CN118127161A - 用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请属于分子生物学检测领域,更具体地,涉及用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用。本申请提供了能够用于检测胃癌的甲基化标志物,包括DLGAP3基因的Chr1:34930075‑34930239负链的全长或部分区域,还包括RORB基因的Chr9:74497814‑74498053正链的全长或部分区域。本申请提供的用于检测胃癌的试剂、试剂盒,通过检测血浆样本中甲基化分子标志物的甲基化水平对不同病理分期和不同分型的胃癌均具有较好的检测效果,可以有效提高早期胃癌的检出率,能够避免假阴性/假阳性结果的检出,检测准确度高。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学检测领域,更具体地,涉及用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
胃癌是全球发病率和死亡率均居于第3位的恶性肿瘤,严重威胁着人类健康。由于缺乏特异性的早期检测手段,且绝大多数患者在胃癌早期无明显不适症状或症状比较轻微,直至身体明显不适时才就诊,因此大多数患者在确诊时已发展为进展期胃癌,从而延误了最佳的治疗时机。据统计,早期胃癌患者5年生存率可达91%,随着疾病进展,肿瘤细胞侵袭至更深层组织时(如浆膜层和肌层),患者5年存活率则降至20%。目前,根治性胃切除术仍然是治疗胃癌的主要方法,但是早期胃癌的诊断率不到10%。早发现、早确诊、早治疗是降低胃癌死亡率的关键。
胃癌的发生与吸烟、幽门螺杆菌感染、EB病毒感染、胃食管反流病等危险因素有关,其中幽门螺杆菌被世界卫生组织认定为一类致癌物。胃癌诊断的金标准为侵入性的内镜检查和病理活检。利用上消化道内镜能直观地发现并评估病灶,但是该方法对医疗资源和医师的技能要求较高,且依从性不高;而病理活检为有创性操作,容易出现并发症。内镜及病理活检技术的局限性使其难以成为适用于大规模人群的胃癌筛查手段。
近年来,血清肿瘤标志物的检测被广泛应用到临床,通过检测血清中的肿瘤标志物如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA19-9、CA125)等,可对一些恶性肿瘤进行筛查或复发监测,但是这些肿瘤标志物诊断灵敏度较低,如这些标志物对Ⅰ期胃癌的诊断灵敏度通常低于20%,且缺乏特异性,在胃癌的筛查和早期诊断中发挥的作用不大。因此,临床尚急需一种简便、高灵敏度、高特异性、无创的胃癌筛查和诊断方案。
发明内容
针对传统技术的缺陷,本申请的目的在于提供用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用,旨在解决传统技术对于胃癌检测,尤其是早期胃癌检测容易出现假阳性和假阴性结果、检测灵敏性和特异性低等的技术问题。
为实现上述目的,本申请提供了用于检测胃癌的甲基化分子标志物,以Grch38.p14为参考基因组,所述甲基化分子标志物包括DLGAP3基因的Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域,还包括RORB基因的Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域。
优选地,所述试剂包括用于检测样本中所述Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域的甲基化水平的第一试剂,还包括用于检测样本中所述Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域的甲基化水平的第二试剂。
优选地,所述第一试剂包括如下核酸组合中的至少一组:
核酸组合A,SEQ ID NO.5~6所示的引物对和SEQ ID NO.7所示的检测探针;
核酸组合B,SEQ ID NO.8~9所示的引物对和SEQ ID NO.10所示的检测探针;
核酸组合C,SEQ ID NO.11~12所示的引物对和SEQ ID NO.13所示的检测探针。
优选地,所述第二试剂包括如下核酸组合中的至少一组:
核酸组合D,SEQ ID NO.14~15所示的引物对和SEQ ID NO.16所示的检测探针;
核酸组合E,SEQ ID NO.17~18所示的引物对和SEQ ID NO.19所示的检测探针;
核酸组合F,SEQ ID NO.20~21所示的引物对和SEQ ID NO.22所示的检测探针。
进一步优选地,所述试剂包括如下组合中的至少一组:
所述核酸组合A、所述核酸组合B和所述核酸组合C中的任一者与所述核酸组合D的组合;
所述核酸组合A、所述核酸组合B和所述核酸组合C中的任一者与所述核酸组合E的组合;
所述核酸组合A、所述核酸组合B和所述核酸组合C中的任一者与所述核酸组合F的组合。
优选地,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,所述检测探针的3'端包含有荧光淬灭基团。
本申请还提供了用于检测胃癌的试剂盒,所述试剂盒包括所述试剂。
优选地,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
