CN113215260A - 一种gstp1，apc和rassf1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备前列腺癌标志物，尤其涉及一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1‑F，GSTP1‑R,及荧光水解探针GSTP1‑P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1‑F，GSTP1‑R,及荧光水解探针GSTP1‑P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1‑F，RASSF1‑R,及荧光水解探针RASSF1‑P；检测ACTB基因的引物ACTB‑F，ACTB‑R,及荧光水解探针ACTB‑P。取样方便、检测快速、准确率高，可以实现前列腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂盒，以及提供GSTP1，APC和RASSF1联合使用作为前列腺癌分子标记物的应用。

Description

一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及 其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种制备前列腺癌标志物，尤其涉及一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。

背景技术

前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，占全球肿瘤发病率第二位、死亡率第六位。我国PCa的发病率平均每年增长4.7％，是增加最快的男性恶性肿瘤。上海市疾病控制中心的资料显示，前列腺癌的发病率自2002年起已跃居男性泌尿生殖系恶性肿瘤的首位。

前列腺癌的诊断在世界范围内还存在重大挑战：在美国，Gilbert对36316例前列腺穿刺病例进行统计发现，穿刺阳性率仅为31％，在中国，一项1244例穿刺病理的统计结果显示，中国人群的穿刺阳性率仅为32％。根据中国前列腺癌联盟公布的全国33家三甲医院年穿刺量的数据进行估算，全国范围内仅三甲医院每年有35万例穿刺，而其中约有25万例患者穿刺结果为阴性，在这25万人中又约有1/3的患者，经二次穿刺、甚至多次穿刺最终确诊为前列腺癌。首次穿刺活检阴性的患者如何处理常常困扰泌尿外科医师，一方面，由于现行的诊断指标的特异性较差，比如PSA，导致大量非前列腺癌患者接受了非必要的穿刺；另一方面，由于前列腺肿瘤具有多中心发生的特点，而前列腺穿刺活检获得的标本量较少，取到组织体积不足腺体1％，导致了漏诊的可能性较大。在何种情况下进行再穿刺，在何种情况下无需再次穿刺仍然很难界定。目前临床上亟需安全、有效的检测手段来解决如下问题：在首次穿刺阴性的病人中，有效排除非前列腺癌患者，同时筛选出由于首次穿刺取样差异造成的假阴性患者，进一步提升前列腺癌的诊疗效率。

与正常细胞相比，癌细胞特定基因区域的高甲基化现象已得到了充分研究与证实，而近几年研究表明，癌细胞/组织可诱导周边细胞/组织特定位点基因启动子区甲基化，这些前期的表观遗传改变，不能通过组织学辨别，但是可以通过甲基化检测识别出来,该现象被称为“Field effect”。通过MS-PCR可检测相关基因启动子区甲基化修饰。

发明内容

本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种取样方便、检测快速、准确率高，可以实现前列腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂盒，以及提供GSTP1，APC和RASSF1联合使用作为前列腺癌分子标记物的应用的一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1-F，RASSF1-R,及荧光水解探针RASSF1-P；检测ACTB基因的引物ACTB-F，ACTB-R,及荧光水解探针ACTB-P。

试剂盒的制备方法，按以下步骤进行：

通过前列腺癌细胞系LNCaP的细胞DNA提取物的亚硫酸盐转化，使未甲基化区域的所有胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而CpG岛屿区域的胞嘧啶仍保持胞嘧啶不变，通过荧光PCR的方法检测靶区域的甲基化状态，以未含甲基化修饰序列的ACTB基因作为内参，可检测系列梯度稀释的LNCaP中GSTP1,APC,RASSF1三个基因的标准甲基化水平，该检测方法具有良好的线性关系。

试剂盒的应用方法，按以下步骤进行：

在FFPE样本中甲基化位点的检测靶标，靶标包括GSTP1，APC、RASSF1、ACTB，及联合以上靶标检测前列腺癌的诊断试剂盒；

其组分包括：引物探针混合试剂、PCR试剂、阳性质控品、阴性质控品；该方法灵敏度高、特异性好，仅需收集首次穿刺剩余FFPE样本，经过DNA提取，亚硫酸盐转化，PCR上机三个步骤，即可在同管样本中完成四个靶点的检测，根据检测结果，代入回归公式，即可得出前列腺癌风险系数，当风险系数p大于0.56时，表明受检者患前列腺癌风险较高，需进行二次穿刺以对前列腺癌进行确诊；当检测的风险系数p小于0.56时，表明受检者患前列腺癌风险较低，可进行定期的PSA检查或其他常规诊断方法监测即可。

