CN118028472A - 用于检测前列腺癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents
用于检测前列腺癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请属于分子生物学检测领域,更具体地,涉及用于检测前列腺癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用。本申请提供的试剂盒通过检测样本中GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平,可以有效区分前列腺癌患者、泌尿系统良性疾病受试者和健康受试者,提供了能够用于前列腺癌检测的甲基化标志物,在实现无创检测的同时,提高前列腺癌检测的灵敏度和特异性,降低假阳性和假阴性结果的检出,避免过度诊疗。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学检测领域,更具体地,涉及用于检测前列腺癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
前列腺癌(prostatic cancer,PCa)是男性生殖系最常见的恶性肿瘤,其发病率随年龄的增加而增长且不同地区的发明率存在明显差异,其中欧美地区前列腺癌发病率较高。近年来由于人口老龄化,中国前列腺癌的发病率有所增加。
前列腺癌多发生于后叶,早期并无症状,即使有不适,也不足以引起病人重视,因此给早期诊断带来了困难。一旦临床上出现了明显症状,往往已属于病变晚期,预后不良。因此,早期发现前列腺癌显得十分重要。
前列腺癌筛查方法包括:直肠指检(DRE)、前列腺特异性抗原(PSA)的检测、经直肠超声(TRUS)和多参数磁共振检查(MP-MRI)等检测方法的联合诊断。目前临床上非侵入性检测前列腺癌的技术是前列腺特异性抗原(PSA)的检测,但PSA筛查前列腺癌的灵敏度和特异性较低,仅为57.43%和45.82%,无法区分前列腺癌和非癌,从而导致过度诊断,进行不必要的穿刺活检等。因此,亟待开发有效的前列腺癌早筛检测技术,实现无痛无创、经济便捷、精准高效筛查前列腺癌。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本申请的目的在于提供了一种用于检测前列腺癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用,旨在解决现有技术对前列腺癌检测易出现假阳性和假阴性结果、检测准确度低等的技术问题。
为实现上述目的,本申请提供了用于检测前列腺癌的引物对,其为用于检测样本中前列腺癌甲基化标志物的甲基化水平的引物对;上述前列腺癌甲基化标志物选自GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域。
优选地,以GRCh38.p14为参考基因组,上述GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域选自Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域。
优选地,上述引物对包括用于检测Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对。
进一步优选地,上述甲基化引物对为SEQ ID NO.4~5所示的甲基化引物对。
优选地,上述引物对还包括用于检测Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。
进一步优选地,上述非甲基化引物对为SEQ ID NO.6~7所示的非甲基化引物对。
本申请还提供了用于检测前列腺癌的引物探针组合,其包括上述引物对,还包括检测探针。
进一步优选地,上述引物探针组合包括SEQ ID NO.4~5所示的甲基化引物对和SEQ ID NO.10所示的检测探针。
本申请还提供了用于检测前列腺癌的试剂盒,其包括上述引物对或上述引物探针组合。
优选地,上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
优选地,上述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,3'端包含有荧光淬灭基团。
本申请还提供了上述引物对或上述引物探针组合或上述试剂盒在制备前列腺癌诊断产品中的应用。
优选地,上述前列腺癌诊断产品包括甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
总体而言,通过本申请所构思的以上技术方案与现有技术相比,主要具备以下的技术优点:
(1)本申请提供的用于检测前列腺癌的引物对、引物探针组合、试剂盒,通过检测样本中GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平,可以有效区分前列腺癌患者、泌尿系统良性疾病受试者和健康受试者,提供了能够用于前列腺癌检测的甲基化标志物,在实现无创检测的同时,提高前列腺癌检测的灵敏度和特异性,降低假阳性和假阴性结果的检出,避免过度诊疗。
(2)优选实施例中,本申请提供的用于检测前列腺癌的试剂盒通过检测尿液样本中Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平,检测前列腺癌的灵敏度达84.1%,检测泌尿系统良性疾病受试者的特异性达93%,检测健康受试者的特异性达93.5%,检测准确度高。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”前列腺癌是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有前列腺癌。
术语“样本”是指可能包含需要进行分析的目标区域的任何物质,包括生物样本。在本申请中,“样本”或“生物样本”可以是直接从生物来源获得的样本或者是被处理的样本。样本或生物样本包括但不限于体液(例如全血、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样本、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样本,以及由此衍生出的加工样本。