优选地,所述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌。
本申请还提供了所述甲基化分子标志物或所述试剂或所述试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
总体而言,通过本申请所构思的以上技术方案与传统技术相比,主要具备以下的技术优点:
(1)本申请提供了能够用于检测胃癌的甲基化标志物,包括DLGAP3基因的Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域,还包括RORB基因的Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域。根据上述甲基化分子标志物的甲基化信息,能够有效区分胃癌患者和对照组(包括上消化道良性疾病患者和健康受试者),在实现无创检测的同时,提高胃癌的检测灵敏度和特异性。
(2)本申请提供的用于检测胃癌的试剂、试剂盒,通过检测血浆样本中甲基化分子标志物的甲基化水平对不同病理分期和不同分型的胃癌均具有较好的检测效果。具体地,检测早期胃癌(Ⅰ&Ⅱ期)、进展期胃癌(Ⅲ&Ⅳ期)的检测灵敏度分别可达80%、92.98%,其对于早期浅表型胃癌的检出率为83.87%、对于进展期浸润溃疡型胃癌的检出率为82.98%,可以有效提高早期胃癌的检出率,避免假阴性结果的检出。此外,其检测上消化道良性疾病患者(包括食管炎、胃炎、胃溃疡等)的特异性可达89%,检测健康受试者血浆样本的特异性可达97.83%,能够有效避免假阳性结果的检出,避免上消化道良性疾病的过度治疗,检测准确度高。
附图说明
图1是本申请中区域1、区域2检测胃癌和癌旁组织样本的性能,其中内容A为区域1、内容B为区域2;
图2是本申请中区域1、区域2检测胃癌血浆样本的ROC曲线,其中内容A为区域1、内容B为区域2;
图3是本申请中区域1联合区域2检测胃癌血浆样本的ROC曲线;
图4是本申请独立测试集中区域1联合区域2检测胃癌血浆样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
在本申请的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”胃癌是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有胃癌。
术语“胃癌”以最广泛的含义使用,并且是指在胃中开始的所有癌症。其包括在胃中开始的以下亚型:腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤、类癌瘤和鳞状细胞癌、小细胞癌和平滑肌肉瘤。其还包括以下阶段(根据TNM分类所限定):0期、IA期、IB期、IIA期、IIB期、IIIA期、IIIB期、IIIC期和IV期。或其还包括巴黎分型分中的表浅型胃癌。或其还包括Borrmann分型中的浸润溃疡型胃癌。
术语“样本”是指可能包含需要进行分析的目标区域的任何物质,包括生物样本。在本申请中,“样本”或“生物样本”可以是直接从生物来源获得的样本或者是被处理的样本。样本或生物样本包括,但不限于,体液(例如全血、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样本、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样本,以及由此衍生出的加工样本。
术语“受试者”可以是哺乳动物或哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本申请中,哺乳动物是指任何种类的哺乳动物,优选人(包括人、人受试者或人患者)。
术语“甲基化分子标志物”是指一种生化指标,其包括至少一个甲基化基因座和/或至少一个甲基化基因座的甲基化状态,例如高甲基化基因座。特别地,甲基化分子标志物是甲基化状态在癌症个体和非癌个体呈现差异化的一个或多个核酸基因座。其中,“甲基化基因座”是指包含至少一个差异甲基化区域的DNA区域或片段。在选定的条件下,例如癌症状态下,甲基化基因座是高甲基化的,即相比于非癌状态包括更多数量或频率的甲基化位点;或者,在癌症状态下,甲基化基因座可以是低甲基化的,即相比于非癌状态包括较少数量或频率的甲基化位点。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”是指一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本申请公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐或其组合的试剂,经过甲基化转化试剂处理的DNA,其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变,可以区分例如CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