本发明的目的之一在于提供GSTP1，APC和RASSF1在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的三种靶标联合应用，通过GSTP1，APC和RASSF1联合检测，并建立回归模型，作为前列腺癌诊断指标，提高诊断和预示前列腺癌的检测性能；

本发明的目的之二在于提供FFPE样本中GSTP1，APC和RASSF1甲基化水平的联合检测试剂盒应用于前列腺癌的诊断，该试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，该基因用于控制每个样本的质量，同时可以对靶点的甲基化水平进行标准化，以避免取样差异对检测结果的影响。该试剂盒使用多重qRT-PCR技术，在单管中完成四个基因的检测。此外还制定了阳性质控品及阴性质控品，以控制试剂盒整个检测过程。阳性质控品为LNCaP细胞甲基化后的纯化产物，阴性质控品为超纯水。

本发明的目的是提供一种基于FFPE样本中GSTP1，APC和RASSF1甲基化水平在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的联合应用，该方法使用Taqman荧光RT-PCR法，在单管中实现对GSTP1，APC、RASSF1及内参ACTB的检测，通过回归拟合，获得前列腺癌发生概率的计算公式。

附图说明

图1 GSTP1基因甲基化测序结果；

图2 APC基因甲基化测序结果；

图3 RASSF1基因甲基化测序结果；

图4甲基化基因检测标准曲线绘制；

图5块状FFPE样本标准化甲基化水平检测结果；

图6前列腺穿刺FFPE切片样本标准化甲基化水平检测结果；

图7前列腺穿刺FFPE切片样本甲基化模型检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例1：如图所示，实施例1，用于前列腺癌诊断的甲基化位点，包括表1所列核酸序列中由[CG]指示的甲基化位点的以及与表1中的由[CG]指示的核酸在序列上完全互补的核酸甲基化位点。

表1 DNA甲基化标志物的组成

实施例2：

引物探针序列：

本发明提供一种基于FFPE样本的四个基因检测前列腺癌的联合应用，该应用针对四个基因启动子区CpG岛上的甲基化位点进行设计，本试剂盒的引物对组合在引物序列设计上克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，每个基因通过F引物及R引物对样本中高甲基化区域序列进行扩增，通过水解探针P对扩增结果进行实时荧光显示，以区分相应基因位点是否存在高甲基化现象。所述F引物、R引物、P探针的序列如下：

GSTP1-F,以下序列任意一种：SEQ ID NO.4-10

5’-TCGGGGTGTAGCGGTC-3’

5’-AGTTGCGCGGCGATTTC-3’

5’-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3’

5’-AGAGGGAAAGGTTTTTTCGGTT-3’

5’-TAGTTGCGCGGCGATTTC-3’

5’-CGACGTTCGGGGTGTAGC-3’

5’-GTCGTCGGGGTTGGGGTC-3’

GSTP1-R,以下序列任意一种：SEQ ID NO.11-16

5’-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’

5’-GCCCCAATACTAAATCACGAC-3’

5’-GCGAACTCCCGCCGA-3’

5’-CCCCAACCCCGACGACC-3’

5’-CGCCCCAATACTAAATCACG-3’

5’-AAAACCTCGCGACCTCCG-3’

GSTP1-P,以下序列任意一种：SEQ ID NO.17-19

5’-VIC-CGAACTCCCGCCGACC-MGB-3’

5’-VIC-GGATTTTTTAGAAG-MGB-3’

5’-VIC-CGGAGGTCGCGAGGTTT-MGB-3’

APC-F,以下序列任意一种：SEQ ID NO.20-24

5’-TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT-3’

5’-TATTGCGGAGTGCGGGTC-3’

5’-AGGTTGTGCGGTTGGGC-3’

5’-AGTGCGGGTCGGGAAGC-3’

5’-GTAGGTTGTGCGGTTGGGC-3’

APC-R,以下序列任意一种：SEQ ID NO.25-28

5’-GAACCAAAACGCTCCCCAT-3’

5’-TCGACGAACTCCCGACGA-3’