术语“受试者”可以是哺乳动物或哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本申请中,哺乳动物是指任何种类的哺乳动物,优选人(包括人、人受试者或人患者)。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”是指一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性概念又代表定量概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“甲基化标志物”或“标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的基因指标,可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药新疗法在目标人群中的安全性和有效性。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本申请中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指正向引物和反向引物组成的组。
术语“甲基化转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐或其组合的试剂,经过甲基化转化试剂处理的DNA,其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变,可以区分例如CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
术语“TaqMan探针”是指包含5'荧光报告基团和3'淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。当检测探针所携带的荧光基团不同时,TaqMan qPCR反应体系可满足同时检测多个目标基因的需求。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经甲基化转化试剂处理后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可区分甲基化与非甲基化的DNA序列。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经甲基化转化试剂转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除了加入甲基化检测引物,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。在本申请公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对,若Ct值满足所述要求(例如在尿液样本中Ct≤45),则表明目标序列是甲基化的。
本申请提供了用于检测前列腺癌的引物对,其为用于检测样本中前列腺癌甲基化标志物的甲基化水平的引物对;上述前列腺癌甲基化标志物选自GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域。
一些实施例中,以GRCh38.p14为参考基因组,上述GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域选自Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域。
可以理解的是,在检测Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平时,可以针对其全长区域进行检测,还可以针对其部分区域进行检测。
一些实施例中,上述引物对包括用于检测Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对。
较佳实施例中,上述甲基化引物对为SEQ ID NO.4~5所示的甲基化引物对。
一些实施例中,上述引物对还包括用于检测Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。
较佳实施例中,上述非甲基化引物对为SEQ ID NO.6~7所示的非甲基化引物对。
需要说明的是,若一种引物对与上述甲基化引物对、上述非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等)以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的前列腺癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本申请保护范围内。
一些实施例中,上述样本选自组织(例如组织切片)、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在本申请的一些优选实施例中,上述待测样本为组织、全血、血浆、血清、尿液或尿液脱落细胞。在本申请的一些更优选实施例中,上述待测样本为尿液。由于采样的便捷性等方面,本申请提供的检测前列腺癌的引物对可以是用于前列腺癌早期筛查、检测或辅助检测的引物对。
本申请还提供了用于检测前列腺癌的引物探针组合,其包括上述甲基化引物对,还包括检测探针。
一些实施例中,上述引物探针组合包括SEQ ID NO.4~5所示的甲基化引物对和SEQ ID NO.10所示的检测探针。
基于本申请公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述前列腺癌甲基化标志物(Chr20:44246939-44247339正链)的甲基化水平进行检测,对前列腺癌进行诊断,无论采用何种技术,其都属于本申请的保护范围。上述检测样本中前列腺癌甲基化标志物的甲基化水平的方法包括但不限于亚硫酸氢盐测序(BSP)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、基于限制酶的测序、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、基于限制酶的微阵列分析、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本申请还提供了用于检测前列腺癌的试剂盒,其包括上述引物对或上述引物探针组合。