术语“检测探针”是指包含5'荧光报告基团和3'淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。当检测探针所携带的荧光基团不同时,qPCR(探针法)反应体系可满足同时检测多个目标基因的需求。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经甲基化转化试剂处理后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可区分甲基化与非甲基化的DNA序列。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经甲基化转化试剂转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。在本申请公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地,是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断检测的不同可能切点的真阳性率相比于假阳性率的图。它展示了灵敏度和特异度之间的协调,具体取决于所选的切割点(灵敏度的任何升高都将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好;最佳值是1;随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线,面积为0.5)。
DNA甲基化是最常见的一种表观遗传修饰方式,DNA的异常甲基化与肿瘤细胞的发生、转移和侵袭密切相关。DNA的异常甲基化主要发生在富含CpG岛的启动子区域,启动子区域的高甲基化会阻碍转录因子与启动子结合,从而使抑癌基因沉默或者表达水平降低。抑癌基因的沉默易导致胃癌细胞的生长分裂不受控制,并促进胃癌的进一步发展。DNA的异常甲基化是癌症发生的特征性事件且在癌症早期甚至癌前病变期即可出现。多数消化道恶性肿瘤患者的血浆中存在循环的肿瘤DNA(ctDNA),ctDNA携带了与肿瘤细胞基因组相同的遗传信息和表观遗传信息。因此,通过检测血浆中某些DNA区域异常的甲基化状态的变化可能具有诊断胃癌及早期胃癌的潜力。
本申请提供了用于检测胃癌的甲基化分子标志物,所述甲基化分子标志物包括DLGAP3基因的Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域,还包括RORB基因的Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域。
本申请的发明人发现,上述甲基化分子标志物的甲基化水平与胃癌存在显著的相关性。上述甲基化分子标志物的甲基化状态可以被量化,并用于衡量其甲基化水平。一些实施例中,包含上述甲基化分子标志物的样本可以广泛地采集自受试者的器官、组织、细胞和体液等。一些实施例中,上述甲基化分子标志物也可以使用DNA重组技术、PCR法、利用DNA/RNA自动合成仪的方法等一般的技术来合成。上述甲基化分子标志物在胃癌早期筛查/诊断、胃癌患病风险预测、胃癌预后预测、胃癌相关药物评估等方面的应用可实现筛查/诊断、预测、评估的灵敏度和特异性的提高。
基于此,本申请提供了用于检测胃癌的试剂,上述试剂包括用于检测样本中所述Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域的甲基化水平的第一试剂,还包括用于检测样本中所述Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域的甲基化水平的第二试剂。
一些实施例中,上述第一试剂包括如下核酸组合中的至少一组:
核酸组合A,SEQ ID NO.5~6所示的引物对和SEQ ID NO.7所示的检测探针;
核酸组合B,SEQ ID NO.8~9所示的引物对和SEQ ID NO.10所示的检测探针;
核酸组合C,SEQ ID NO.11~12所示的引物对和SEQ ID NO.13所示的检测探针。
一些实施例中,上述第二试剂包括如下核酸组合中的至少一组:
核酸组合D,SEQ ID NO.14~15所示的引物对和SEQ ID NO.16所示的检测探针;
核酸组合D,SEQ ID NO.17~18所示的引物对和SEQ ID NO.19所示的检测探针;
核酸组合F,SEQ ID NO.20~21所示的引物对和SEQ ID NO.22所示的检测探针。
需要说明的是,若一种引物对与上述引物对所示的核苷酸序列具有至少具有85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)等以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的胃癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本申请的保护范围内。
较佳实施例中,上述试剂包括如下组合中的至少一组:
上述核酸组合A、上述核酸组合B和上述核酸组合C中的任一者与上述核酸组合D的组合;
上述核酸组合A、上述核酸组合B和上述核酸组合C中的任一者与上述核酸组合E的组合;
上述核酸组合A、上述核酸组合B和上述核酸组合C中的任一者与上述核酸组合F的组合。
在本申请的更佳实施例中,上述试剂包括如下组合中的至少一组:
上述核酸组合A与上述核酸组合E的组合;
上述核酸组合A与上述核酸组合F的组合;
上述核酸组合C与上述核酸组合E的组合;
上述核酸组合C与上述核酸组合F的组合。