5’-GCCCTAATCCGCATCCAACG-3’

5’-CCACATATCGATCACGTACGCC-3’

APC-P,以下序列任意一种：SEQ ID NO.29-31

5’-FAM-CGGGAGTTCGTCGATTGGTT-MGB-3’

5’-FAM-AGTAGTTGTGTAATTCGT-MGB-3’

5’-FAM-TATTTTCGTCGGGAGTTC-MGB-3’

RASSF1-F,以下序列任意一种：SEQ ID NO.32-38

5’-GCGTTGAAGTCGGGGTTCG-3’

5’-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3’

5’-TGTTAACGCGTTGCGTATCG-3’

5’-TTCGTTCGGTTCGCGTTTG-3’

5’-AGTACGGGTTTAATCGGGTTATGTC-3’

5’-GGGAGTTGGTATTCGTTGGGC-3’

5’-TTAACGCGTTGCGTATCG-3’

RASSF1-R,以下序列任意一种：SEQ ID NO.39-45

5’-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG-3’

5’-GCTAACAAACGCGAACCG-3’

5’-AACCCCGCGAACTAAAA-3’

5’-AACGAATACCAACTCCCGCAA-3’

5’-AACACGCTCCAACCGAATACG-3’

5’-GCGAACTAAAAACGATAACCACGAC-3’

5’-AACCCCGCGAACTAAAAACG-3’

RASSF1-P,以下序列任意一种：SEQ ID NO.46-48

5’-ROX–ACTACCGTATAAAATTACACGCGATACCCC-BHQ2-3’

5’-ROX–TGGATTTTGGGGGAGGCGTTG-BHQ2-3’

5’-ROX–GAGTTGCGGGAGTTGGTAT-MGB-3’

ACTB-F,以下序列任意一种：SEQ ID NO.49-52

5’-TGATTTAGTTGTGTTATATTTTT-3’

5’-GATAAAATTTAATTTGTGTAGA-3’

5’-AGATGAGATTGGTATG-3’

5’-GTGGATTATGATTTAGTTGTGTTATATT-3’

ACTB-R,以下序列任意一种：SEQ ID NO.53-55

5’-AACTACTATCACCTTCACCA-3’

5’-AAATAAAACCATACCAATCTCATCT-3’

5’-CATTTACCATTTAAAAATTC-3’

ACTB-P,以下序列任意一种：SEQ ID NO.56-57

5’-CY5–TTTAATTTGTGTAGAAAAT-MGB-3’

5’-CY5–AAAATAAGATGAGATTT-MGB-3’

实施例3：

试剂盒的组成：

本实施例的前列腺癌甲基化联合检测试剂盒，包括用于用于配制PCR体系的引物探针混合试剂及PCR试剂，用于质控检测过程的阳性质控品和阴性质控品。

1、引物探针混合试剂：

组分构成如下：

0.5μM GSTP1-F、0.5μM GSTP1-R、0.5μM GSTP1-P、0.5μM APC-F、0.5μM APC-R、0.5μM APC-P、1.0μM RASSF1-F、1.0μM RASSF1-R、1.0μM RASSF1-P、0.25μM ACTB-F、0.25μMACTB-R、0.25μM ACTB-P。

2、PCR试剂：

即为2×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶(5U)、150mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、100mmol/L MgCl2、350mmol/L KCl、2.5mmol/L DTT、5mM dNTP each。

3、阳性质控品：200ng/μL前列腺癌阳性细胞LNCaP基因组DNA，经亚硫酸盐转化及纯化回收，即得到阳性质控品。

4、阴性质控品：为分装的超纯水。

实施例4：

细胞样本甲基化检测

1、细胞回收：前列腺癌细胞系LNCaP及前列腺增生组织细胞系BPH-1分别进行培养至5×10⁶cells/瓶，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。低速离心15min，小心倒去上清。

2、细胞DNA提取：在沉淀细胞中加入5％SDS溶液及蛋白酶K，56摄氏度下孵育1小时。

使用柱提法，对裂解后的DNA进行纯化及回收。柱提法步骤如下：使用等比体积异丙醇沉淀DNA，再加入硅胶柱中高速离心去除余液；使用75％乙醇洗涤柱体，开盖干燥3min后，加入50-100微升超纯水，高速离心回收纯化后的DNA即可。

3、亚硫酸盐转化：

按表2配方进行转化体系配制，将配置好的转化体系混匀后放到可加热设备上转化，转化程序如表3，转化后的DNA使用柱提法，进行DNA纯化及回收。

表2 亚硫酸盐转化体系

待转化DNA(200ng～4μg)	40μL
		5M亚硫酸氢钠	200μL
总体积	240μL

表3 转化程序

95℃	10min
		64℃	60min
95℃	10min
		64℃	60min

4、荧光PCR上机检测：

按表4所示配方进行荧光PCR扩增：

表4 荧光PCR体系

组分	体积
		转化后DNA	10μL
引物探针混合试剂	5μL
		PCR试剂	15μL

配制完成后，使用表5所示程序，进行PCR检测：

表5 荧光PCR程序

4、Sanger测序的结果表明，LNCaP细胞系的GSTP1，APC,RASSF1基因在SEQ IDNO.1-3的区域均呈现100％甲基化。而BPH-1细胞系的GSTP1，APC,RASSF1基因在SEQ IDNO.1-3的区域均未发现明显甲基化，如图1-3所示。该结果与荧光PCR检测结果一致，如表6所示，LNCaP细胞系检测Ct值均在12左右，表明该细胞系甲基化水平极高，BPH-1细胞系检测Ct值均在34之后或未检出，表明该细胞系甲基化水平极低。

表6 细胞系甲基化荧光PCR检测结果

实施例5：

一种用于前列腺癌诊断的3个甲基化生物标记物及1个内参的甲基化荧光PCR测试试剂盒，包括4组PCR扩增引物及探针组合中的任意一组，其中，每组PCR扩增引物及探针组合包括4对PCR扩增引物及4条探针，所述4组PCR扩增引物及探针如表2所示。

表7 4组PCR扩增引物及探针组合

所述试剂盒需包括PCR扩增引物及探针组合4组组合中的其中一组，4组组合对于3个甲基化基因及1个内参基因的检测性能类似，均能较好的实现单管中同时检测4个基因。以其中一个组合检测为例，使用系列稀释的LNCaP细胞DNA提取物作为甲基化检测标准品进行检测，检测过程如实施例4所述。检测结果如图4所示，3个甲基化基因及内参相对于所述试剂盒的检测线性关系分别为0.9995、0.9996、0.9996、0.9994，拟合线性方程斜率均在3.8-3.9左右，表明扩增效率良好，具有较好的检测性能。

实施例6：

FPEE样本前列腺癌甲基化水平检测：

1、取10份临床确诊前列腺癌块状FFPE样本，及10份临床确诊为非前列腺癌块状FFPE样本，每份样本用手术刀刮取约30mg的石蜡块组织样本，切碎后使用，应尽量保证组织得到充分切碎。若为切片组织，应取切片6-12片。

2、脱蜡：取石蜡包埋组织的样本至1.5mL离心管中，加入1mL二甲苯(或二甲苯替代品)，振荡混匀10s，室温13000rpm离心5min，小心去除上清；加入1mL无水乙醇，振荡混匀10s，室温13000rpm离心5min，小心去除上清，室温下静置5min使乙醇挥发。

3、加入180μL 5％SDS溶液及20μL蛋白酶K(10mg/mL),振荡混匀后56℃消化2h。

4、使用柱提法，对裂解后的DNA进行纯化及回收。柱提法步骤如下：使用等比体积异丙醇沉淀DNA，再加入硅胶柱中高速离心去除余液；使用75％乙醇洗涤柱体，开盖干燥3min后，加入50-100微升超纯水，高速离心回收纯化后的DNA即可。

5、亚硫酸盐转化：按表2配方进行转化体系配制，将配置好的转化体系混匀后放到可加热设备上转化，转化程序如表3，转化后的DNA使用柱提法，进行DNA纯化及回收。

6、荧光PCR上机检测：按表4所示配方进行荧光PCR扩增，配制完成后，使用表5所示程序，进行PCR检测，同时使用系列稀释的LNCaP细胞DNA提取物作为甲基化检测标准品绘制标准曲线，根据样本荧光PCR检测得到的Ct值，得出含甲基化序列细胞的拷贝数，根据定量结果，换算为各基因的标准化甲基化水平，换算方式见公式1-3，结果分析见图5。

