理组织活检确诊为胃癌患者的血液样本138例,其中,按照病理分期包括胃癌早期(Ⅰ&Ⅱ期)48例和进展期(Ⅲ&Ⅳ期)90例;按照Lauren分型包括肠型胃癌33例、弥漫型胃癌42例、混合型8例和未分型55例。同时收集胃镜检查结果显示上消化道无疾病的健康受试者血液样本125例。收集的每份血液样本的体积不低于10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.血浆样本DNA提取、转化和纯化
收集抗凝血后离心(3000rpm,10min)分离血浆层。随后使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化及DNA纯化回收,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书。
3.qPCR(探针法)检测
使用qPCR(探针法)法检测血浆样本中区域A、区域B的甲基化水平,具体的检测方法同实施例2。
4.qPCR结果分析及区域A、区域B诊断胃癌血浆样本的性能分析
1)Ct值读取和质量控制同实施例2。
2)结果分析和判读方法:对于血浆样本,若待测样本在某一检测区域的Ct值≤48时,即认为该样本在此区域为甲基化阳性,若待测样本在某一检测区域的Ct值>48,则认为该样本在此区域为甲基化阴性。基于表3提供的核酸组合,利用甲基化特异性荧光定量PCR法检测各待测血浆样本中区域A、区域B的甲基化水平,并通过其甲基化水平分析该方法诊断胃癌和非癌患者血浆样本的性能。以48为阳性判断值,待测样本为甲基化阳性记为1,待测样本为甲基化阴性记为0;同时以临床参考标准的结果进行分组,即经胃镜和/或病理诊断为胃癌者记为1,经胃镜诊断为健康者记为0,绘制ROC曲线以评估使用不同的核酸组合扩增区域A、区域B从而诊断胃癌和非癌患者血浆样本的性能,结果如图1内容A、图1内容B、图1内容C、图1内容D、图2内容A、图21内容B、图2内容C、图2内容D和表7所示。
表7区域A、区域B诊断胃癌患者和健康受试者血浆样本的整体性能
由表7可以看出,通过检测血浆样本中区域A、区域B的甲基化水平诊断胃癌的效果是较好的。使用核酸组合1~4检测区域A的甲基化水平诊断胃癌患者血浆样本的灵敏度范围为70.3%~80.4%,特异性均大于等于93.6%,AUC值均大于0.84,其中核酸组合3的综合诊断性能最佳,其检测灵敏度可达80.4%,特异性可达93.6%。使用核酸组合9~12检测区域B的甲基化水平诊断胃癌患者血浆样本的灵敏度范围为71.0%~79.0%,特异性范围为94.4%~98.4%,AUC值的范围为0.847~0.875,其中核酸组合12的综合诊断性能最佳,其检测灵敏度为79.0%,特异性为96.0%。
根据胃癌患者的病理信息,进一步分析了区域A、区域B诊断不同病理分期和不同Lauren分型的胃癌患者血浆样本的性能,结果如表8所示。
表8区域A、区域B诊断不同分期和不同Lauren分型的胃癌患者血浆样本的灵敏度
由表8可以看出,区域A、区域B对不同病理分期以及不同Lauren分型的胃癌患者的血浆样本均有一定的检出率。使用核酸组合1~4检测区域A的甲基化水平诊断早期胃癌(Ⅰ&Ⅱ期)患者血浆样本的灵敏度范围为47.92%~58.33%,其检测进展期胃癌(Ⅲ&Ⅳ期)患者血浆样本的灵敏度范围为82.22%~92.22%,其检测肠型、弥漫型和未分型胃癌患者血浆样本的灵敏度范围分别为:57.58%~72.73%、71.43%~78.57%和72.73%~83.64%;核酸组合3的检测灵敏度略高于另外3组。使用核酸组合9~12检测区域B的甲基化水平诊断早期胃癌(Ⅰ&Ⅱ期)患者血浆样本的灵敏度范围为45.83%~54.17%,其检测进展期胃癌(Ⅲ&Ⅳ期)患者血浆样本的灵敏度范围为82.22%~92.22%,其检测肠型、弥漫型和未分型胃癌患者血浆样本的灵敏度范围分别为:60.61%~81.82%、61.9%~71.43%和70.91%~81.82%;核酸组合12的检测灵敏度高于其它3组。另外,区域A对弥漫型胃癌的检出率高于区域B,而区域B对肠型胃癌的检出率高于区域A。
实施例4区域A和区域B联合诊断胃癌血浆样本的性能
由实施例2、3可以看出,与组织样本相比,区域A、区域B诊断血浆样本的灵敏度有所下降,这与血浆样本中ctDNA丰度极低有关。为了进一步提高甲基化分子标志物诊断胃癌血浆样本的性能,发明人考虑以区域A和区域B作为分子标志物,分析二者联合诊断胃癌血浆样本的性能。对于区域A,核酸组合3的诊断效果最佳,对于区域B,核酸组合12的诊断效果最佳,因此,使用核酸组合3和12联合检测区域A和区域B的甲基化水平。基于实施例3中已经获得的Ct值,结合二分之一算法重新判定样本是否为胃癌阳性。二分之一算法判定待测样本的标准为:待测样本中区域A和区域B中的至少一者为甲基化阳性,则该样本为胃癌阳性样本;待测样本中区域A和区域B均为甲基化阴性,则该样本为胃癌阴性样本。基于上述标准,核酸组合3和12联合检测区域A和区域B的甲基化水平从而诊断胃癌血浆样本的性能如表9和图3所示。
表9区域A和区域B联合诊断胃癌血浆样本的性能
由表9可以看出,采用二分之一算法,通过联合检测区域A和区域B的甲基化水平诊断胃癌患者血浆样本的性能优异。具体地,两区域联合诊断早期和进展期胃癌血浆样本的灵敏度分别为75%和94.44%,其诊断肠型、弥漫型和未分型胃癌血浆样本的灵敏度分别为84.85%、88.10%和85.45%,其诊断138例胃癌血浆样本的总灵敏度可达87.68%,其检测125例对照样本的总特异性为92.80%。由表8和表9可以看出,区域A和区域B联合诊断胃癌血浆样本的性能优于单独的区域A或区域B,区域A和区域B在诊断灵敏度上表现出互补,即二者联合诊断胃癌血浆样本的性能更佳。
实施例5区域A和区域B联合诊断胃癌血浆样本的性能验证