本申请对于胃癌的类型、分期没有限制。在本申请的一些具体实施例中,上述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌。在另一具体实施例中,上述胃癌可以是巴黎分型中的表浅型胃癌,还可以是Borrmann分型中的浸润溃疡型胃癌。
一些实施例中,上述样本选自组织(例如组织切片)、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在申请的一些优选实施例中,上述样本为组织、全血、血浆或血清。在申请的一些更优选实施例中,上述样本为全血、血浆或血清。由于采样的便捷性等方面,本申请提供的检测胃癌的核酸组合可以是用于胃癌早期筛查、检测或辅助检测的核酸组合。
基于本申请公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述甲基化分子标志物的甲基化水平进行检测,对胃癌进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本申请的保护范围。上述检测样本中甲基化分子标志物的甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本申请的一些方面,提供了上述试剂在制备用于检测胃癌的试剂盒中的应用。
基于此,本申请提供了用于检测胃癌的试剂盒,其包括上述试剂。
一些实施例中,上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌;和/或,上述胃癌选自Lauren分型中肠型、弥漫型或混合型的胃癌。
本申请并不对上述内参基因进行限定,上述内参基因可以是但不限于ACTB。在本申请具体实施例中,上述内参基因为ACTB,上述用于扩增内参基因ACTB的检测引物对包括上游引物和下游引物,上游引物为:AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.23),下游引物为:AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.24);上述内参基因ACTB的检测探针为:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.25)。
一些实施例中,上述检测探针的5'端均含有荧光报告基团,3'端均含有荧光淬灭基团,上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种;上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中,上述核酸提取试剂包括但不限于裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。一些实施例中,上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中,上述阳性对照品是指其中包含甲基化的甲基化分子标志物,用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性参考品是指其中不包含甲基化的甲基化分子标志物,用于监测实验是否受到污染。
本申请中上述甲基化转化试剂用于将DNA中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本申请对甲基化转化试剂无特别限制,现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,如肼盐、重亚硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
本申请还提供了上述甲基化分子标志物或上述的试剂或上述试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
一些实施例中,上述胃癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。可选地,上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。
可以理解的是,上述诊断包括但不限于胃癌的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、胃癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。其中,上述胃癌的鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有胃癌或者更加有可能患有胃癌;上述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶;上述胃癌复发及预后的辅助判断是指胃复发的风险和预后情况预测,具体可以是用于确认个体胃复发的可能性或恶化倾向,可用于指导临床诊疗;上述药物疗效评耐药监测具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对个体有效。
本申请还提供了一种通过检测样本中胃癌甲基化生物标志物的甲基化水平进而检测胃癌的方法,包括如下步骤:
S1、提取受试者样本的DNA,采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化;
S2、采用本申请提供的上述试剂盒进行qPCR扩增,通过qMSP法检测胃癌甲基化生物标志物的甲基化水平;
S3、基于S2的结果,进而判断待测样本为胃癌阴性或阳性。
在本申请的一些实施例中,上述待测样本为全血、血浆或血清。本申请提供的上述方法能够进行高灵敏度和高特异性的胃癌的早期诊断,由此带来早期的治疗和预后的改善,进一步地,还能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放射线疗法的治疗和化学疗法的治疗的有效性。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本申请,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请。下述实施例与测试例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例与测试例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下为实施例:
实施例1区域1和区域2在胃癌组织样本中的甲基化水平显著高于癌旁正常样本
目前,检测DNA甲基化的方法有很多种,如甲基化特异性PCR、甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)、亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序、全基因组亚硫酸氢盐测序、甲基化敏感性限制性内切酶法、甲基化DNA免疫沉淀测序或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析等,其中,甲基化特异性荧光定量PCR法具有操作简便、快速、成本低、通量高且检测灵敏度高等优点,是临床上常用的检测DNA甲基化的方法。基于上述考虑,本申请采用甲基化特异性荧光定量PCR法(探针法)检测待测样本中区域1和区域2的甲基化水平。为了能有效区分甲基化的DNA和未甲基化的DNA,本申请使用亚硫酸氢盐处理DNA,使得未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,在PCR扩增中,尿嘧啶碱基被胸腺嘧啶碱基所替代。通过比较亚硫酸氢盐处理前后CpG二核苷酸位点为CG还是TG来判断胞嘧啶是否为甲基化的胞嘧啶。
区域1的DNA序列为:Chr1:34930075-34930239负链
GACGCCTGCCAGCGGCTCCGAGGCCGGGCACAGCGCCCCATCCTGGCAGGGGCTGGGGCCGAAGAGGGGGGCTCCCTGACCCCAAGCCAGGAGCTGAGGTCAGGCGGCCGACCGGGAAAGCCCGAAGGAGAGTCTCCTAAGCGGACGGGCCTGGGGGCTGTGTGT(SEQ ID NO.1)。
区域1经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
GACGTTTGTTAGCGGTTTCGAGGTCGGGTATAGCGTTTTATTTTGGTAGGGGTTGGGGTCGAAGAGGGGGGTTTTTTGATTTTAAGTTAGGAGTTGAGGTTAGGCGGTCGATCGGGAAAGTTCGAAGGAGAGTTTTTTAAGCGGACGGGTTTGGGGGTTGTGTG T(SEQ ID NO.2)。
区域2的DNA序列为:Chr9:74497814-74498053正链
GTCACCCTGCAGCCACGGCGTCCGCCTAAAGGGATGGTTTTCTCGGCAGAGCAGCTCTTCGCCGACCACCTTCTTCACTCGTGCTGAGCGGGATTTTTGGGCTCTCCGGGGTTCGGGCTGGGAGCAGCTTCATGACTACGCGGAGCGGGAGAGCGGCCACACCATGCGAGGTAAGCGAGTCTGCGGGCACCGAGGCTCCCCGAGTCCGGCCAACTCCAGCCAGACGGGGAGATGGGGGAG(SEQ ID NO.3)。
区域2经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为:
GTTATTTTGTAGTTACGGCGTTCGTTTAAAGGGATGGTTTTTTCGGTAGAGTAGTTTTTCGTCGATTATTTTTTTTATTCGTGTTGAGCGGGATTTTTGGGTTTTTCGGGGTTCGGGTTGGGAGTAGTTTTATGATTACGCGGAGCGGGAGAGCGGTTATATTATGCGAGGTAAGCGAGTTTGCGGGTATCGAGGTTTTTCGAGTTCGGTTAATTTTAGTTAGACGGGGAGATGGGGGAG(SEQ ID NO.4)。
1)样本收集
收集88例经病理检测确诊为胃癌患者的癌组织样本和78例癌旁组织样本,所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。88例胃癌组织样本中,病理分期为Ⅰ期和Ⅱ期的样本28例,病理分期为Ⅲ期和Ⅳ期的样本60例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2)样本DNA提取、转化、纯化
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的组织样本DNA进行亚硫酸氢盐转化及DNA纯化回收,具体操作步骤见试剂盒说明书。
3)PCR法(探针法)检测
分别以区域1和区域2经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为模板,设计各个区域特异性的甲基化检测引物对和检测探针。所述甲基化检测引物对需具备良好的扩增特异性,即甲基化检测引物对不会扩增非甲基化的模板;另外,所述甲基化检测引物对需具备良好的检测灵敏度,即当模板中含有大于等于1%的甲基化DNA序列时,扩增产物仅为甲基化的DNA序列;再者,所述甲基化检测引物对需具备良好的扩增效率,其扩增效率应在90%~110%之间。满足上述要求的用于扩增所述目标区域的甲基化检测引物对和与之对应的检测探针的核苷酸序列如表1所示。
表1区域1和区域2的甲基化检测引物对及检测探针的核苷酸序列
将表1中经人工合成的甲基化检测引物对和检测探针稀释至合适的浓度备用,以经亚硫酸氢盐转化和纯化的组织样本DNA为模板,进行甲基化特异性荧光定量PCR反应以检测待测样本中各个目标区域的甲基化水平。在对每个样本进行检测时,除加入目标区域特异性的甲基化检测引物对和检测探针以外,还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针,用以监测样本质量及结果判读。配置PCR反应体系用到的热启动Taq酶以及PCR缓冲液购自Invitrogen(Cat:14966005),qPCR的配置体系如表2所示。
表2 qPCR反应体系
组分 | 用量(μL) |
10×Taq buffer(Mg2+Free) | 5 |
25mM Mg2+ | 4 |
dNTP Mix(10mM each) | 1 |
每一区域的上游引物(10μM) | 1 |
每一区域的下游引物(10μM) | 1 |
每一区域的检测探针(10μM) | 1 |
ACTB上游引物(10μM) | 1 |
ACTB下游引物(10μM) | 1 |
ACTB检测探针(10μM) | 1 |
热启动Taq DNA聚合酶 | 0.5 |
模板DNA | 10 |
超纯水 | 补至50 |
当使用qMSP法检测单个区域在样本中的甲基化水平时,一个PCR反应管中加入单个区域的一组甲基化引物对和检测探针,同时加入必需的反应成分和模板,以及内参基因ACTB的检测引物对(SEQ ID NO.23~24)和检测探针(SEQ ID NO.25)。此外还需要设置阴性和阳性对照。阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液,其它成分与实验管相同;阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含转化后单个区域的质粒等体积的混合物,其它成分与实验管相同。
当使用qMSP法检测区域1和区域2在样本中的甲基化水平时,本申请的反应体系为三重PCR反应,同一个PCR反应管内同时检测区域1、区域2和ACTB基因,区域1特异性的检测探针5'端的荧光报告基团为FAM,3'端的荧光淬灭基团为MGB,区域2特异性的检测探针5'端的荧光报告基团为ROX,3'端的荧光淬灭基团也为MGB,ACTB基因特异性的检测探针5'端的报告基团为VIC,3'端淬灭基团为BHQ1。另外,还需设置阴性对照和阳性对照。阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液,其它成分与实验管相同;阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒、103copies/μL含转化后区域1的质粒和103copies/μL含转化后区域2的质粒等体积的混合物,其它成分与实验管相同。然后按照表3所示的程序进行qPCR反应。
表3qPCR反应程序
qPCR反应结束后,调整基线并设置阈值,阈值必须位于指数扩增期内,穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果,要求阴性对照PCR管无扩增(即不起线);阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管目标基因的Ct值在26~30之间;待测样本的内参基因的Ct值≤33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当次实验无效,必须重新进行检测。
4)结果判定:
对于组织样本,单一区域检测时,若使用某一对甲基化检测引物和探针进行扩增的Ct值≤37,认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性;若使用某一对甲基化检测引物和探针进行扩增的Ct值>37,认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性。区域组合检测时,对于某一待测样本,若区域1和区域2中至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为胃癌阳性样本;若区域1和区域2均为甲基化阴性,则该样本为胃癌阴性样本。