公式1：GSTP1标准化甲基化水平＝含GSTP1甲基化序列拷贝数/含ACTB序列拷贝数

公式2：APC标准化甲基化水平＝含APC甲基化序列拷贝数/含ACTB序列拷贝数

公式3：RASSF1标准化甲基化水平＝含RASSF1甲基化序列拷贝数/含ACTB序列拷贝数

实施例7：

临床样本实验：

对128例首次穿刺为阴性的前列腺癌FFPE穿刺剩余样本(其中二次穿刺确诊为前列腺癌的样本45例，正常人群样本83例)的3个甲基化基因及一个内参基因按实施例6的检测方法进行检测，根据3个甲基化基因在两组人群中的各自标准甲基化水平对比样本病理作出ROC曲线，根据曲线计算AUC，划分判定阈值及计算该阈值下的灵敏度及特异性。同时，根据3个甲基化基因的标准甲基化水平进行逻辑回归拟合，根据拟合方程计算每个样本的前列腺癌风险得分及判断前列腺癌发生的阈值，根据样本的得分与阈值相比较，将样本划分为前列腺癌阳性组及阴性组。将基于甲基化程度模型的分组与样本临床病理进行比较，得到用于判别甲基化程度模型诊断性能的ROC曲线，并根据ROC曲线得到AUC、灵敏度及特异性。

图6显示对于二次穿刺确诊前列腺癌人群及二次穿刺诊断为非前列腺癌人群的前列腺穿刺FFPE样本中，3个基因甲基化水平均有一定程度的区分。图7显示3个甲基化基因组合模型可以良好地区分前列腺癌人群与非前列腺癌人群。比较单个基因检测模型与3个甲基化基因组合模型对于诊断前列腺癌发生的性能比较如表8所示，3个甲基化基因的组合在判别前列腺癌的发生上与单个甲基化基因的判别相比较，灵敏度及特异性均有较大的提高，性能优于单个甲基化基因的判别。

表8 单个基因检测与组合模型的检测性能比较

检测基因	AUC	灵敏度	特异性
				GSTP1	0.73	73％	79％
APC	0.67	80％	46％
				RASSF1	0.65	79％	49％
GSTP1+APC+RASSF1	0.81	82％	78％

Claims (3)

1.一种GSTP1，APC和RASSF1在制备前列腺癌标志物中的试剂盒，其特征在于：试剂盒除三个甲基化检测基因靶点外，还包含一个内参基因ACTB，包括检测GSTP1基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测APC基因甲基化位点的特异性引物GSTP1-F，GSTP1-R,及荧光水解探针GSTP1-P；检测RASSF1基因甲基化位点的特异性引物RASSF1-F，RASSF1-R,及荧光水解探针RASSF1-P；检测ACTB基因的引物ACTB-F，ACTB-R,及荧光水解探针ACTB-P。

2.基于权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

通过前列腺癌细胞系LNCaP的细胞DNA提取物的亚硫酸盐转化，使未甲基化区域的所有胞嘧啶转化为胸腺嘧啶，而CpG岛屿区域的胞嘧啶仍保持胞嘧啶不变，通过荧光PCR的方法检测靶区域的甲基化状态，以未含甲基化修饰序列的ACTB基因作为内参，可检测系列梯度稀释的LNCaP中GSTP1,APC,RASSF1三个基因的标准甲基化水平，该检测方法具有良好的线性关系。

3.基于权利要求1所述的试剂盒的应用方法，其特征在于按以下步骤进行：

在FFPE样本中甲基化位点的检测靶标，靶标包括GSTP1，APC、RASSF1、ACTB，及联合以上靶标检测前列腺癌的诊断试剂盒；

其组分包括：引物探针混合试剂、PCR试剂、阳性质控品、阴性质控品；该方法灵敏度高、特异性好，仅需收集首次穿刺剩余FFPE样本，经过DNA提取，亚硫酸盐转化，PCR上机三个步骤，即可在同管样本中完成四个靶点的检测，根据检测结果，代入回归公式，即可得出前列腺癌风险系数，当风险系数p大于0.56时，表明受检者患前列腺癌风险较高，需进行二次穿刺以对前列腺癌进行确诊；当检测的风险系数p小于0.56时，表明受检者患前列腺癌风险较低，可进行定期的PSA检查或其他常规诊断方法监测即可。

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