1.血液样本收集
于郑州某医院收集经病理组织活检确诊为胃癌患者的血液样本67例,其中,按照病理分期包括早期(Ⅰ&Ⅱ期)19例和进展期(Ⅲ&Ⅳ期)48例;按照Lauren分型包括肠型胃癌28例、弥漫型胃癌36例和混合型3例。同时于该院收集健康人血液样本68例。收集的每份血液样本的体积不低于10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.血浆样本DNA提取、转化和纯化同实施例4。
3.qPCR(探针法)检测及结果分析
本实施例进行三重qPCR反应以同时检测区域A、区域B的甲基化水平和ACTB基因的量,所用核酸组合为核酸组合3和核酸组合12,经过优化的qPCR反应体系如表10所示,qPCR反应程序见表5。三重qPCR的结果分析和判定方法与实施例4相同。
表10三重qPCR反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum IIPCR缓冲液(Thermo Scientific) | 10× | 5 |
dNTPs | 各10mM | 1 |
区域A、区域B、ACTB基因的上游引物 | 各10μM | 1 |
区域A、区域B、ACTB基因的下游引物 | 各10μM | 1 |
区域A、区域B、ACTB基因的检测探针 | 各10μM | 1 |
DNA聚合酶 | / | 0.5 |
模板 | / | 20 |
纯化水 | / | 补至50 |
4.区域A和区域B诊断胃癌血浆样本的性能验证
根据实施例4所用的二分之一算法在另一来源的样本集中验证区域A和区域B的诊断胃癌血浆样本的性能,结果如表11和图4所示。
表11区域A和区域B联合诊断胃癌血浆样本的性能验证
由表11可以看出,通过联合检测区域A和区域B的甲基化水平可以有效区分胃癌患者和健康者的血浆样本。具体地,区域A和区域B联合诊断早期和进展期胃癌血浆样本的灵敏度分别为78.95%和87.5%,其诊断肠型和弥漫型胃癌血浆样本的灵敏度分别为82.14%和80.56%,其检测胃癌的总灵敏度可达85.07%,其总特异性为95.59%。
综上,在不同来源的样本中,区域A和/或区域B诊断胃癌血浆样本的性能较优异,能够有效地检出胃癌患者,且对早期胃癌样本和不同Lauren分型的胃癌样本均有较高的诊断灵敏度。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本申请的较佳实施例,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测胃癌的核酸组合,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述核酸组合用于检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平。
2.根据权利要求1所述的核酸组合,其特征在于,所述核酸组合包括用于检测样本中Chr11:123430435-123430582和/或Chr11:123430914-123431068的甲基化水平的引物对。
3.根据权利要求2所述的核酸组合,其特征在于,所述用于检测Chr11:123430435-123430582的甲基化水平的引物对选自如下引物对中的至少一组:
SEQ ID NO.5~6所示的第一引物对;SEQ ID NO.8~9所示的第二引物对;SEQ IDNO.11~12所示的第三引物对;SEQ ID NO.14~15所示的第四引物对。
4.根据权利要求2所述的核酸组合,其特征在于,所述用于检测Chr11:123430914-123431068的甲基化水平的引物对选自如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.29~30所示的第九引物对;SEQ ID NO.32~33所示的第十引物对;SEQ IDNO.35~36所示的第十一引物对;SEQ ID NO.38~39所示的第十二引物对。
5.根据权利要求2至4任一项所述的核酸组合,其特征在于,所述核酸组合还包括检测探针;
所述核酸组合选自如下(1)-(8)组核酸组合中的至少一组:
(1)SEQ ID NO.5~6所示的第一引物对和SEQ ID NO.7所示的第一探针;
(2)SEQ ID NO.8~9所示的第二引物对和SEQ ID NO.10所示的第二探针;
(3)SEQ ID NO.11~12所示的第三引物对和SEQ ID NO.13所示的第三探针;
(4)SEQ ID NO.14~15所示的第四引物对和SEQ ID NO.16所示的第四探针;
(5)SEQ ID NO.29~30所示的第九引物对和SEQ ID NO.31所示的第九探针;
(6)SEQ ID NO.32~33所示的第十引物对和SEQ ID NO.34所示的第十探针;
(7)SEQ ID NO.35~36所示的第十一引物对和SEQ ID NO.37所示的第十一探针;
(8)SEQ ID NO.38~39所示的第十二引物对和SEQ ID NO.40所示的第十二探针。
6.根据权利要求5所述的核酸组合,其特征在于,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,所述检测探针的3'端包含有荧光淬灭基团。
7.用于检测胃癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1至6任一项所述的核酸组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
9.权利要求1至6任一项所述的核酸组合或权利要求7或8所述的试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌;和/或,所述胃癌选自Lauren分型中肠型、弥漫型或混合型的胃癌;