根据上述标准,通过qMSP法检测区域1和/或区域2的甲基化水平进而诊断胃癌组织样本的性能如表4、表5所示。
表4单个区域(区域1、区域2)对组织样本的检出率
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由图1内容A、图1内容B和表4可以看出,在胃癌组织样本中,区域1、区域2的甲基化水平分别远远高于癌旁组织样本。具体地,超过98%的胃癌组织样本中区域1为甲基化阳性,超过92%的胃癌组织样本中区域2为甲基化阳性;超过87%的癌旁组织样本中区域1为甲基化阴性,超过84%的癌旁组织样本中区域2是甲基化阴性。此外,在早期胃癌中(Ⅰ&Ⅱ期),区域1、区域2发生甲基化的样本比例分别超过96%、78%,在进展期胃癌中(Ⅲ&Ⅳ期),区域1、区域2为甲基化阳性的样本比例更高,接近100%。核酸组合A~C检测区域1甲基化水平的效果相当,其中,核酸组合C对癌旁组织的检测特异性最高;检测区域2甲基化水平的3组核酸组合中,核酸组合E的检测效果最佳,其对胃癌组织的检出率为97.73%,对癌旁组织的检测特异性为93.59%。
表5区域1和区域2的组合对组织样本的检出率
由表5可以看出,以区域1和区域2的组合作为甲基化分子标志物,使用表1中提供的6组核酸组合进行qMSP扩增时,其对胃癌组织样本的检出率均为100%,对癌旁组织样本的特异性均高于78%。其中,使用核酸组合A+E、A+F、C+E和C+F分别扩增分子标志物时,对癌旁组织样本的特异性较高,均大于85%。
实施例2区域1和区域2检测胃癌患者血浆样本的性能
1)样本收集
于武汉某医院收集经病理组织活检确诊为胃癌患者的血液样本187例,收集经胃镜检查结果显示为上消化道良性疾病(如食管炎、胃炎、胃溃疡等)的受试者血液样本220例,收集健康受试者血液样本125例。收集的每份血液样本的体积不低于10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2)样本DNA提取、转化和纯化
收集抗凝血后进行两次离心,分离血浆层。随后使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化及DNA纯化回收,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书。
3)qPCR(探针法)检测
从实施例1中可以看出,针对区域1所设计的3组核酸组合的检测效果相一致,针对区域2所设计的核酸组合E的诊断效果最佳,因此,在检测血浆样本时,选择核酸组合C扩增区域1,核酸组合E扩增区域2。确定核酸组合后,使用qPCR(探针法)检测血浆样本中区域1、区域2的甲基化水平,具体的检测方法同实施例1,PCR扩增结束后,Ct值的读取和质量控制同实施例1。
4)阳性判断值的确定
从187例胃癌样本中随机选择112例,将所述样本的分组状态设置为1;从220例消化道良性疾病样本中随机选择132例,将所述对照样本的分组状态设置为0,从125例健康样本中随机选择75例,所述对照样本的分组状态同样设置为0。分析上述319例样本的Ct值,使用IBM SPSS25.0软件绘制ROC曲线,分别记录区域1和区域2的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的截断值、灵敏度和特异性,而此时的截断值即为阳性判断值,结果如图2内容A、图2内容B和表6所示。
表6区域1、区域2诊断319例胃癌和非癌血浆样本的性能
目标区域 | 灵敏度(%) | 特异性(%) | AUC值 | 阳性判断值 |
区域1 | 76.2 | 92.3 | 0.838 | 47.6 |
区域2 | 69.9 | 95.2 | 0.820 | 47.8 |
由图2和表6可以看出,区域1、区域2诊断胃癌血浆样本的截断值分别为47.6和47.8。与组织样本相比,区域1、区域2诊断胃癌血浆样本的灵敏度明显下降,推测这可能是由于血浆样本中循环的肿瘤DNA含量过低引起的。此外,区域1、区域2区分癌和非癌的能力较强,其在血浆样本中显示出较高的特异性。
5)区域1联合区域2诊断胃癌血浆样本的性能
获得区域1、区域2的阳性判断值后,按照表7所示的方法分析区域1联合区域2诊断75例胃癌血浆样本、88例上消化道良性疾病血浆样本和50例健康血浆样本(即阳性判断值分析剩余的样本,共213例)的性能。具体如下:
使用表7所示的方法,若待测样本被判定为胃癌阳性,则该样本记为1,若待测样本被判定为胃癌阴性,则该样本记为0,同时以临床参考标准的结果进行分组,即经胃镜和/或病理诊断为胃癌患者记为1,经胃镜诊断为上消化道良性疾病者或健康受试者记为0,然后以临床参考标准的结果为状态变量,以表7判定的结果为检验变量,绘制ROC曲线以评估区域1联合区域2诊断胃癌血浆样本的性能,结果如图3所示。
表7血浆样本的判定方法
由图3可以看出,在213例血浆样本中,区域1联合区域2诊断胃癌患者血浆样本的灵敏度高达88%,其检测上消化道良性疾病和健康受试者血浆样本的特异性为92%,其AUC值为0.88。可以看出,相较于单个区域,区域1和区域2联合诊断的性能最佳,其检测胃癌样本的灵敏度显著高于以单个区域作为甲基化分子标志物,且两区域联合诊断的特异性并没有明显降低。
实施例3在独立测试集中分析区域1和区域2联合诊断胃癌患者血浆样本的性能
于上海某医院收集经病理组织活检确诊为胃癌患者的血液样本102例,收集100例经胃镜检查诊断为上消化道良性疾病(包括食管炎,胃炎,胃溃疡等)的受试者血液样本和46例健康受试者血液样本,作为对照组。所有胃癌患者均已获得病理分期信息,部分早期胃癌(Ⅰ&Ⅱ期)患者的病例报告表中含巴黎分型信息,部分进展期胃癌(Ⅲ&Ⅳ期)患者的病例报告表中含Borrmann分型信息,具体的病理信息如表8所示。收集的每份血液样本的体积不低于10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
表8胃癌患者的病理信息
上述血浆样本的核酸提取、转化、纯化、qMSP检测、Ct值读取和质量控制、根据Ct值进行的结果判定(如表7)同实施例2。区域1联合区域2诊断上述胃癌和对照组血浆样本的性能如表9和图4所示。
表9独立测试集样本中区域1联合区域2诊断胃癌和对照组血浆样本的性能
由表9和图4可以看出,对于含248例血浆样本的独立测试集样本,区域1联合区域2诊断胃癌血浆样本的效果优异,其诊断胃癌血浆样本的灵敏度为87.25%,特异性为91.78%,AUC值为0.895。具体地,对于45例早期胃癌(Ⅰ期和Ⅱ期)血浆样本,其检出率为80%,对于57例进展期胃癌(Ⅲ期和Ⅳ期)血浆样本,其检出率为92.98%;对于31例早期表浅型胃癌血浆样本,其检出率为83.87%;对于进展期浸润溃疡型胃癌血浆样本,其检出率为82.98%。对于100例消化道良性疾病血浆样本,其检测特异性为89%;对于46例健康受试者血浆样本,其检测特异性为97.83%。
综上,通过qMSP法检测区域1和区域2的甲基化能够有效诊断胃癌,尤其是早期胃癌,本申请为胃癌的检测提供了一种高灵敏度、高特异性且无创的检测方法。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本申请的较佳实施例,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测胃癌的甲基化分子标志物,其特征在于,以Grch38.p14为参考基因组,所述甲基化分子标志物包括DLGAP3基因的Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域,还包括RORB基因的Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域。
2.用于检测胃癌的试剂,其特征在于,所述试剂包括用于检测样本中所述Chr1:34930075-34930239负链的全长或部分区域的甲基化水平的第一试剂,还包括用于检测样本中所述Chr9:74497814-74498053正链的全长或部分区域的甲基化水平的第二试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂,其特征在于,所述第一试剂包括如下核酸组合中的至少一组:
核酸组合A,SEQ ID NO.5~6所示的引物对和SEQ ID NO.7所示的检测探针;
核酸组合B,SEQ ID NO.8~9所示的引物对和SEQ ID NO.10所示的检测探针;
核酸组合C,SEQ ID NO.11~12所示的引物对和SEQ ID NO.13所示的检测探针。
4.根据权利要求3所述的试剂,其特征在于,所述第二试剂包括如下核酸组合中的至少一组:
核酸组合D,SEQ ID NO.14~15所示的引物对和SEQ ID NO.16所示的检测探针;
核酸组合E,SEQ ID NO.17~18所示的引物对和SEQ ID NO.19所示的检测探针;
核酸组合F,SEQ ID NO.20~21所示的引物对和SEQ ID NO.22所示的检测探针。
5.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括如下组合中的至少一组:
所述核酸组合A、所述核酸组合B和所述核酸组合C中的任一者与所述核酸组合D的组合;
所述核酸组合A、所述核酸组合B和所述核酸组合C中的任一者与所述核酸组合E的组合;
所述核酸组合A、所述核酸组合B和所述核酸组合C中的任一者与所述核酸组合F的组合。
6.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,所述检测探针的3'端包含有荧光淬灭基团。
7.用于检测胃癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求2至6任一项所述的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌。
10.权利要求1所述的甲基化分子标志物或权利要求2至6任一项所述的试剂或权利要求7至9任一项所述的试剂盒在制备胃癌诊断产品中的应用。
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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CN118127161A true CN118127161A (zh) | 2024-06-04 |
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