一些实施例中,上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述内参基因可以为但不限于ACTB。在本申请的一些具体实施例中,内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8~9所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参引物对对应设计即可。
一些实施例中,上述检测探针为TaqMan探针,其5'端包含有荧光报告基团,3'端包含有荧光淬灭基团。上述荧光报告基团独立地选自FAM、ROX、VIC、HEX、NED、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种;上述荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。需要注意的是,各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于前述所列举。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本申请对甲基化转化试剂无特别限制,传统技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,例如但不限于肼盐、重亚硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)。
一些实施例中,上述DNA提取试剂包括但不限于裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。一些实施例中,上述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中,上述阳性对照品是指其中包含甲基化的前列腺癌甲基化标志物,用于监测试剂盒中的引物对或引物探针组合的检测性能。上述阴性参考品是指其中不包含甲基化的前列腺癌甲基化标志物,用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中,上述试剂盒还可以包括至少一个设备的任何制品(例如,包装或容器)。容器可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器。上述试剂盒还可以进一步包括用于接收生物样品的适合装置、用于实施在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书。
本申请一些方面,提供了上述引物对或上述引物探针组合或上述试剂盒在制备前列腺癌诊断产品中的用途。
一些实施例中,上述前列腺癌包括但不限于甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中。可选地,上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。需要说明的是,本申请提供的前列腺癌诊断产品并不限于上述所列举的试剂盒,只要能满足前列腺癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本申请的保护范围内。
基于此,本申请还提供了一种诊断前列腺癌的方法,包括如下步骤:获得受试者的待测样本,提取待测样本的基因组DNA和/或游离DNA,然后检测DNA中前列腺癌甲基化标志物(Chr20:44246939-44247339正链)的甲基化水平,进而判别受试者是否存在前列腺癌。
在本申请的一些具体的实施例中,上述待测样本选自组织、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在本申请的一些优选实施例中,上述待测样本为组织、全血、血浆、血清、尿液或尿液脱落细胞。在本申请的一些更优选实施例中,上述待测样本为尿液。
在本申请的其他方面,还提供了上述试剂盒在检测前列腺癌或用在检测患有前列腺癌的风险提高、疑似患有前列腺癌或已经患有前列腺癌的受试者的用途。
本申请提供的试剂盒通过检测尿液样本中Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平,能够无创、高灵敏度、高特异性的检测前列腺癌,提供了能够用于检测前列腺癌的甲基化标志物,降低假阳性和假阴性结果的检出,避免过度诊疗,带来早期的治疗和预后的改善。此外,还能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放射线疗法的治疗和化学疗法的治疗的有效性。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本申请,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1基于Sanger测序法分析目标区域检测组织样本的性能
发明人自行收集了前列腺癌组织样本和尿液样本,尝试以GRCh38.p14为参考基因组,以靶基因GDAP1L1(Chr20:44246939-44247339正链)作为诊断前列腺癌的甲基化标志物,采用Sanger测序法验证其在前列腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的甲基化水平,以明确其是否可作为诊断前列腺癌的甲基化标志物,筛选标准为:检测组织样本的灵敏度≥80%,检测组织样本的特异性≥80%。具体步骤如下:
1.样本收集
组织样本:共收集58例临床确诊为前列腺癌的癌组织样本、58例癌旁正常组织样本,上述组织样本均为经福尔马林固定且经石蜡包埋的样本。
尿液样本:共收集58例临床确诊为前列腺癌的尿液样本、58例健康受试者的尿液样本。
所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批,所有志愿者在样本收集前签署了知情同意书。
2.提取样本DNA
对于石蜡包埋的组织样本,使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织样本基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
对于尿液样本,使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)提取尿液样本DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
3.亚硫酸氢盐转化
采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化,随后对转化的DNA进行纯化,用于后续实验,具体操作步骤参见试剂盒说明书,转化完成后,用30μL纯化水进行洗脱。
4.PCR扩增及Sanger测序
用于前列腺癌诊断的甲基化标志物在前列腺癌样本中需表现为高甲基化,而在癌旁正常组织样本中表现为低甲基化或未甲基化。因此,本实施例以上述靶基因GDAP1L1作为诊断前列腺癌的甲基化标志物,设计甲基化引物对和非甲基化引物对(见表1)进行PCR反应,扩增组织样本中的目标区域,并进行Sanger测序。
靶基因GDAP1L1(Chr20:44246939-44247339正链)的核苷酸序列:
5'-AGGAATAGCTCTCTAGAATCCCAGTTAAGAAGTATTTGCCCCTT AGAAGACTGAGAGGCAGGAAAGCGTTGATGAGGGTGGAATCTTTGGCAGGTGCCTGGCCCAATACACTGAGCTGTTTGGGGGGCACGACCCACTTCCTCGGGCTCCTTCCACCCTTGCAGGGAGCCTGACACTGAGGGCTGGCGGCTTTTCTGGCGCGGGCCAGGGGGAGGAGGAGAAAGGAGCTCCCGGGATCCCCTCGCCCCCTCCCCCAACTGCCCGGTGAGTAATGACATTCACGGAGCGGGGAGGGAGGGAGGAGAGGGGCAGGCTCGGCGAGGCCATGTGATGCTGGGCGAGAGAGAGCCGCCGCGCCGGAGCCTCCTTCTTTCCTGCCTCTGATTCCGGGCTGTCATGGC-3'(SEQ ID NO.1)。
完全甲基化的靶基因GDAP1L1(Chr20:44246939-44247339正链)经亚硫酸氢盐转化后的序列:
5'-AGGAATAGTTTTTTAGAATTTTAGTTAAGAAGTATTTGTTTTTTA GAAGATTGAGAGGTAGGAAAGCGTTGATGAGGGTGGAATTTTTGGTAGGTGTTTGGTTTAATATATTGAGTTGTTTGGGGGGTACGATTTATTTTTTCGGGTTTTTTTTATTTTTGTAGGGAGTTTGATATTGAGGGTTGGCGGTTTTTTTGGCGCGGGTTAGGGGGAGGAGGAGAAAGGAGTTTTCGGGATTTTTTCGTTTTTTTTTTTAATTGTTCGGTGAGTAATGATATTTACGGAGCGGGGAGGGAGGGAGGAGAGGGGTAGGTTCGGCGAGGTTATGTGATGTTGGGCGAGAGAGAGTCGTCGCGTCGGAGTTTTTTTTTTTTTTGTTTTTGATTTCGGGTTGTTATGGT-3'(SEQ ID NO.2)。
完全未甲基化的靶基因GDAP1L1(Chr20:44246939-44247339正链)经亚硫酸氢盐转化后的序列:
5'-AGGAATAGTTTTTTAGAATTTTAGTTAAGAAGTATTTGTTTTTTA GAAGATTGAGAGGTAGGAAAGTGTTGATGAGGGTGGAATTTTTGGTAGGTGTTTGGTTTAATATATTGAGTTGTTTGGGGGGTATGATTTATTTTTTTGGGTTTTTTTTATTTTTGTAGGGAGTTTGATATTGAGGGTTGGTGGTTTTTTTGGTGTGGGTTAGGGGGAGGAGGAGAAAGGAGTTTTTGGGATTTTTTTGTTTTTTTTTTTAATTGTTTGGTGAGTAATGATATTTATGGAGTGGGGAGGGAGGGAGGAGAGGGGTAGGTTTGGTGAGGTTATGTGATGTTGGGTGAGAGAGAGTTGTTGTGTTGGAGTTTTTTTTTTTTTTGTTTTTGATTTTGGGTTGTTATGGT-3'(SEQ ID NO.3)。
表1Chr20:44246939-44247339正链的甲基化引物对和非甲基化引物对
首先配制PCR反应体系(见表2),以亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板,同时加入SYBR Green PCR Mix、Chr20:44246939-44247339正链的甲基化引物对和非甲基化引物对、内参基因ACTB的上游引物(SEQ ID NO.8:5'-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3')和下游引物(SEQ ID NO.9:5'-AATAACACCCCCACCCTGC-3'),然后根据表3所示的反应程序进行PCR扩增,最后将扩增产物送公司进行Sanger测序。
表2SYBR Green PCR反应体系
表3SYBR Green PCR反应程序
5.结果分析
分析测序峰图、以焦磷酸测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地,一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种:即甲基化和未甲基化,其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化,如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T,则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95%以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的,则认为该样本在这一区域是甲基化的。
根据上述标准将扩增产物的测序结果同病理结果进行比对,根据扩增产物的CpG位点的甲基化状态计算此目标区域的灵敏度和特异性。灵敏度=病理结果为阳性的样本检出甲基化阳性的比例;特异性=病理结果为阴性的样本检出甲基化阴性的比例。
使用甲基化引物对SEQ ID NO.4~5和非甲基化引物对SEQ ID NO.6~7通过检测靶基因GDAP1L1(Chr20:44246939-44247339正链)的甲基化水平,对前列腺癌组织样本和癌旁正常组织样本进行诊断。对于58例前列腺癌组织样本,有52例甲基化阳性样本,即其检测灵敏度为89.7%;对于58例癌旁正常组织样本,有50例甲基化阴性样本,即其检测特异性为86.2%。以上结果表明,以Chr20:44246939-44247339正链作为目标区域,通过检测上述区域的甲基化水平能够有效区分前列腺癌组织样本和癌旁正常组织样本,因此Chr20:44246939-44247339正链可以进行下一步验证。
利用焦磷酸测序方法在58例前列腺癌尿液样本和58例健康受试者尿液样本对上述筛选得到的差异甲基化位点进行评估。对于58例前列腺癌尿液样本,有49例甲基化阳性样本,即其检测灵敏度为84.5%;对于58例健康受试者尿液样本,有54例甲基化阴性样本,即其检测特异性为93.1%。以上结果表明,通过检测尿液样本中Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平能够实现无创诊断前列腺癌患者和健康受试者。
实施例2基于qMSP法分析Chr20:44246939-44247339正链检测前列腺癌尿液样本的性能
1.样本收集
收集28例经病理检测确诊的前列腺癌患者尿液样本,83例进行常规体检的健康受试者的尿液样本。所有收集到的每份尿液样本的体积大于10mL。所有尿液样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有尿液样本均采用匿名化处理。
2.提取尿液样本DNA、亚硫酸氢盐转化同实施例1。
3.甲基化特异性荧光定量PCR检测(qMSP)
以Chr20:44246939-44247339正链经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为模板,设计用于甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)的引物对和检测探针,要求该引物对具有良好的扩增特异性,即该引物对仅扩增发生甲基化的DNA模板,而不扩增未发生甲基化的DNA模板,同时其也不会引起其它非特异性扩增;另外,要求该引物对具有良好的扩增效率,即其对各个目标区域的扩增效率在90%~110%之间。满足上述要求的引物对和检测探针的核苷酸序列如表4所示。表4中所用到的检测探针均为TaqMan探针,该探针5'端为荧光基团,如FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3、CY5等,其3'端为荧光淬灭基团,如TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3等。基于TaqMan探针的qPCR反应可以实现在一个反应体系中同时检测多个目标基因,此时,只需每个目标基因特异性的检测探针5'端所携带的荧光基团不同即可。
本实施例中,每个qPCR反应体系需检测2个目标基因,分别为目标区域(Chr20:44246939-44247339正链)和内参基因ACTB,目标区域的检测探针序列(SEQ ID NO.10:AATCCCGAAAACTCCTTTC),其探针5'端荧光基团为ROX,其3'端为非荧光淬灭基团MGB;ACTB的检测探针序列(SEQ ID NO.11:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG),其探针5'端荧光基团为FAM,其3'端为非荧光淬灭基团MGB。将上述引物探针组合人工合成备用。
表4 qMSP法所用的引物探针组合
甲基化引物对(5'-3') | 检测探针(5'-3') | |
Chr20:44246939-44247339正链 | SEQ ID NO.4~5 | SEQ ID NO.10 |
内参基因ACTB | SEQ ID NO.8~9 | SEQ ID NO.11 |
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的体液样本DNA作为模板,分别使用表4中提供的引物探针组合进行qMSP反应,qMSP的扩增体系如表5所示,扩增程序如表6所示。在对每个样本进行qPCR反应时,均需要检测内参基因ACTB的量,用以监测样本质量及结果判读。在每块PCR反应板内,除设置实验孔用以检测待测样本以外,还需要同时设置阳性对照孔和阴性对照孔。阳性对照孔的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含完全甲基化且亚硫酸氢盐转化后目标区域DNA序列的质粒混合物(等体积混合),其它成分与实验管相同;阴性对照孔的模板为TE缓冲液,其它成分也与实验管相同。
表5 PCR反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
dNTPs | 各2.5mM | 3 |
Chr20:44246939-44247339正链的甲基化上游引物 | 10μM | 0.5 |
Chr20:44246939-44247339正链的甲基化下游引物 | 10μM | 0.5 |
Chr20:44246939-44247339正链的检测探针 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因的上游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因的下游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因的检测探针 | 10μM | 0.5 |
DNA聚合酶 | / | 0.5 |
待测样本DNA | / | 5 |
纯化水 | / | 补至25 |
表6 PCR程序
qPCR反应结束后,调整基线(一般将第3~15个循环所对应的信号值设置为基线水平),并设置阈值,阈值必须位于指数扩增期内,穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果,要求①阴性对照管无扩增;②阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管的目标基因的Ct值在26~30之间;③待测样本的内参基因ACTB的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当次实验无效,必须重新进行检测。
4.结果判读
尿液样本的阳性判断值为45,若使用甲基化检测引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤45,则该样本在此扩增区域为甲基化阳性,为前列腺癌阳性样本;若使用甲基化检测引物对和探针进行扩增的Ct值>45,则该样本在此扩增区域为甲基化阴性,为前列腺癌阴性样本。检测结果见表7。
表7检测Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平诊断前列腺癌尿液样本的性能
由表7可以看出,通过检测尿液样本中Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平诊断前列腺癌的准确度高,能够有效区分前列腺癌患者和对照组样本,其检测前列腺癌尿液样本的灵敏度为82.1%,检测健康受试者尿液样本的特异性为92.8%,能够有效避免假阳性样本和假阴性样本的检出。
实施例3前列腺癌甲基化标志物(Chr20:44246939-44247339正链)检测前列腺癌尿液样本的性能验证
1.独立验证集样本收集
共收集82例经病理检测确诊的前列腺癌患者的尿液样本、248例进行常规体检的健康受试者的尿液样本和43例泌尿系统良性疾病(包括前列腺增生、泌尿道感染、腺性膀胱炎、肾结石、肾积水等)受试者的尿液样本。每份尿液样本的体积大于10mL。所有尿液样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有尿液样本均采用匿名化处理。本实施通过检测受试者体液样本中前列腺癌甲基化标志物的甲基化水平来诊断前列腺癌患者,检测过程中对采集的样本经过编盲后,再由试验操作者进行试验,结果判读者根据判读标准,将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对,考察前列腺癌甲基化标志物的临床有效性。
2.尿液样本DNA的提取、亚硫酸氢盐转化同实施例1,qMSP检测、Ct值读取和质量控制同实施例2。
3.结果分析
获取使用甲基化检测引物对(SEQ ID NO.4~5)和检测探针(SEQ ID NO.10)检测验证集样本中目标区域的Ct值,若检测某一样本的Ct值≤45,则该样本为甲前列腺癌阳性样本;若检测某一样本的Ct值>45,则该样本前列腺癌阴性样本。基于上述标准,通过检测尿液样本中Chr20:44246939-44247339正链的甲基化水平诊断前列腺癌的性能如表8、表9所示。
表8前列腺癌甲基化标志物检测验证集尿液样本的性能验证
表9前列腺癌甲基化标志物检测验证集尿液样本的特异性
由表8、表9可以看出,在373例独立验证集中,以Chr20:44246939-44247339正链作为前列腺癌甲基化标志物诊断前列腺癌尿液样本的性能优异,检测前列腺癌的灵敏度为84.1%,检测泌尿系统良性疾病尿液样本的特异性为93%,检测健康受试者尿液样本的特异性为93.5%,展示出优异的诊断性能。
综上,本申请提供了能够用于检测前列腺癌的甲基化标志物,还提供了无创、高灵敏度、高特异性检测前列腺癌的引物对、引物探针组合和检测试剂盒。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本申请的较佳实施例,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测前列腺癌的引物对,其特征在于,所述引物对为用于检测样本中前列腺癌甲基化标志物的甲基化水平的引物对;所述前列腺癌甲基化标志物选自GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域。
2.根据权利要求1所述的引物对,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述GDAP1L1基因CpG岛上的靶区域选自Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域。
3.根据权利要求1或2所述的引物对,其特征在于,所述引物对包括用于检测Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对;
所述甲基化引物对为SEQ ID NO.4~5所示的甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对,其特征在于,所述引物对还包括用于检测Chr20:44246939-44247339正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对;
所述非甲基化引物对为SEQ ID NO.6~7所示的非甲基化引物对。
5.用于检测前列腺癌的引物探针组合,其特征在于,所述引物探针组合包括权利要求1至3任一项所述的引物对,还包括检测探针;
所述引物探针组合包括SEQ ID NO.4~5所示的甲基化引物对和SEQ ID NO.10所示的检测探针。
6.用于检测前列腺癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,3'端包含有荧光淬灭基团。
9.权利要求1至4任一项所述的引物对或权利要求5所述的引物探针组合或权利要求6至8任一项所述的试剂盒在制备前列腺癌诊断产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述前列腺癌诊断产品包括甲基化检测试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
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