所述胃癌诊断产品包括体外血液甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410175279.0A CN117778582A (zh) | 2024-02-07 | 2024-02-07 | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410175279.0A CN117778582A (zh) | 2024-02-07 | 2024-02-07 | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117778582A true CN117778582A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90396546
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410175279.0A Pending CN117778582A (zh) | 2024-02-07 | 2024-02-07 | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117778582A (zh) |
-
2024
- 2024-02-07 CN CN202410175279.0A patent/CN117778582A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2021128519A1 (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
WO2023071890A1 (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
CN117431321A (zh) | 一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用 | |
WO2020063898A1 (zh) | Hoxa7甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途 | |
US11542559B2 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
CN117778582A (zh) | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN115786502B (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 | |
CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
CN118127161A (zh) | 用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用 | |
CN118109589A (zh) | 用于检测胰腺癌分子标志物甲基化水平的试剂、试剂盒及应用 | |
CN116751863A (zh) | 一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用 | |
CN117778572A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 | |
CN117467763A (zh) | 一种检测非小细胞肺癌生物标志物甲基化水平的核酸组合和试剂盒 | |
CN117144012A (zh) | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 | |
CN117778573A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN116179698A (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用 | |
CN117265110A (zh) | 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用 | |
CN118064592A (zh) | 用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN117106899A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
CN116516005A (zh) | 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用 | |
CN117402973A (zh) | 一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用 | |
CN117327794A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用 | |
CN116694763A (zh) | 一种用于肝细胞癌检测的核酸产品、试剂盒及应用 | |
CN116716408A (zh) | 检测肺结节良恶性的dna甲基化组合物、试剂盒及应用 | |
CN118064593A (zh) | 前列腺癌生物标志物、前列腺癌检测试剂盒及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |